TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN NGUYỄN THỊ NGỌC HUYỀN
CHỌN HỖN HỢP VI KHUẨN Bacillus ĐỐI KHÁNG Vibrio


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
TS. PHẠM THỊ TUYẾT NGÂN 2012

i

LỜI CẢM TẠ

Đầu tiên tôi xin chân thành gởi lời tri ân đến các quý Thầy cô khoa Thủy sản
trường Đại học Cần Thơ, đã truyền đạt những kiến thức quý báo trong suốt quá

B2, B7, B8, B9, B17 B37, B38, B41, B67 có nguồn gốc từ ao nuôi tôm sú thâm
canh ở tỉnh Sóc Trăng, có khả năng cải thiện chất lượng nước và nâng cao tỉ lệ
sống của tôm. Phương pháp đục lỗ thạch được áp dụng để kiểm tra đặc tính tương
thích giữa các dòng vi khuẩn Bacillus, những dòng vi khuẩn không đối kháng lẫn
nhau đã được kết hợp lại tạo hỗn hơp. Tượng tự đối với thí nghiệm kiểm tra khả
năng đối kháng nhóm Vibrio của các dòng/hỗn hợp Bacilus tìm được với chỉ tiêu
đánh giá là đường kính vòng vô khuẩn xung quanh các lỗ thạch.
Kết quả tìm được 9 hỗn hợp trong 4 nhóm vi khuẩn sau đây thể hiện sự
tương thích lẫn nhau: (B2, B7, B41), (B2, B8, B41), (B9, B41), (B8, B67). Kết
quả khảo sát cho thấy có 5 trong tổng số 9 dòng vi khuẩn Bacillus (B2, B8, B9,
B41, B67) có khả năng đối kháng vi khuẩn Vibrio. Có 6 hỗn hợp được tuyển chọn
H2 (B2, B8, B41), H4 (B2, B8), H5 (B2, B41), H7 (B8, B41), H8 (B9, B41), H9
(B8, B67) dựa trên hai tiêu chí đặc tính tương thích giữa các dòng vi khuẩn
Bacillus và khả năng đối kháng Vibrio.
Tất cả 6 hỗn hợp được chọn lọc đều thể hiện đặc tính đối kháng Vibrio, tuy
nhiên ở các mức độ khác nhau. Trong đó khả năng kháng Vibrio harveyi 30953
mạnh nhất là các hỗn hợp H7 (0,56 cm), H2 (0,70 cm); đối với Vibrio harveyi
0986 có H9 (0,67 cm), H2 (0,57 cm), H5 (0,48 cm) có kích thước đường kính
vòng vô khuẩn cao. Riêng chủng Vibrio V(x) có nguồn gốc từ trại thực nghiệm
khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ cho kết quả hai hỗn hợp H5 (0,73 cm) và
H9 (0,60 cm) có khả năng đối kháng vượt trội hơn hẳn các hỗn hợp còn lại.

iii

MỤC LỤC
3.4 Phương pháp xử lí số liệu 20
4.1 Kết quả khảo sát đặc tính tương thích giữa các dòng Bacillus chọn lọc 22
4.2 Kết quả khảo sát khả năng đối kháng Vibrio của các dòng Bacillus 23
4.3 Kết quả khảo sát khả năng đối kháng Vibrio của các hỗn hợp Bacillus. 24
Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 30
5.1 Kết luận 30
5.2 Đề xuất 30
TÀI LIỆU THAM KHẢO 32
PHỤ LỤC 35

iv
DANH SÁCH BẢNG

Bảng 4.1: Đặc tính tương thích của 9 dòng vi khuẩn Bacillus chọn lọc 22
Bảng 4.2: Đường kính vòng vô khuẩn (cm) của Vibrio đối kháng các dòng vi khuẩn
Bacillus 23
Bảng 4.3: Đường kính vòng vô khuẩn (cm) của Vibrio đối kháng các hỗn hợp vi khuẩn
Bacillus 25
DANH SÁCH HÌNH Hình 3.1: Phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn trong môi trường TSB 14
Hình 3.2: Sơ đồ xác định đặc tính tương thích bằng phương pháp đục lỗ thạch 15
Hình 3.3: Sơ đồ xác định hoạt tính kháng khuẩn của từng dòng vi khuẩn riêng lẻ bằng

