TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN
QUẢNG THỊ MỸ DUYÊN
SO SÁNH KẾT QUẢ PHÁT HIỆN
MONODON BACULOVIRUS TRÊN TÔM SÚ
(Penaeus monodon) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM
MALACHITE GREEN, NHUỘM HAEMATOXYLIN VÀ
EOSIN, POLYMERASE CHAIN REACTION
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
ii
TÓM TẮT
Đề tài được thực hiện nhằm so sánh kết quả phát hiện Monodon
Baculovirus trên mẫu tôm giống và tôm thịt bằng 3 phương pháp nhuộm
Malachite Green, nhuộm Haematoxylin và Eosin, Polymerase Chain Reaction.
Đối với 30 mẫu tôm giống được phân tích bằng 3 phương pháp này thì có 8/30
mẫu (chiếm 27%) cho kết quả dương tính ở cả 3 phương pháp và 22/30 mẫu
(chiếm 73%) có sự khác biệt ở 3 phương pháp. Đối với 11 mẫu tôm thịt thì có
3/11 mẫu cho kết quả dương tính ở 2 phương pháp nhuộm Malachite Green và
Polymerase Chain Reaction. Riêng ở phương pháp nhuộm Haematoxylin và
Eosin thì 11/11 mẫu đều cho kết quả tế bào gan tụy bình thường. Qua kết quả này
cho thấy ở phương pháp Polymerase Chain Reaction thì tiện lợi hơn phương pháp
nhuộm Malachite Green và nhuộm Haematoxylin và Eosin trong việc phát hiện
mầm bệnh trong bất kỳ giai đoạn nào. Trong khi đó, ở phương pháp nhuộm
Malachite Green và nhuộm Haematoxylin và Eosin thì lại có ý nghĩa trong việc
chẩn đoán nguyên nhân gây bệnh, nhưng ở phương pháp nhuộm Malachite Green
thì thời gian thực hiện ngắn và đơn giản nên cho kết quả chẩn đoán nguyên nhân
gây bệnh ở cơ quan đích nhanh hơn nhuộm Haematoxylin và Eosin. Do đó, tùy
mục đích nghiên cứu mà chọn phương pháp phát hiện bệnh cho phù hợp.
2.5 Phương pháp nhuộm Malachite Green 10
2.6 Phương pháp mô học (nhuộm Haematoxylin và Eosin) 10
2.6.1 Sơ lược về nghiên cứu mô học 10
2.6.2 Ứng dụng mô học bệnh học trong thủy sản 11
2.7 Phương pháp PCR 12
2.7.1 Sơ lược về PCR 12
2.7.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 13
2.7.3 Ứng dụng của phương pháp PCR trong thủy sản 14
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
iv
CHƯƠNG 3:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 15
3.2 Vật liệu nghiên cứu 15
3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 15
3.2.2 Dụng cụ dùng trong nghiên cứu 15
3.2.2.1 Dụng cụ dùng trong phương pháp nhuộm Malachite Green 15
3.2.2.2 Dụng cụ dùng trong phương pháp nhuộm Haematoxylin và Eosin . 15
3.2.2.3 Dụng cụ dùng trong phương pháp PCR 15
3.2.3 Hóa chất dùng trong nghiên cứu 16
3.2.3.1 Phương pháp nhuộm Malachite Green 16
3.2.3.2 Phương pháp nhuộm Haematoxylin và Eosin 16
3.2.3.3 Phương pháp PCR 16
3.3 Phương pháp nghiên cứu 16
3.3.1 Phương pháp thu mẫu 16
3.3.2 Phương pháp phân tích 17
3.3.2.1 Phương pháp nhuộm Malachite Green 17
3.3.2.2 Phương pháp nhuộm Haematoxylin và Eosin 17
3.3.2.3 Phương pháp PCR 20
3.4 Phương pháp xữ lý số liệu 20
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
vi
DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 3.1: Thành phần và thể tích của dung dich Davidson
’
s AFA 17
Bảng 3.2: Hóa chất sử dụng trong quy trình xử lý mẫu 18
