i

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH
KHOA NÔNG LÂM NGƯ
--------------

Phan Thị Phương

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN NẤM
BỆNH Aspergillus flavus SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN
BẰNG MÔI TRƯỜNG THẠCH NƯỚC CỐT DỪA
(COCONUT AGAR MEDIUM)


ii

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KỸ SƯ NGÀNH NÔNG HỌC

VINH – 07.2011


iii
Lời cam đoan!
Quá trình thực tập tốt nghiệp là khoảng thời gian để người sinh viên có
điều kiện rèn luyện tính tự lực, độc lập trong suy nghĩ, bổ sung những kiến thức
mới mẻ từ thực tiễn, nâng cao trình độ lý luận chuyên môn. Tiếp tục rèn luyện
đạo đức tác phong, quan điểm phục vụ của người cán bộ khoa hoc kỹ thuật.
Để hoàn thành luân văn này tôi xin cam đoan:
1. Trong quá trình nghiên cứu bản thân luôn nhiệt tình với công việc.

hướng dẫn, giúp đỡ, động viên đó.
Xin chân thành cảm ơn!
Nghi lộc, tháng 7 năm 2011
Tác giả luận văn
Phan Thị Phương


v
MỤC LỤC
Lời cam đoan............................................................................................................i
Lời cảm ơn...............................................................................................................ii
1.1.Tính nguy hại của việc nhiễm nấm Aspergillus spp. và độc tố Aflatoxin trên lương thực,
thực phẩm..........................................................................................................................4
1.2. Sơ lược về các loài Aspergillus spp. sinh độc tố Aflatoxin .................................................7
1.3. Độc tố Aflatoxin ..............................................................................................................10

Hình 1.2. Cấu trúc hoá học của Aflatoxin (Jones, 1977)..................................13
1.3.2. Aflatoxin và tác động của nó đối với sức khỏe con người ..........................................13

Bảng 1.2. Các loài thuộc chi Aspergillus và các mycotoxin tạo thành ............15
Hình 1.3. Kết hợp các phương pháp để đánh giá chủng sinh độc tố Aflatoxin
của các loài Aspergillus spp................................................................................18
2.1. Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu.....................................................25
2.2. Nội dung nghiên cứu.......................................................................................................25

........................................................................................................................... 31
........................................................................................................................... 31
........................................................................................................................... 31
Hình 2.2. Mầu sắc A. flavus trên môi trường CAM theo thứ tự: vàng sậm (có
độc tố Aflatoxin), vàng nhạt (có thể có hoặc không có độc tố Aflatoxin) và trắng

vii
BẢNG CHỮ CÁI VIẾT TẮT
Chữ cái viết tắt
A. candidus
A. flavus
A. fumigatus
A. glacus
A. nomius
A. ochraceus
A. oryzae
A. paraciticus
AFB1
CAM
ELISA
HPLC
HPTLC
PCR
PDA
TLC
UV

Nội dung
Aspergillus candidus
Aspergillus flavus
Aspergillus fumigatus
Aspergillus glacus
Aspergillus nomius
Aspergillus ochraceus
Aspergillus oryzae
Aspergillus paraciticus



ix
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Sự có mặt của A. flavus và Aflatoxin ở các mẫu lạc (từ 1967-1983 ở
Philippin)..................................................................................................................4
Bảng 1.2. Các loài thuộc chi Aspergillus và các mycotoxin tạo thành .............15
Bảng 3.1. Thành phần và mức độ phổ biến của nấm bệnh hại hạt giống ngô...33
Bảng 3.2 Thành phần và mức độ phổ biến nấm hại hạt lạc giống....................33
Bảng 3.3: Bảng thành phần nấm hại đất trồng lạc (ngô) một số huyện Nghệ An,
Thanh Hóa, Hà Tĩnh..........................................................................................37
Bảng 3.4 : Tỷ lệ nhiễm A.flavus trên nông sản thu từ các chợ vùng Nghi Lộc và
phụ cận...............................................................................................................41
Bảng 3.5. Tỷ lệ nhiễm A.flavus trên nông sản thu từ kho bảo quản nông hộ
vùng Nghi Lộc và phụ cận..................................................................................42
Bảng 3.6: Tỷ lệ nhiễm A.flavus trên đất trồng lạc vùng Nghi Lộc và phụ cận..44
Bảng 3.7.1. Khả năng sinh độc tố Aflatoxin trên môi trường CAM của các
chủng A. flavus thu thập được từ đất trồng lạc ở Thanh Hóa, Hà Tĩnh..........46
Bảng 3.7.2 Khả năng sinh độc tố Aflatoxin trên môi trường CAM của các
chủng A. flavus thu thập được từ đất trồng lạc ở Nghệ An............................46
Bảng 3.7.3. Tỷ lệ các chủng A. flavus sinh độc tố Aflatoxin tại Nghệ An, Thanh
Hóa và Hà Tĩnh..................................................................................................47
Bảng 3.8. Khả năng sinh độc tố Aflatoxin trên môi trường CAM của các chủng
A. flavus thu thập được từ nông sản thu được từ chợ vùng Nghi Lộc và phụ cận
............................................................................................................................ 49