1.1 Giới thiệu
Tôm sú (Penaeus monodon) là một trong những đối tượng thủy sản có giá
trị kinh tế cao ở Việt Nam, đặc biệt là vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL).
Tuy nhiên tỉ lệ sống của đối tượng này thường không ổn định, việc nhiễm bệnh do
vi khuẩn (chủ yếu là nhóm Vibrio) gây ảnh hưởng lớn đến năng suất nuôi. Hiện
nay tình hình sử dụng kháng sinh bừa bãi trong phòng trị bệnh cho tôm nuôi đã
gây hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh. Vì vậy, chế phẩm vi sinh
(probiotic) đã trở thành một trong những cách tiếp cận mới thay thế cho việc sử
dụng kháng sinh. Tuy nhiên phần lớn các chế phẩm vi sinh sử dụng trong nước
hiện nay đều có nguồn gốc ngoại nhập hoặc không rõ thành phần, chủng loại. Các
chế phẩm vi sinh phân lập và sản xuất trong nước vẫn còn hạn chế. Việc nghiên
cứu chọn lựa những hỗn hợp các dòng vi khuẩn có khả năng kháng vi khuẩn gây
bệnh, có nguồn gốc tại địa phương làm cơ sở cho việc sản xuất đại trà chế phẩm vi
sinh là một vấn đề cần thiết trong giai đoạn hiện nay.
Bacillus là một trong các nhóm vi khuẩn được nghiên cứu nhiều nhất, nó có
vai trò quan trọng vì khả năng sản sinh nhiều sản phẩm biến dưỡng thứ cấp như
kháng sinh, thuốc trừ sâu sinh học, hóa chất và enzyme. Một số dòng vi khuẩn
thuộc nhóm Bacillus: B37, B41, B67, được phân lập từ ao nuôi tôm thâm canh ở
tỉnh Sóc Trăng đã được chọn lựa nghiên cứu vì tính thích nghi với điều kiện sinh
thái vùng ĐBSCL. Xuất phát từ những vấn đề trên, đề tài “Chọn hỗn hợp vi
khuẩn Bacillus đối kháng Vibrio” đã được thực hiện.
1.2 Mục tiêu đề tài:
Xác định hỗn hợp vi khuẩn Bacillus chọn lọc có khả năng đối kháng nhóm
Vibrio gây bệnh từ các dòng vi khuẩn có đặc tính tương thích lẫn nhau. 2

1.3 Nội dung đề tài:
Khảo sát đặc tính tương thích (không đối kháng lẫn nhau) giữa các dòng

2.1.1 Đặc điểm sinh học
Bacillus là những vi khuẩn gram dương, catalase dương tính, nhóm vi
khuẩn này thường tìm thấy trong môi trường có độ pH biến động cao, sinh trưởng
dưới điều kiện hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc, sử dụng khí oxy làm chất nhận
electron khi trao đổi khí trong quá trình trao đổi chất. Thuộc chi Bacillaceae, đứng
riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi hay thành sợi. Chúng có khả năng tạo ra bào tử khi
xảy ra các điều kiện khắc nghiệt như thiếu chất dinh dưỡng, nhiệt độ cao, phần
lớn tế bào này có bào tử trong, hình oval có khuynh hướng phình ra ở một đầu.
Bào tử có tính kháng nhiệt cao, kháng bức xạ, kháng hóa chất, kháng áp suất thẩm
thấu. Khi gặp điều kiện thuận lợi có thể nảy mầm, phát triển thành tế bào sinh
dưỡng. Qua kính hiển vi Bacillus đơn lẻ có hình dạng giống những chiếc que,
phần lớn những chiếc que này có bào tử trong hình oval có khuynh hướng phình ra
ở một đầu. Thường thì người ta quan sát thấy tập đoàn của giống sinh vật này rất
rộng lớn, có hình dạng bất định và đang phát triển lan rộng. Một đặc điểm nữa của
vi khuẩn Bacillus là có bao nhầy (giác mạc), bao nhầy có cấu tạo polypeptit. Việc
hình thành bao nhầy giúp cho vi khuẩn B. Subtilis có khả năng chịu được các điều
kiện khắc nghiệt là do bao nhầy có khả năng dự trữ thức ăn và bảo vệ vi khuẩn
tránh bị tổn thương khi gặp khô hạn (Trần Thị Thu Hiền, 2010).
2.1.2 Vai trò