Bảng 3.3: Các hóa chất sử dụng trong quy trình nhuộm mẫu 19
Bảng 4.1: Kết quả phát hiện nhiễm MBV trên tôm giống bằng phương pháp
nhuộm MG, H&E và PCR 30
Bảng 4.2: Kết quả phát hiện nhiễm MBV trên tôm thịt bằng phương pháp pháp
nhuộm MG, H&E và PCR 31
H&E 26
Hình 4.9: Kết quả phát hiện MBV trên tôm giống bằng phương pháp PCR 27
Hình 4.10: Kết quả điện di phát hiện MBV trên tôm giống bằng phương pháp
PCR 27
Hình 4.11: Kết quả phát hiện MBV trên tôm thịt bằng phương pháp PCR 28
Hình 4.12: Kết quả điện di phát hiện MBV trên tôm thịt bằng phương pháp
PCR 28
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
1
CHƯƠNG 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1 Giới thiệu
Ngày nay, thủy sản là một trong những ngành có vai trò quan trọng và đem lại
hiệu quả kinh tế đáng kể cho đất nước. Trong đó, nuôi trồng thủy sản ở Đồng
Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) chiếm trên 70% sản lượng nuôi trồng và trên
60% tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản của cả nước (Nguyễn Chu Hồi,
2008). Trong các đối tượng nuôi chính thì tôm sú là đối tượng nuôi đã đem lại
hiệu quả kinh tế rất cao trong công tác xóa đói giảm nghèo và góp phần nâng
cao chất lượng cuộc sống cho người dân của vùng.
Phong trào nuôi tôm sú thương phẩm ở ĐBSCL phát triển rầm rộ từ năm 2000
khi chính phủ ban hành nghị quyết 09. Diện tích tôm nuôi hiện nay đã tăng
gấp đôi so với năm 2000 (từ 250.000 ha lên 540.000 ha và chủ yếu là tôm sú
(538.800 ha) tập trung ở các tỉnh Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Kiên Giang,
Trà Vinh, Tiền Giang, Bến Tre (Bộ NN&PTNN, 2008). Song song với việc
gia tăng diện tích, sản lượng tôm nuôi thì tình hình dịch bệnh cũng đang diễn
biến phức tạp và gây ra những tổn thất nghiêm trọng cho người nuôi. Những
bệnh chính thường xuất hiện trên tôm sú nuôi ở ĐBSCL gồm bệnh do vi
khuẩn như bệnh phát sáng, bệnh đen mang, nghiêm trọng hơn là các bệnh do
virus như White Spot Syndrome Virus (WSSV), Monodon Baculovirus
3
CHƯƠNG 2
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới
Hiện nay, trên thế giới hai khu vực nuôi tôm lớn nhất là Đông Nam Á và Châu
Mỹ. Sản lượng tôm nuôi ở Châu Á chiếm khoảng 80% sản lượng toàn cầu.
Các nước chiếm sản lượng tôm nuôi cao là: Trung Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản,
Philippin, In-đô-nê-xi-a, Thái Lan, Hàn Quốc, Bănglađet, Việt Nam, Nauy ;
có khoảng 20 loài tôm được nuôi trên thế giới. Trong đó, các loài tôm được
nuôi nhiều nhất là tôm sú (Penaeus monodon), tôm nương (Penaeus
chinensis), tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei). Riêng 3 loài tôm này
chiếm trên 86% sản lượng tôm nuôi của thế giới. Sản lượng tôm nuôi năm
2000 của thế giới là 1.087.111 tấn chiếm khoảng 66% giáp xác nuôi, giá trị
6,880 tỷ USD, chiếm 73,4% trong giá trị nuôi giáp xác. Năm 2001 sản lượng
đạt 1.270.875 tấn, giá trị 8,432 tỷ USD. Tổng sản lượng tôm nuôi chiếm 25%
sản lượng tôm nói chung của thế giới ( trích dẫn từ Bộ Thủy Sản, 2006).
