BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
o0o ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ĐÁP ỨNG
PHÁT SINH HÌNH THÁI CỦA LÁT MỎNG TẾ BÀO
PHÁT HOA ĐỒNG TIỀN (Gerbera jamesonii)
TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO
Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
Mã ngành : 111 GVHD: CN. BÙI VĂN THẾ VINH
SVTH : ĐẶNG LÂM TRÚC
MSSV : 105111070

ĐẠI HỌC KTCN TPHCM
CỘNG HOÀ XÃ
H
ỘI CH
Ủ
NGHĨA VIỆT NAM
ĐỘC LẬP - TỰ DO – HẠNH PHÚC

KHOA : MÔI TR
Ư
ỜNG & CNS
H
BỘ MÔN : CNSH
NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

HỌ
V
À TÊN : ĐẶNG LÂM TRÚC MSS
V
: 105111070
NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC LỚP : 05DSH
PHẦN DÀNH CHO KHOA, BỘ MÔN
Người duyệt (chấm sơ bộ): ………………………
Đơn vị:……………………………………………
Ngày bảo vệ:……………………………………
Điểm tổng kết:……………………………………
Nơi lưu trữ Đồ án tốt nghiệp:

Lời cảm ơn
Cuối cùng tôi cũng được đặt chân vào trường Đại học, đó không chỉ là mong ước

Đặng Lâm Trúc
MỤC LỤC

Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục chữ viết tắt i
Danh mục bảng ii
Danh mục hình iii

Phần 1: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục đích, nội dung nghiên cứu 1
1.2.1. Mục đích 1
1.2.2. .Nội dung 1

Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Khái quát về kỹ thuật vi nhân giống 2
2.1.1. Khái niệm 2
2.1.2. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô 2
2.1.3. Các bước nhân giống in vitro 2
2.1.4. Quá trình tái sinh cơ quan trong vi nhân giống in vitro 6
2.1.4.1. Sự hình thành chồi bất định 7
2.1.4.2. Sự hình thành rễ bất định 9
2.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái in vitro 11
2.1.5.1. Ảnh hưởng của mẫu cấy 11
2.1.5.2. Ảnh hưởng của ch
ất điều hòa sinh trưởng và phát triển của thực vật 14
2.1.6. Các chất khử trùng hóa học được dùng trong nuôi cấy mô 15
2.2. Kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào 17
2.2.1. Giới thiệu 17

4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của BA lên sự phát sinh hình thái của
mẫu cấy tTCL phát hoa Đồng tiền 38
4.3. Thí nghiệm 3: Môi trường khảo sát ảnh hưởng của NAA lên sự phát sinh
hình thái của mẫu cấy tTCL phát hoa Đồng tiền 41
4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp với NAA lên khả năng
tái sinh chồi 44

Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận 48
5.2. Đề Nghị 48

Phần 6 : TÀI LIỆU THAM KHẢO
6.1. Tài liệu tham khảo trong nước a
6.2. Tài liệu tham khảo nước ngoài a e Danh mục chữ viết tắt f
GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh e i f # Đặng Lâm Trúc
Khoa Môi trường & CNSH Danh mục chữ viết tắt

¾ MS : MS medium (Murashige và Skoog, 1962)
¾ TCL : Thin cell layer
¾ tTCL : Transverse thin cell layer
¾ lTCL : Long thin cell layer
¾ ELS : Embro-like structure
¾ NAA : Naphthalene acetic acid
¾ BA : 6-benzylladenine acid

Hình 2.2. Cây hoa Đồng tiền (Gerbera jamesonii)
Hình 2.3. Một số loài hoa Đồng tiền trên thế giới.
Hình 2.4. Cụm hoa đầu (B - C) và hoa Đồng tiền.
Hình 4.1. Ảnh hưởng chất điều hòa tăng trưởng lên sự phát sinh hình thái tTCL phát
hoa Đồng tiền (Gerbera jamesonii)
GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh e iii f # Đặng Lâm Trúc
Khoa MT & CNSH 05DSH

e Phần 1 – Mở đầu f
GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc
Khoa Môi trường & CNSH Phaàn 1: MÔÛ ÑAÀU
e Phần 1 – Mở đầu f