4

Từ rất lâu Bacillus đã được sử dụng như một chế phẩm sinh học giúp cải
tiến chất lượng nước vì có một số đặc tính probiotic:
+ Enzym protease: Vi sinh vật tiết ra các enzym ngoại bào phân giải protein
và chuyển hóa thành các phân tử có khối lượng phân tử nhỏ (các polypeptide,
oligopeptid). Các chất này hoặc tiếp tục phân hủy thành các axit amin nhờ các
peptidaza ngoại bào hoặc xâm nhập ngay vào tế bào rồi mới chuyển hóa thành axit
amin. Một phần các axit amin này được vi sinh vật sử dụng để tổng hợp nên
protein của chúng, phần khác được tiếp tục phân giải tạo thành NH


tâm vì những ưu điểm có được từ các loại enzym thu trong việc ứng dụng: bổ
sung vào thức ăn chăn nuôi, nuôi trồng thủy sản, làm nước mắm, tạo chế phẩm
sinh học.
+ Enzym cellulase: Enzym này xúc tác sự phân hủy cellulose thành các sản
phẩm trung gian là cellubiose và sản phẩm cuối cùng là glucose. Sản phẩm cuối
cùng của sự thủy phân hữu cơ nhờ hệ enzym protease, amylase, cellulase là các
acid amin và glucose. Đó là nguồn thức ăn cho nhiều loại vi sinh vật có ích, giúp
cho chúng phát triển mạnh và làm cải thiện chất lượng nước.
Bacillus tồn tại khắp nơi trong tự nhiên. Tính dễ sống, dễ tồn tại cũng là lợi
thế để sử dụng Bacillus sản xuất chế phẩm sinh học. Trong quá trình hình thành
bào tử, Bacillus thường sản sinh những chất có hoạt tính sinh học, ứng dụng trong
nhiều lĩnh vực. Verschuere (2000) đã nghiên cứu và công bố vi khuẩn Bacillus sp
đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện chất lượng nước do vi khuẩn này đạt
hiệu quả cao trong việc chuyển đổi vật chất hữu cơ thành CO
2
. Do vậy, Bacillus sp
làm giảm tích lũy chất hữu cơ và các chất hòa tan (trích dẫn bởi Phạm Thị Tuyết
ngân, 2007). Một số loài của nhóm vi khuẩn Bacillus sp (B. Subtilis, B.
Licheniformis, B. Megaterium, ) dùng để làm sạch môi trường nhờ khả năng sinh
các enzyme (proteaza, amylaza, xenlulaza, kitinaza) phân hủy các hợp chất hữu cơ
và kiểm soát sự phát triển quá mức của vi sinh vật gây bệnh do cơ chế cạnh tranh
dinh dưỡng giữ cho môi trường luôn ở trạng thái cân bằng sinh học (Tăng Thị
Chính và Đinh Thị Kim, 2006). Bacillus còn có khả năng tổng hợp chất kháng
khuẩn làm giảm số lượng vi sinh vật phát triển quá mức như Vibrio, Aeromonas,
Theo nghiên cứu của Xiang-Hong et al. (1998) thì nhóm vi khuẩn có lợi này
bao gồm các cơ chế tác động như: có thể ngăn chặn sự phát triển của nhóm vi
khuẩn gây bệnh hoặc sản sinh ra các chất ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây
bệnh; cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự tăng trưởng của vật nuôi;
cung cấp một số enyme cần thiết làm nâng cao khả năng tiêu hóa của vật nuôi; và

tôm sẽ chết trong một thời gian ngắn hoặc bệnh sẽ chuyển thành nhiễm khuẩn mãn
tính. Để ngăn ngừa bệnh này thì phải chú ý đến việc cải thiện môi trường ao nuôi.
Hiện nay người ta đã phân lập và định danh được 172 chủng vi khuẩn từ
tôm bệnh và tìm thấy khoảng 90% chủng vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio (Nguyễn