2.2 Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam
Theo Ling (1973) và Rabanal (1974) thì nghề nuôi tôm ở Việt Nam đã tồn tại
từ thập niên 70 với hình thức nuôi tôm quảng canh. Trong đó, diện tích tôm
nuôi ở ĐBSCL ở thời kì này đạt khoảng 70.000 ha. Nghề nuôi tôm ở Việt
Nam thật sự phát triển từ sau năm 1987 và nuôi tôm thương phẩm phát triển
mạnh vào những năm đầu thập kỹ 90. Tuy nhiên, sự bùng nổ của nghề nuôi
tôm thương phẩm được đánh dấu vào năm 2000 khi chính phủ ban hành nghị
quyết 09, cho phép chuyển đổi một phần diện tích trồng lúa, làm muối năng
suất thấp, đất hoang hóa sang nuôi trồng thủy sản. Diện tích nuôi tôm đã tăng
từ 250.000 ha năm 2000 lên đến 478.000 ha năm 2001. Song song, với việc
mở rộng diện tích, sản lượng tôm nuôi cũng tăng mạnh từ những năm 90 và
đặc biệt là từ sau năm 2000 Việt Nam đã trở thành một trong năm nước có sản
lượng tôm nuôi cao nhất thế giới (Bộ thủy sản, 2006). Năm 2003 tổng diện
tích tôm nuôi khoảng 518.557 ha đạt sản lượng hơn 258.034 tấn. Theo báo cáo
yếu ở Thái Lan và các nước châu Á) (Rosenberry, 1997). Theo kết quả nghiên
cứu của Liao (1999) thì quần đàn tôm mẹ bắt từ biển của Đài Loan 1987
nhiễm MBV 33%, đến năm 1989 nhiễm 100%, thường gặp nhiễm 85%. Loài
virus này được công bố là loài gây bệnh trên tôm nuôi công nghiệp ở Đài Loan
năm 1987-1988 (Liao et al., 1992). Natividad (1992) cho biết, ở Philippine
đến năm 1992 rất khó tìm được một đàn PL của tôm sú không nhiễm MBV
(trích dẫn từ Nguyễn Văn Hảo,1997).
MBV cũng được xem là tác nhân gây bệnh làm ảnh hưởng đến năng suất thu
hoạch ở Úc. MBV hiện diện phổ biến ở các Châu lục, gây bệnh cho tôm nuôi
và tôm tự nhiên (Lightner và Redman, 1981). Virus này gây tỷ lệ chết cao cho
ấu trùng và đối với tôm trưởng thành sự nhiễm ít nghiêm trọng hơn (Liao et
al., 1992). Còn theo Lightner (1996) thì MBV có thể nhiễm ở hầu hết các giai
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
5
đoạn khác nhau của tôm, bắt đầu từ giai đoạn Zoea 2, riêng giai đoạn Nauplius
có tính trơ với virus. Tuy nhiên, khả năng gây bệnh của MBV còn tùy thuộc
vào độc lực của từng chủng virus ở từng vùng địa lý khác nhau (trích dẫn từ
Đỗ Thị Hòa và ctv, 2004).
Theo Phan Lương Tâm (1994) thì tại Việt Nam trong hai năm 1994-1995 hiện
tượng tôm nuôi chết hàng loạt và lan rộng trên hầu hết các tỉnh ven biển phía
Nam đã gây thiệt hại trên dưới 250 tỉ đồng. Các công trình nghiên cứu liên
quan đến việc xác định các tác nhân gây bệnh chính trên tôm nuôi ở ĐBSCL
cho thấy ngoài tác nhân gây bệnh thuộc nhóm Vibrio còn ghi nhận sự xuất
hiện của hai tác nhân gây bệnh virus quan trọng là MBV (Monodon
Baculovirus) và WSSV (White Spot Syndrome Virus) (trích dẫn từ Nguyễn
Văn Hảo và ctv, 1997).
Kết quả nghiên cứu của Đỗ Thị Hòa và ctv (2004) cho thấy tại các tỉnh miền
Trung có khoảng 70% bể PL có MBV dương tính. Khi đưa PL xuống ao đất
để ương thành tôm giống, tỷ lệ nhiễm MBV trên đàn giống tăng cao, gần 90%
ao ương nhiễm MBV. Tôm bố mẹ dùng trong các trại sản xuất tôm sú giống ở
nghiên cứu NTTS nước lợ thực hiện cho thấy tỷ lệ nhiễm virus đốm trắng từ
25-46,6%, trung bình 38,9% tỷ lệ nhiễm MBV từ 43,3-60%. Và trong số 4
nguồn cung cấp giống về cho 2 tỉnh vùng Ðông Bắc Bộ này, có tới 3 nguồn có
quá nửa số giống bị nhiễm bệnh MBV. Tại các tỉnh Nam Bộ theo báo cáo năm
2003 của Viện NTTS II thì tỷ lệ nhiễm bệnh đốm trắng trên mẫu tôm có biểu
hiện bệnh thu ở đầm nuôi quảng canh cải tiến là 56%, còn bệnh MBV là 50%
(Hà Anh, 2007).