1.2.1. Mục đích
Bước đầu thực hiện nghiên cứu khả năng đáp ứng phát sinh hình thái của lát
mỏng tế bào phát hoa Đồng tiền (Gerbera jamesonii) trong điều ki
ện in vitro .
1.2.2. Nội dung
Nghiên cứu khử trùng mẫu cấy để xác định nồng độ hóa chất, thời gian khử
trùng tối ưu.
Nghiên cứu các nồng độ của chất điều hòa sinh trưởng ảnh hưởng lên mẫu
cấy.
e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f
GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc
Khoa Môi trường & CNSH Phaàn 2: TOÅNG QUAN TAØI
LIEÄU e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f

GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc
Khoa Môi trường & CNSH

- 2 -
2.1. Khái quát về kỹ thuật vi nhân giống
2.1.1. Khái niệm
Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô đều là thuật ngữ mô tả các phương thức
nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều
kiện vô trùng. Môi trường có chứa các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng,
vitamin, các hormone tăng trưởng và đường (Dương Công Kiên, 2002).

Khoa Môi trường & CNSH

- 3 -
Kết quả nhân giống tốt nhất có thể đạt được khi mẫu cấy được lấy vào thời
điểm tăng trưởng mạnh nhất của cây mẹ.
Mục tiêu của việc khử trùng mẫu cấy là thu được một lượng lớn các mẫu cấy
vô trùng và vẫn còn khả năng tăng trưởng. Khử trùng bề mặt mẫu cấy bao gồm rửa
mẫu và khử trùng mẫu cấ
y.
Mẫu thu được phải rửa dưới vòi nước chảy từ 30 phút – 2 giờ, sau đó rửa mẫu
bằng xà phòng sẽ làm giảm đáng kể nguồn lây nhiễm trên mẫu cấy.
Mẫu sau khi rửa sạch sẽ được ngâm chìm trong dung dịch khử trùng để khử
các nguồn lây nhiễm trên bề mặt mẫu cấy. Dung dịch thường được sử dụng để khử
trùng mẫu là hypochlorite sodium 0,5 – 5,25%, cồn, hypochlorite calcium, oxy già,
nitrate bạc, dung dịch bromine, chlorur th
ủy ngân. Khi thêm Tween 20
(polyoxyethylene sorbitan monolaurate) vào dung dịch khử trùng thì sẽ làm tăng hiệu
quả khử trùng vì làm giảm sức căng bề mặt giữa nước và mô thực vật như vậy bề
mặt mẫu tiếp xúc với chất khử trùng tốt hơn.
Sau khi khử trùng mẫu cấy phải được rửa lại vài lần bằng nước cất vô trùng
trong tủ cấy để rửa sạch các chất khử trùng còn bám trên bề mặt m
ẫu, những phần bị
tổn thương phải được cắt bỏ, đồng thời mẫu cấy phải được cắt theo kích thước thích
hợp.
Mẫu thực vật thường bị nhiễm bên trong và có thể được khử trùng bằng cách
bổ sung benomyl hoặc benlate 10mg/l trong môi trường nuôi cấy hoặc xử lý mẫu
bằng các chất này trước khi khử trùng.
Mẫu cấy của vài loài thực vật có thể hóa nâu hoặc đ
en sau vài ngày kể từ khi
bắt đầu nuôi cấy. Khi bị hóa nâu thì sự tăng sinh của mẫu sẽ bị ức chế và lâu ngày

thấp, không có ánh sáng
trong 1 – 2 tuần đầu.
Chuyển mẫu từ môi trường có chất kích thích sinh trưởng nồng độ thấp sang
môi trường có chất kích thích sinh trưởng nồng độ cao.
Chuyển mẫu liên tục trong khoảng thời gian 2 – 4 tuần kể từ khi bắt đầu nuôi
cấy thì một lượng lớn các hợp chất phenol sẽ không tích tụ.
Tạo thể nhân giống in vitro
Mẫu nuôi cấy được cấy trên môi trường chọn lọc đặ
c biệt nhằm mục đích tạo
thể nhân giống in vitro. Có hai thể nhân giống in vitro: thể chồi, thể cắt đốt.
Tạo thể nhân giống in vitro dựa vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của
cây trồng. Tuy nhiên, có những loài cây trồng không có khả năng nhân giống, người
ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi từ mô sẹo.
Để nhân giống, trong môi trường nuôi cấy thường bổ sung cytokinin, GA
3
và
các chất hữu cơ khác. e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f

GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc
Khoa Môi trường & CNSH

- 5 -
¾ Nhân giống in vitro
Đây là giai đoạn quan trọng trong việc nhân giống cây trồng bằng phương
pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống. Vật
liệu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thông thường giống với môi
trường tạo thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá

e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f

GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc
Khoa Môi trường & CNSH

- 6 -
2.1.4. Quá trình tái sinh cơ quan trong vi nhân giống in vitro
Sự tái sinh cơ quan trong nuôi cấy mô không xảy ra ngay khi vừa cô lập mẫu
cấy mà phải trải qua một quá trình rất phức tạp vì:
¾ Quá trình tái sinh chỉ xảy ra khi mối tương quan cũ được phá vỡ và những
mối tương quan mới được hình thành.
¾ Quá trình này bao gồm nhiều giai đoạn khác nhau:
9 Loại bỏ sự phản biệt hóa của các tế bào phản biệt hóa (dẫn đến s
ự trẻ hóa
tế bào).
9 Sự phân chia tế bào (đôi khi dẫn đến sự hình thành mô sẹo): sự hình
thành cơ quan bắt đầu xảy ra khi sự phân chia tế bào diễn ra.
9 Sự hình thành cơ quan
9 Sự phát triển cơ quan
9 Sự tái sinh bị giới hạn về số lượng và chất lượng do nhiều nhân tố:
9 Các yếu tố nội sinh trong mẫu cấy
9 Điều ki
ện tăng trưởng của cây mẹ trong nhà kính hoặc ngoài thiên nhiên
9 Vị trí của mẫu cấy trên cây
9 Thời gian thu mẫu trong năm
9 Hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh
9 Kích thước của mẫu cấy, phương pháp cấy, nuôi, thành phần dưỡng chất
trong môi trường nuôi cấy, các chất điều hòa sinh trưởng, các yếu tố vật
lý trong quá trình nuôi cấy như nhiệt độ, ánh sáng…, sự
bổ sung một số

Có nhiều điểm giống nhau giữa tạo chồi bất định và tạo rễ bất định:
9 Sự hình thành chồi bất định ở cây hạt trần chỉ thành công khi sử dụng các bộ
phận của cây con (Anonymous, 1984).
9 Đường luôn luôn đóng vai trò quan trọng trong sự tạo cơ quan (ch
ồi và rễ).
9 Sự hình thành chồi và rễ đều bị ức chế bởi gibberellin và acid abscisic.
9 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo chồi bất định
¾ Ánh sáng
Ánh sáng kích thích sự tạo chồi nhưng cũng có một số trường hợp ngoại lệ là
có một số cây trồng lại có thể tạo chồi dễ dàng hơn khi ở trong tối: chồi hoa của
Freesia (Pierik và Steegmans, 1975), cu
ống hoa Eucharis grandiflora và Nerine
bowdenii (Pierik, 1985; Pierik và Steegmans, 1986). Economou và Read (1986)
cho biết rằng các mẫu cấy lá của Petunia hyrbida tăng trưởng trên môi trường không
có cytokinin và được xử lý với ánh sáng đỏ thì tạo ra nhiều chồi có trọng lượng tươi
lớn hơn là được nuôi cấy dưới ánh sáng đỏ xa. Tuy nhiên, trên môi trường có BA thì
khi xử lý với ánh sáng đỏ và ánh sáng đỏ xa thì sẽ tạo ra số lượng chồi và trọng
e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f

GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc
Khoa Môi trường & CNSH

- 8 -
lượng tươi của chúng tương tự nhau và nhiều hơn trên môi trường không có
cytokinin.
¾ Nhiệt độ
Nhiệt độ cao cần thiết cho sự tạo chồ nhưng cũng có một số trường hợp ngoại
lệ như Begonia (Heide, 1965) và Streptocarpus ( Appelgren và Heide, 1972).
¾ Chất điều hòa sinh trưởng thực vật
Nhu cầu về auxin và cytokinin trong sự tạo chồi bất định có phần phức tạp:


- 9 -
chế sự hình thành chồi bất định mặc dù vẫn có trường hợp cảm ứng sự hình thành
chồi như ở cây Ipomoea batatas.
2.1.4.2. Sự hình thành rễ bất định
Rễ bất định được hình thành trên các cơ quan khác nhau của cây, nơi mô của
chúng còn giữ khả năng phân sinh.
Quá trình hình thành rễ rất quan trọng vì nó ảnh hưởng đến khả năng sống sót
của mẫu cấy khi cây in vitro được chuyển ra vườ
n ươm.
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành rễ bất định: đặc điểm di truyền
của loài, tuổi của mẫu, vị trí của mẫu cấy trên thân, kích thước mẫu cấy, vết thương,
số lần cấy chuyển, nguồn oxy, ánh sáng, nhiệt độ, chất điều hòa sinh trưởng, than
hoạt tính, đường, agar, pH.
2.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự
phát sinh hình thái in vitro
2.1.5.1. Anh hưởng của mẫu cấy
Vật liệu nuôi cấy là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh
trưởng và phát triển in vitro:
¾ Kiểu di truyền
Khả năng tái sinh của thực vật rất đa dạng. Những cây hai lá mầm thông
thường có khả năng tái sinh mạnh hơn cây một số lá mầm và cây hạt trần rất khó tái
sinh (trừ khi chúng còn non). Trong số các cây hai lá mầ
m, Solanaceae,
Begoniaceae, Crassulaceae, Gesneriaceae, Cruciferae là những họ thực vật dễ tái
sinh nhất.
Nếu một loài dễ tái sinh cơ quan trong tự nhiên (các giống lai Saintpaulia
ionantha, Begonia rex, Streptocarpus) thì chúng hầu như dễ tái sinh in vitro. Cũng có
những trường hợp ngoại lệ như những đoạn cắt từ lá của Kalanchoe farinacea hầu
như không có khả năng hình thành chồi bất định in vivo nhưng có thể thực hiện trong

Tình trạng sinh lý ảnh hưởng mạnh đến khả năng tái sinh và phân chia tế bào
in vitro. Thông thường các bộ phận của cây trong giai đoạn sinh dưỡng dễ tái sinh
hơn trong giai đoạn sinh sản. Các mẫu cấy từ vảy của cây huệ tây ở giai đoạn sinh
dưỡ
ng tái sinh tốt hơn những mẫu cấy ở giai đoạn sinh sản (Robb, 1957). Các chồi
của cây trong giai đoạn ngủ đông (cuối thu đầu đông) khó nuôi cấy in vitro hơn chồi
của những cây đã vượt qua được giai đoạn này (vào mùa xuân trước khi chúng bắt
đầu phát triển).
¾ Vị trí của mẫu cấy trên cây
Ever (1984) đã khảo sát sự ảnh hưởng của vị trí mẫu cấy lên sự sinh tr
ưởng và
phát triền in vitro sau khi tách mẫu ở cây Pseudotsuga menziesii, ông nhận thấy
những chồi ban đầu được tách từ những vị trí thấp trên cây phát triển trong môi
trường in vitro tốt hơn, và chồi gốc tăng trưởng nhanh hơn chồi nách. Sự hình thành
các giả hành bất định của mẫu cấy lan dạ hương được tách ra từ phần gốc của vảy
hành tốt hơn từ phần đỉnh. Đi
ều này cũng xảy ra tương tự đối với Lily (Robb, 1957).
e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f

GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc
Khoa Môi trường & CNSH

- 11 -
Điều đáng lưu ý là những mô sẹo phát sinh từ những mẫu cấy có nguồn gốc từ các
phần khác nhau của cây như rễ, chồi, cuống lá đều có phản ứng in vitro giống nhau.
¾ Kích thước mẫu cấy
Các cấu trúc nhỏ như tế bào, cụm tế bào và mô phân sinh khó cảm ứng để
tăng trưởng hơn những cấu trúc lớn như thân, lá, củ. Các phần được tách rời khỏ
i cây
tự nó cung cấp chất dinh dưỡng và hormone, do đó mẫu cấy có kích thước càng lớn

GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc
Khoa Môi trường & CNSH

- 12 -
2.1.5.2. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng và phát triển của thực vật
Chất điều hòa sinh trưởng hoạt động với liều lượng rất thấp,ở liều lượng cao
chúng trở nên độc, điều này cho phép một vài chất kích thích tố được sử dụng như
các chất diệt cỏ dại.
Các chất điều hòa nội sinh có thể được kiểm soát do cơ
chế chuyển hóa của tế
bào nên chúng được kiểm soát hoặc đào thải khá nhanh. Trái lại các chất điều hòa
tổng hợp tồn tại lâu hơn nhiều nên thường được sử dụng cho các ứng dụng trong thực
tế.
Có 5 nhóm chất điều hòa quan trọng trong nuôi cấy mô thực vật: auxin,
cytokinin, gibberellin, abscisic acid và etylen.
¾ Auxin
Auxin là hợp chất có nhân indole, có công thức nguyên là C
10
H
9
O
2
N. Auxin
gồm có hai loại là auxin có nguồn gốc nội sinh do thực vật tạo ra (IAA), và auxin
tổng hợp do con người tạo ra (IBA, NAA, 2,4-D, ).
Auxin can thiệp vào nhiều hiện tượng sinh lý, hoạt động của nó tùy thuộc vào
nồng độ và tác động bổ trợ của chúng với các chất điều hòa tăng trưởng khác.
Auxin tác động lên sự kéo dài tế bào. Hiệu quả này là sự nối tiếp cho sự gia
tăng tính đàn hồi của thành tế bào và cho sự xâm nh
ập của nước vào bên trong tế

gibberellin. Người ta biết rằng trong môi trường nuôi cấy, việc bổ sung cytokinin sẽ
tạo điều kiệ
n thuận lợi cho sự phân chia tế bào và hình thành chồi. Cytokinin là các
hợp chất adenin được thay thế, có 2 nhóm cytokinin nội sinh được biết đến là zeatin
và IPA, ngoài ra còn có 2 nhóm cytokinin tổng hợp được sử dụng nhiều nhất trong
nuôi cấy mô thực vật là Kinetin và BAP.
Cytokinin tác động hiệu quả lên sự phân chia tế bào khi có sự hiện diện của
auxin: auxin tạo điều kiện thuận lợi cho sự nhân đôi DNA và cytokinin cho phép tách
rời nhiễm sắc thể.
Cytokinin có vai trò trong sự tạo cơ
quan thực vật, chúng kích thích mạnh mẽ
sự thành lập chồi non, trái lại chúng là chất đối kháng với sự tạo rễ.
Cytokinin kích thích quá trình chuyển hóa, bảo vệ các chất chuyển hóa chống
lại tác động của enzyme phân giải, làm chậm quá trình lão hóa. Các chồi nách được
xử lý bằng cytokinin sẽ tăng trưởng và cạnh tranh với chồi ngọn.
Tóm lại, cytokinin giúp duy trì sự sống của mô, kích thích sự phân chia tế bào
và định hướng tế bào trong con đường phân hóa, tạo
điều kiện thuận lợi cho nuôi cấy
in vitro.
¾ Gibberellin
Gibberellin cũng như chất auxin, đã nổi bật rất lâu trước khi được nhận dạng.
Chất gibberellin đầu tiên được nhận dạng GA
3
. Đây là các chất có cấu trúc nội sinh.
Tất cả các gibberellin thể hiện một nhân giống nhau, chúng có sự khác nhau
bởi chất lượng và vị trí của các chất thế trên nhân.
Tính chất chính của gibberellin là sự kéo dài của các đốt cây. Tác động này
cũng có thể áp dụng trên các cuống hoa và điều này cho phép có một sự chín tốt hơn
e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f


động này nó đã ảnh hưởng trên sự đóng các lỗ hổng của tế bào.
Khi áp dụng trên các cây ngắn ngày được nuôi cấy bằng chu kỳ sáng thích
hợp, nó có thể hoàn toàn (như cây volubilis) hoặc từng phần bị ức chế (như cây
chenopodium rubrum) thậm chí kích thích sự ra hoa (như cây plumbago). Áp dụng
trên các cây dài ngày, nó có thể ức chế sự ra hoa trong chu kỳ sáng thuận lợi chẳng
hạn như cây epinard, lolium temulentum).