7

Thị Tĩnh và ctv, 2010). Ở Việt Nam đã phân lập được các loài V. alginolyticus, V.
harveyi, V. vulnificus, V. cholerae, V. mimicus trên cá, tôm nhiễm bệnh (Oanh et
al., 1999). Những biểu hiện của bệnh bao gồm bơi lờ đờ, hoại tử mô và phụ bộ,
tăng trưởng chậm, biến thái chậm, dị hình, phát sáng sinh học, đục cơ hoặc đốm
đen trên thân (Aguirre-Guzman et al., 2001). Bệnh phát sáng trên tôm sú giai đoạn
trứng, ấu trùng và tôm giống gây chết nhanh và hàng loạt, từ 80-100%. Tôm
nhiễm bệnh thân có màu trắng đục, quan sát vào ban đêm thấy có hiện tượng phát
sáng trong bể ương là do V. harveyi gây ra. V. harveyi là vi khuẩn gây bệnh chủ
yếu ở các loài tôm biển và tôm càng xanh, V. harveyi phát triển mạnh trong môi
trường có độ mặn từ 20-30‰, mật độ vi khuẩn giảm rõ rệt khi ở môi trường có
nồng độ muối từ 5-7‰ (Từ Thanh Dung và ctv, 2005).
Vi khuẩn Vibrio là một thảm họa cho nghề nuôi tôm khi việc sử dụng
kháng sinh để trị không còn tác dụng nhiều mà ngược lại còn có thể làm cho vi
khuẩn kháng thuốc (Moriarty, 1999). Theo Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv (2006)
một nhóm vi khuẩn thuộc giống Vibrio spp đã gây thiệt hại kinh tế trong nuôi tôm
công nghiệp ở Philippin, Ấn Độ và Indonesia là nhóm vi khuẩn phát sáng. Bệnh
phát sáng do một số vi khuẩn có khả năng phát sáng gây ra như Vibrio harveyi, V.
splendida, V. orientalis, V. ifscheri, V. vulnificus. Ở Việt nam, những dạng nhiễm
vi khuẩn phát sáng thường thấy ở trại sản xuất hoặc ương tôm giống. Khi vi khuẩn
phát sáng hiện diện trong cơ thể tôm với số lượng lớn có thể làm tôm nhiễm bệnh
phát sáng trong bóng tối. Vibrio phát sáng có thể phát thành dịch và gây chết đến
100% ấu trùng tôm, tôm giống và kể cả tôm trưởng thành. Theo Đỗ Thị Hòa
(1996) bệnh do vi khuẩn có thể gây ra 45,3% hiện tượng chết ở tôm nuôi, trong đó

tự do trong môi trường, nó giúp cải thiện việc sử dụng thức ăn hoặc tăng cường
giá trị dinh dưỡng của thức ăn, ngoài ra probiotic còn giúp tăng khả năng đề kháng
của vật chủ đối với mầm bệnh hoặc nhờ vào sự cải thiện chất lượng của môi
trường sống.
Probiotic là công nghệ thân thiện với môi trường và đang có xu hướng được
ứng dụng rộng rãi trên thế giới và ở Việt Nam. Nghiên cứu của Lê Đình Duẩn và
ctv (2007) về nuôi thử nghiệm tôm sú bằng chế phẩm sinh học cho kết quả rất khả

9

quan, các chế phẩm sinh học không những làm tăng khả năng phân giải chất hữu
cơ, làm sạch và ổn định môi trường nước mà còn tăng năng suất gấp hai lần so với
đối chứng. Một số nghiên cứu khác về việc ứng dụng các chế phẩm sinh học vào
môi trường thủy sản cho kết quả rất khả quan, vừa có thể cải thiện chất lượng
nước, giảm lượng dùng kháng sinh, giảm mầm bệnh trong ao mà còn có thể nâng
cao năng suất nuôi và chất lượng của sản phẩm (Xiang-Hong et al., 1998). Ở
Philippin, nghiên cứu cho thấy rằng có thể cứu sống 80% tôm bệnh khi trong ao
nuôi có sử dụng chế phẩm sinh học (Moriarty, 1999). Sử dụng probiotic trong nuôi
trồng thủy sản sẽ hạn chế dùng một lượng lớn chất kháng sinh và hóa chất vào ao
nuôi thủy sản. Đặc biệt là hạn chế đáng kể khả năng gây bệnh của một số loại vi
khuẩn có hại trên đối tượng nuôi. Đây là biện pháp tăng hiệu quả sản xuất có ý
nghĩa thực tiễn (Xiang-Hong et al., 1998, trích dẫn Mai Bé Túy, 2011).
Tuy nhiên, việc sử dụng chế phẩm probiotic trong nuôi trồng thủy sản mới
chỉ bắt đầu trong khoảng hơn 10 năm trở lại đây, việc sử dụng các chế phẩm này
chủ yếu theo kinh nghiệm. Người ta cho rằng, bất kỳ một chế phẩm sinh học phải
đạt được 3 quá trình sau:
Khống chế sinh học: Những dòng vi khuẩn có ích trong chế phẩm có khả
năng sinh các chất kháng khuẩn để tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh trong ao.
Tạo sức sống mới: Các vi khuẩn trong chế phẩm khi đưa vào ao sẽ phát
triển mạnh mẽ cả về số lượng và hoạt tính, có khả năng tồn tại cả trong môi trường