Theo kết quả nghiên cứu của Trung tâm Quản lý bệnh thủy sản Khoa Thủy sản
trường Đại học Cần Thơ từ năm 2001-2003 thì tỷ lệ nhiễm bệnh đốm trắng
trên tôm giống tại các tỉnh ĐBSCL là 13,1% và MBV là 33,8% (Đặng Thị
Hoàng Oanh và ctv, 2004).
Năm 2005 theo phòng kiểm dịch giống thủy sản Cà Mau cho biết qua số mẫu
kiểm dịch đã có tới 83% mẫu tôm giống ở tỉnh bị nhiễm MBV. Trung tâm
khuyến ngư tỉnh Bạc Liêu năm 2006 đã xét nghiệm 2.326 mẫu tôm phát hiện
có gần 50% số mẫu kém chất lượng; trong đó có 941 mẫu nhiễm MBV,184
mẫu nhiễm virus đốm trắng. còn ở Trung tâm khuyến ngư Kiên Giang thì qua
kiểm tra 100 mẫu tôm giống, số lượng tôm bị nhiễm bệnh còi chiếm đến 40%
lượng tôm sú giống nhập về (Cung Diễm, 2006).
Trong đầu vụ nuôi tôm sú năm 2008, hiện đã có gần 100.000 ha nuôi tôm sú ở
Sóc Trăng, Bạc Liêu, Cà Mau, Kiên Giang, Trà Vinh… bị chết, mức độ thiệt
hại từ 30-90% . Riêng ở Kiên Giang ước lượng mức thiệt hại do tôm chết đã
trên 15 tỷ đồng. Trong đó, điển hình như huyện Vĩnh Thuận là 17.247 ha
chiếm 88,98%; huyện An Minh 15.904 ha chiếm 50,25%; huyện U Minh
hượng 3.653 ha chiếm 52,35%; và An Biên 2.475 ha chiếm 30,11% diện tích
thả nuôi (Song Huỳnh, 2008).
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
7
Tại huyện Mỹ Xuyên-Sóc Trăng là nơi có mô hình nuôi tôm-lúa được các nhà
khoa học ở các viện, trường đại học trong cả nước đánh giá mang tính bền
vững cao. Tuy nhiên, đến khoảng trung tuần tháng 4-2008, nơi đây có hơn
plebejus, P. monodon, P. merguiensis) từ Úc có kích thước nhân 45-52 x 260-
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
8
300 nm, kích thước vỏ bao 60 x 420 nm (Mari et al., 1993 được trích dẫn từ
Bùi Quang Tề, 2006).
Virus ký sinh ở tế bào biểu mô hình ống gan tụy và tế bào biểu bì phía trước
ruột giữa, virus tái sản xuất bên trong nhân tế bào vật nuôi, bao gồm các giai
đoạn sau:
Giai đoạn tiềm ẩn: sau khi tế bào nhiễm MBV là giai đoạn sớm của tế bào chất
biến đổi.
Giai đoạn 1: Nhân tế bào trương nhẹ, các nhiễm sắc thể tan ra và di chuyển ra
sát màng nhân. Tế bào chất mất dần chức năng của chúng và hình thành giọt
mỡ. Virus bắt đầu gây ảnh hưởng.
Giai đoạn 2: Nhân trương to, số lượng virus tăng nhanh, xuất hiện thể ẩn trong
nhân.
Giai đoạn 3: tế bào bị bệnh, nhân tăng lên 2 lần đường kính, 6 lần thể tích. Bên
trong nhân có một đến nhiều thể ẩn, trong thể chứa đầy các virus.