1
MỞ ĐẦU
1.1. Tính cấp thiết của nghiên cứu chẩn đoán nấm bệnh Aspergillus

thực hiện. Mặt dù sự hiện diện của A. flavus không phải lúc nào cũng gắn liền với
việc tồn tại Aflatoxin với hàm lượng gây độc, nhưng nó cũng thể hiện nguy cơ
lớn về việc có thể nhiễm Aflatoxin. Do đó việc định tính và định lượng được dư
lượng Aflatoxin là cần thiết và quan trọng.
Môi trường thạch nước cốt dừa được sử dụng để xác định sự có mặt của
độc tố Aflatoxin sinh ra bởi Aspergillus spp. từ những ưu điểm như: (i) rất dễ
chuẩn bị môi trường; (ii) xác định được sự hiện diện của độc tố Aflatoxin nhanh
chóng và rõ ràng bằng huỳnh quang; và (iii) sự có mặt của Aflatoxin làm môi
trường bị biến màu vàng cam - là cơ sở để định tính nhanh chóng Aflatoxin mà
không cần sử dụng đèn tia cực tím.
Với mục tiêu xây dựng phương pháp chẩn đoán sớm, nhanh và nhạy các loài
A. flavus sinh độc tố Aflatoxin, góp phần làm giảm thiểu tác hại của nấm trong sản
xuất nông nghiệp và tăng giá trị nông sản chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề
tài: "Nghiên cứu phương pháp chẩn đoán nấm bệnh Aspergillus flavus sinh độc
tố Aflatoxin bằng môi trường thạch nước cốt dừa (Coconut agar medium)".
1.2. Mục đích và yêu cầu nghiên cứu
1.2.1. Mục đích nghiên cứu
Xác định thành phần bệnh hại chủ yếu hại trên các loại nông sản lạc, ngô,
đậu tương. Nhận xét tỷ lệ mẫu nông sản và mẫu đất trồng ngô, lạc nhiễm A. flavus.
Nghiên cứu phương pháp chẩn đoán nấm bệnh A. flavus sinh độc tố Aflatoxin
bằng môi trường thạch nước cốt dừa (CAM) làm cơ sở đánh giá tình hình nhiễm
Aflatoxin trên nông sản và trên đất trồng lạc, ngô.
1.2.2. Yêu cầu
Xác định thành phần nấm hại nông sản (lạc, ngô) trên mẫu nông sản thu
được tại một số xã, huyện vùng Nghệ An.
Xác định thành phần nấm hại trên mẫu đất thu được tại một số xã, huyện
vùng Nghệ An, Thanh Hóa và Hà Tĩnh.


3


5

14

Lạc ở trại, bảo quản

1

257

45

964

Lạc còn trong vỏ

25

0

Nhân lạc bóc vỏ lụa

90

114

Loại mẫu lạc

trong các chum, kho

Mật độ A. flavus cao nhất là 794 CFU/g, trong đất trồng ngô vụ 2001 so với 251
CFU/g trong đất trồng bông gối vụ năm 2000 và 457 CFU/g đất trồng lúa mì gối vụ
năm 2002. Sự nhiễm A. flavus trên ngô hạt năm 2000 dao động từ 0% đến 100%
(trung bình là 15% hạt ngô bị nhiễm), hàm lượng Aflatoxin trong ngô dao động từ
0 đến 1590 ppb (trung bình là 57ppb). Mức nhiễm Aflatoxin phân bố ngẫu nhiên
trong ngô ở ngoài đồng không tương quan tới sự nhiễm A. flavus: 43% đến 59% có
khả năng tạo các chủng A. flavus phân lập trong đất Aflatoxin. Với sự nhiễm cao