nhóm vi khuẩn Bacillus sp trong nuôi cá rô phi nhầm hạn chế mầm bệnh do vi
khuẩn A. Hyrophila gây ra. Sugama và Tsumura (1998) đã sử dụng chủng Bacillus
BY-9 bổ sung vào bể (18 m
3
) nuôi ấu trùng tôm sú với mật độ 10
6
CFU/mL. Kết
quả cho thấy chủng vi khuẩn này có khả năng ức chế được vi khuẩn Vibrio harveyi
và tỉ lệ sống của tôm ở giai đoạn PL-10 ở bể bổ sung vi khuẩn đạt cao hơn
(46,1%) so với đối chứng (10,6%). Nghiên cứu của Phạm Thị Tuyết Ngân (2011)
về quần thể vi khuẩn chuyển hóa đạm trong bùn đáy ao nuôi tôm sú cho thấy chất
lượng nước ao nuôi được cải thiện đồng thời mật độ Vibrio ở các nghiệm thức bổ

11
sung Bacillus thấp hơn so với đối chứng. Graslund et al., cho thấy 86% cho thấy
86% người nuôi tôm ở Thái Lan đã sử dụng chế phẩm vi sinh hoặc dẫn xuất men
vi sinh để cải thiện chất lượng nước và bùn đáy ao nuôi.

12
Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu nghiên cứu
3.1.1 Thiết bị và dụng cụ
Nước cất, cồn 96
o
, cồn 70
o

Nồi hấp tiệt trùng, máy li tâm
Cân điện tử, vortex, bếp điện, micropipette 10-100 L, pipette 100-1000 L

PO
4
, NH
4
Cl, Na
2
SO
4
, MgSO
4
.7H
2
O,
MnSO
4
.4H
2
O, FeSO
4
.H
2
O, CaCl
2
,
3.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Khảo sát đặc tính tương thích giữa các dòng Bacillus chọn lọc
Mục đích của thí nghiệm này nhằm đánh giá những dòng vi khuẩn có khả
năng tương thích (không đối kháng lẫn nhau). Chỉ có những dòng vi khuẩn tương
thích mới có thể được sử dụng kết hợp lại trong cùng một hỗn hợp trong thí
nghiệm kiểm tra khả năng đối kháng Vibrio gây bệnh của hỗn hợp Bacillus.
Hình 3.1: Phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn trong môi trường TSB
(A, C: Phục hồi vi khuẩn trong ống nghiệm; B, D: Nuôi tăng sinh trong ống balcon.)

D
B

A

C

15
o
C trong 24 giờ
Ly tâm 1
0
00
0v/phút trong
15
phút
ở 4
o
C, thu sinh khối dung dịch
Đo m
ật độ quang, pha lo
ãng
đ
ể
được mật độ 10
6
CFU/mL
C
ấy tr
ãi trên môi tr
ư
ờng TSA
, đ
ể
khô 5 phút
Giữ ở 4
o
C trong 10 phút


Nhỏ 100

L
dung dịch vào
lỗ thạch
Giữ ở 4
o
C trong 15 phút
Ủ ở 30
o
C trong 24 giờ
Kiểm tra vòng kháng khuẩn