Các virus phá hũy tế bào ký chủ, tiếp tục di chuyển sang các tế bào khác hoặc
theo chất bài tiết của tôm ra môi trường, tạo thành virus tự do tồn tại trong bùn
và nước (Trần Thị Tuyết Hoa, 2008).
2.4.2 Dấu hiệu bệnh lý
Theo Trần Thị Tuyết Hoa (2008) thì khi tôm mới nhiễm MBV, dấu hiệu bệnh
không biểu hiện rõ ràng. Khi tôm nhiễm bệnh nặng và phát bệnh thường có
biểu hiện một số dấu hiệu sau:
Tôm có màu tối hoặc xanh tái, xanh xẫm. Tôm kém ăn, hoạt động yếu và sinh
trưởng chậm. Các phần phụ và vỏ kitin có hiện tượng hoại tử, có nhiều sinh
vật bám như: ký sinh trùng đơn bào, tảo bám và vi khuẩn dạng sợi.
Gan tụy teo lại có màu trắng hơi vàng, thối rất nhanh.
Tỷ lệ chết dồn tích, cao tới 70% hoặc có thể tôm chết hầu hết trong ao.
2.4.3 Phân bố
phương pháp nhuộm Haematoxylin và Eosin để phát hiện các thể ẩn hình cầu,
bắt màu hồng của thuốc nhuộm Eosin, nằm trong nhân phình to của tế bào gan
tụy, ở độ phóng đại ≥ 40X.
Ngoài ra, cũng có thể dùng các phương pháp hiện đại để chẩn đoán và nghiên
cứu virus này như dùng kỹ thuật PCR để nhận biết ADN đặc trưng của MBV,
dùng phương pháp kính hiển vi điện tử (TEM) phát hiện các vi thể virus MBV
trong nhân tế bào biểu mô gan tụy hay các kỹ thuật như ELISA, lai tại chổ
(Trần Thị Tuyết Hoa, 2008).
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
10
2.4.7 Phòng bệnh
Không dùng tôm giống có nhiễm mần bệnh MBV.
Kiểm tra đàn tôm bố mẹ trước khi cho đẻ.
Cải tạo ao thật kỹ trước mỗi vụ nuôi.
Nuôi tôm đúng mùa vụ, quản lý, chăm sóc tốt, cung cấp đầy đủ thức ăn về
chất và lượng. Không để tôm sốc trong quá trình nuôi.
Xử lý nước bằng ozon và các chất sát trùng Benzalkon clorua trước khi ấp
trứng thì có thể sản xuất được đàn tôm PL không bị nhiễm MBV (Trần Thị
Tuyết Hoa, 2008).
2.5 Phương pháp nhuộm Malachite Green
Phương pháp nhuộm nhanh bằng Malachite green 0,05-0,1% được Lightner et
al. đề ra năm 1983 nhằm phát hiện các thể ẩn của MBV trong vòng 5 phút.
Tuy nhiên, độ nhạy của phương pháp này thì hạn chế, nó chỉ có thể kiểm tra
được những con tôm bị nhiễm bệnh cấp tính hoặc trước cấp tính trong một
quần đàn có tỷ lệ nhiễm cao (Lightner et al., 1989).
2.6 Phương pháp mô học (nhuộm Haematoxylin và Eosin)
2.6.1 Sơ lược về nghiên cứu mô học
Mô học được nghiên cứu bắt đầu từ khi chiếc kính hiển vi đầu tiên được chế
tạo bởi Antoni Van Leuwenhock (1632-1723) người Hà Lan, đến cuối thế kỷ
XVIII Robert Hooke (1635-1703) nhà khoa học người Anh đã xác định tế bào
phương pháp mô học đã xác định mối quan hệ giữa các loài virus gây nhiễm
trên các loài tôm biển ở Ấn Độ (trích dẫn từ Phạm Trần Nguyên Thảo, 2003) .
Ở Việt Nam, năm 1999 Nguyễn Văn Hảo nghiên cứu bệnh tôm trên tôm sú
nuôi tại Trà Vinh bằng phương pháp mô học và PCR và năm 2000 ông cũng
ứng dụng tiếp 2 phương pháp này trong nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu bệnh
đỏ mang trên tôm sú bố mẹ, bệnh phát sáng, bệnh đục thân và bệnh đốm trắng
trên ấu trùng tôm sú giống tại các trại giống thuộc các khu vực Miền Trung và
Nam Bộ”. Năm 2001, Hòa cũng đã ứng dụng mô học trong việc xác định
cường độ cảm nhiễm MBV. Đến năm 2003, Bùi Quang Tề cũng đã ứng dụng
phương pháp này vào việc chẩn đoán bệnh tôm và đưa ra phương pháp phòng
trị. Cùng năm này, Phạm Trần Nguyên Thảo đã ứng dụng phương pháp mô
học và PCR để chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm giống và tôm thịt.
Theo Nguyễn Anh Tuấn và ctv (2003) thì phương pháp này là một kỹ thuật rất
quan trọng trong nghiên cứu bệnh tôm và nhiều trường hợp chỉ có thể chẩn
đoán được bệnh bằng phương pháp này. Tuy nhiên, nó cũng có những hạn chế
là thao tác tương đối chậm và chỉ phát hiện bệnh khi tôm đã nhiễm nặng.
Đồng thời khi sử dụng phương pháp này để chẩn đoán bệnh nên kết hợp với
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
12
tất cả các dữ liệu về môi trường và sức khỏe tôm vì đôi khi những hình thái
tổn thương của một số bệnh có biểu hiện giống nhau (trích dẫn từ Phùng Thúy
An, 2005).
2.7 Phương pháp PCR
2.7.1 Sơ lược về PCR
Polymerase Chain Reaction là phương pháp được Kary Mullis et al. phát minh
năm 1985 đã giúp các nghiên cứu về ADN nói riêng và về sinh học phân tử
nói chung đạt được những thành tựu to lớn.
PCR là kỹ thuật khuếch đại từ một đoạn ADN bất kỳ có thể nhân lên hàng tỷ
lần nhanh chóng nhờ sự hiện diện của một hoặc hai đoạn mồi (primer) chuyên
biệt (oligonucleotides) dài khoảng 17 đến 30 nucleotite có trình tự bổ sung với
gian của các bước này tùy thuộc độ dài của ADN cần khuếch đại, thường 30
giây đến nhiều phút.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
13
Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn trên đi lặp lại nhiều lần, mỗi lần lại làm tăng gấp
đôi lượng mẫu so với lần trước. Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân. Theo
tính toán thì sau 25 đến 35 chu kỳ, sự khuếch đại sẽ là 2
25
-2
35
bản sao.
Trong qui trình PCR, sau những chu kỳ đầu, các chu kỳ cuối nhiệt độ cần tăng
thêm 1-2
0
C. Do về sau lượng mồi giảm, lượng khuôn tăng lên, mặt khác
enzyme Taq ADN polymerase hoạt động yếu dần do tác động nhiệt độ, vì vậy
cần tăng nhiệt độ chu kỳ sau để tăng hiệu quả tổng hợp ADN.
Sau phản ứng các ADN được nhuộm bởi Ethidium Bromide và có thể quan sát
thông qua điện di sản phẩm PCR trong gel agarose và đọc kết quả dưới bàn
đọc UV.
2.7.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR
ADN khuôn: Theo Khuất Hữu Thanh (2006) khuôn ADN có vai trò rất quan
trọng, ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu quả PCR. Phản ứng tối ưu với các đoạn
khuôn hoàn toàn tinh sạch, nhưng khi các đoạn khuôn không sạch có lẫn các
protein thì hiệu quả giảm theo tỉ lệ thuận với độ tinh sạch của ADN khuôn.
Enzyme: ADN polymerase càng mạnh, phản ứng PCR càng triệt để. Tùy các
đặc tính của ADN polymerase, tùy thuộc nguồn gốc tách chiết enzyme mà
hiệu quả phản ứng khác nhau.
Mồi và nhiệt độ gắn mồi: Mồi là yếu tố quan trọng quyết định hiệu quả phản
ứng PCR, và phải tuân thủ một số nguyên tắc:
tối ưu để thực hiện phản ứng PCR từ 150-200 µM. Nước
sử dụng cho phản ứng phải là nước tinh khiết, không chứa bất kì ion lạ nào.