16
đo mật độ quang ở bước sóng 600 nm và tiến hành pha loãng để có được mật độ là
10
6
CFU/mL.
Các dòng vi khuẩn được khảo sát theo từng cặp. Dịch khuẩn của dòng vi
khuẩn thứ nhất (mật độ 10
6
CFU/mL) được cấy trãi đều trên mặt thạch TSA
(Tryptic Soya Agar) (thêm 1,5% NaCl). Sau khi chờ cho đĩa thạch thật khô, giữ
đĩa ở 4
o
C trong 10 phút. Sử dụng đầu cole đã tiệt trùng có đường kính 6 mm đục
ba giếng trên mỗi đĩa thạch.
Nhỏ 100 L dịch khuẩn của dòng vi khuẩn thứ hai (với mật độ 10
6

thuần. Sau đó nuôi tăng sinh tiến hành các thí nghiệm đục lỗ thạch.

17

Hình 3.3: Sơ đồ xác định hoạt tính kháng khuẩn của từng dòng vi khuẩn riêng lẻ
bằng phương pháp đục lỗ thạch C

ư
ờng TSA
, đ
ể
khô 5 phút
Giữ ở 4
o
C trong 10 phút
Dòng
vi khu
ẩn
ch
ỉ thị

Vibrio
Nuôi trong môi trư
ờng TSB ở

35
o
C trong 24 giờ
Ly tâm 1
0
000v/phút trong
1
5 phút
ở 4
o
C, thu sinh khối dung dịch
Đo m

CFU/mL) trên môi trường
TSA (thêm 1,5% NaCl). Sau khi chờ cho đĩa thạch thật khô, giữ đĩa ở 4
o
C trong
10 phút. Sử dụng đầu cole đã tiệt trùng có đường kính 6 mm đục ba giếng trên mỗi
đĩa thạch.
Lấy 100µL dịch khuẩn các dòng vi khuẩn Bacillus (mật độ 10
6
CFU/mL)
nhỏ vào mỗi giếng thạch của đĩa thạch đã được cấy trãi Vibrio (Hình 3.2)
Tiến hành ủ mẫu ở 4
o
C trong 15 phút để dung dịch trong giếng khuếch tán.
Sau đó đĩa được ủ ở 30
o
C trong 24 giờ, đo đường kính các vòng kháng khuẩn (nếu
có) tạo thành xung quanh các giếng thạch.
Thí nghiệm được lập lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác.
3.3.3 Khảo sát khả năng đối kháng Vibrio gây bệnh của các hỗn hợp Bacillus
Các hỗn hợp đã được sàn lọc cho bước nghiên cứu khả năng kháng Vibrio
gây bệnh dựa trên khả năng đối kháng Vibrio của từng dòng Bacillus và đặc tính
tương thích giữa các dòng vi khuẩn này. Các hỗn hợp vi khuẩn Bacillus đã tuyển
chọn được kết hợp dựa vào đặc tính tương thích (xác định ở mục 3.3.1) với tỉ lệ,
mật độ bằng nhau giữa các dòng trong cùng một hỗn hợp. Đánh giá khả năng
kháng Vibrio gây bệnh của các hỗn hợp thông qua việc hình thành các vòng vô
khuẩn xung quanh lỗ thạch.


dịch khuẩn của dòng vi khuẩn chỉ thị Vibrio harveyi (mật độ 10
5
CFU/mL) trên
C
ác dòng vi khu
ẩn
kh
ảo sát
Bacillus
Nuôi trong môi trư
ờng TSB ở

35
o
C trong 24 giờ
Ly tâm 1
0
000v/phút trong
15
phút
ở 4
o
C, thu sinh khối dung dịch
Đo m
ật độ quang, pha lo
ãng
đ
ể
được mật độ 10
6

ở 4
o
C, thu sinh khối dung dịch
Đo m
ật độ quang, pha lo
ãng
đ
ể
được mật độ 10
5
CFU/mL
Đ
ục lỗ thạch d = 6 mm

(3 lỗ/đĩa)
Nhỏ 100

L
dung dịch
vào lỗ thạch
Giữ ở 4
o
C trong 15 phút
Ủ ở 30
o
C trong 24 giờ
Kiểm tra vòng vô khuẩn
Pha tr
ộn các d
òng vi khu