Không chứa các enzyme cắt hạn chế và các enzyme phân hủy acid nucleic.
Môi trường dung dịch đệm phải ổn định. Dung tích tổng số cho một phản ứng
PCR khoảng từ 20-50 µl.
Chu kỳ phản ứng: Theo Hồ Huỳnh Thùy Dương (2005) số lượng chu kỳ
PCR thường không vượt quá 40 chu kỳ cho một phản ứng. Sở dĩ như vậy là vì
phản ứng PCR diễn tiến qua 2 giai đoạn, trong giai đọan đầu số lượng bản sao
tăng theo cấp số nhân tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả khuếch đại
giảm hẳn vì những nguyên nhân sau: (1) sự phân hủy và cạn kiệt các thành
phần của phản ứng (2) sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng (3) các
bản sao vừa được tổng hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau…
2.7.3 Ứng dụng của phương pháp PCR trong thủy sản
Hiện nay, phương pháp này đã được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực
nghiên cứu như sinh học phân tử, vi sinh, kiểm nghiệm, chẩn đoán để phát
hiện mầm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm Trong thủy sản thì phương pháp này
theo Trần Thị Tuyết Hoa (2007) có những ứng dụng sau:
Phát hiện nhanh tác nhân gây bệnh ở dạng tiềm ẩn giúp cho quá trình chọn lọc
cá thể thủy sản có chất lượng tốt trong chọn giống và ương nuôi: (1) Chẩn
đoán bệnh: điều tra nguyên nhân bùng nổ bệnh và cách giải quyết. (2) Phòng
bệnh: kiểm tra tôm bố mẹ và tôm giống ở trại sản xuất giống. (3) Kiểm soát
bệnh: theo dõi, kiểm tra theo khu vực và kiểm tra tôm giống nhập khẩu.
Ứng dụng trong đánh giá an toàn hàng thủy sản xuất khẩu – Sự nhiễm khuẩn
hàng thủy sản bởi Vibrio parahaemolyticus, Escherichia coli.
Góp phần vào qui trình xác định trình tự nucleotide đột biến của tác nhân gây
bệnh, hay có thể là các loài động vật thủy sản.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
15
CHƯƠNG 3
- Máy điện di
- Máy chụp hình UV
- Lò viba
- Cân điện tử
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
16
- Tủ lạnh
- Tủ -80
0
C
- Tủ -20
0
C
3.2.3 Hóa chất dùng trong nghiên cứu
3.2.3.1 Phương pháp nhuộm Malachite Green
- Malachite Green 0,05-0,1%, cồn 90
0
3.2.3.2 Phương pháp nhuộm haematoxylin và Eosin
- Nước cất
-Cồn tuyệt đối, cồn 95
0
, cồn 80
0
, cồn 70
0
- Xylen
- Formaline
- Paraffin
- Quan sát các thể ẩn MBV trong vòng 5 phút
- Các thể ẩn MBV bắt màu xanh, hình cầu đơn lẻ hay kết thành từng chùm.
3.3.2.2 Phương pháp nhuộm Haematoxylin và Eosin
a) Phương pháp cố định mẫu (theo phương pháp Lightner, 1996)
Chuẩn bị dung dich Davidson
’
s AFA
Bảng 3.1: Thành phần và thể tích của dung dich Davidson
’
s AFA
Cố định mẫu
Tôm lớn
- Dùng kéo cắt bỏ các phần phụ trên cơ thể tôm như: các chân bơi và chân bò.
Sau đó, cắt đôi tôm tại vị trí nối của phần đầu và phần bụng, tiếp tục dùng kéo
cắt phần đầu của tôm ra làm đôi theo chiều dọc cơ thể.
- Cho mẫu vừa cắt vào lọ chứa dung dịch cố định.
- Sau khi mẫu được cố định từ 24-48 giờ thì chuyển mẫu sang cồn 50-70
0
để
bảo quản mẫu (thời gian trữ mẫu trong cồn thì không giới hạn).
Thành phần Thể tích
Ethyl alcolhol 95% 330 ml
Formaline 200 ml
Acid acetic 115 ml
Nước cất 335 ml
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
Copyright: Tài liệu đại học ©