6
nhất ở quần thể đất của ngô gối vụ năm 2001. Kết quả cũng cho thấy 84% A. flavus
phân lập từ các hạt ngô có khả năng tạo Aflatoxin [13].
Ở Thái Lan, 35% mẫu ngô nhiễm Aflatoxin B 1 (mức trung bình 400µg/kg),
trong khi 40% nhiễm Aflatoxin B1 (mức trung bình 133µg/kg) đã được tìm thấy ở
Uganda và 97% ở đảo Cebu, Philippin trung bình là 213 µg/kg. Hàm lượng
Aflatoxin ở các mẫu ngô ở gia đình đã liên quan tới sự bùng nổ của bệnh gan độc
tố cấp tính ở tây bắc Ấn Độ. Theo Goto và cộng sự 80 – 85% số mẫu ngô thu thập
từ các kho bảo quản trong mùa mưa 1984 – 1985 ở Thái lan đã nhiễm Aflatoxin B 1
với lượng 6,30 – 1310 ppb và 0,6 – 767 ppb theo thứ tự. Trong năm 1973, nghiên
cứu về lạc bóc vỏ ở Mỹ cho thấy 15% của 361 mẫu có Aflatoxin giới hạn từ vết
đến 50 µg/kg. Stoloff, Krof và Hald đã tìm thấy Aflatoxin ở 86,5% của 52 mẫu của
các sản phẩm lạc nhập vào Đan Mạch làm thức ăn gia súc, một mẫu có 3,465
µg/kg. Các Aflatoxin đã tìm thấy ở 41% của 173 số mẫu lạc ở Sudan, 16 mẫu có
trên 250 µg/kg và 9% số mẫu có trên 1000 µg/kg. Ở Philippin, tất cả các mẫu lạc
được kiểm tra năm 1967 – 1969, có Aflatoxin với giá trị 155 µg/kg và giá trị trung
bình 500 µg/kg [5, 7].
Ở Inđônêsia các nghiên cứu về độc tố đã được tiến hành trên các cây trồng
như lúa, ngô, đậu tương, cây gia vị,cây thuốc. Các mẫu lạc thu từ trong kho của
dân, của các nhà phân phối và ở các chợ cho thấy tỷ lệ nhiễm A. flavus từ 60 - 80 %
với hàm lượng Aflatoxin từ 40 - 4100µg/kg. Các mẫu ngô mới thu hoạch lấy từ

A. flavus khi phát triển trên môi trường PDA (Potato Dextrose Agar) bề
mặt khuẩn lạc có màu váng lục, do bào tử đính màu này được tạo ra rất nhiều. Hệ
bào tử đính thường có sợi cuống với vỏ cuống xù xì, có hai bộ cuống đính báo tử
và tạo bào tử đính có gai. Loại này có thể tạo Aflatoxin và có khả năng gây
bệnh. Bào tử của nấm A. flavus có khả năng phát tán trong không khí, trong
nước, trong đất. Đặc biệt khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng phát sinh phát triển
trên lương thực, thực phẩm, hoa quả và thậm chí còn gây hại một số loài cây
trồng. Vì phạm vi ký chủ rộng, khả năng phát tán rất lớn nên phòng trừ nấm hại
này thường rất khó khăn. Nấm A. flavus có thể ký sinh, gây hại các loại lương
thực như: Lúa, ngô, sắn. Trên một số loại hạt làm thực phẩm như: Lạc, đậu,


8
vừng, vv…. Trên thực phẩm như: Các sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, lạc, vừng,
đậu đỗ,…và thậm chí cả trên hoa quả tươi bị bầm dập như: Thanh long, nhãn,
xoài, vải,…[2, 11, 14].
1.2.1. Điều kiện xâm nhiễm và sinh độc tố của các loài Aspergillus spp.
Khả năng sinh độc tố của các chủng A. flavus và A. parasiticus rất khác
nhau. Điều đó phụ thuộc vào các yếu tố như chủng nấm mốc, các cơ chất, các
yếu tố nhiệt độ, độ ẩm của cơ chất và môi trường
Cơ chất là các hạt có dầu, đặc biệt là hạt lạc và các sản phẩm từ lạc.
Lượng độc tố chứa trong lạc cao nhất. Các chủng phân lập từ các hạt khác nhau
thường không thấy hoặc rất ít khả năng sinh độc tố. Ngay cả trên cùng một cơ
chất, khả năng sản sinh Aflatoxin của các chủng A. flavus cũng khác nhau.
Nguyên nhân của hiện tượng này cũng có thể do một số giống lạc có tính kháng
với A. flavus sinh độc tố Aflatoxin. Các nhà tạo giống đã dựa vào cơ sở phát hiện
trên nhằm tạo ra những giống lạc không bị nhiễm Aflatoxin. Sự hình thành
Aflatoxin phụ thuộc vào sinh khối sợi nấm và thời gian phát triển khối lượng sợi
nấm càng nhiều thì sản sinh độc tố càng nhiều và ngược lại. Thời gian sản sinh
cực đại để sản sinh Aflatoxin thường từ ngày thứ sáu đến ngày thứ bảy sau đó

– 1000 µm; rộng 5 – 15 µm. Bào tử trần (conidi) hình tròn hoặc hình ovan, có
đường kính từ 2 – 4 µm. Thể bình có hai lớp, kích thước từ 10 – 15 µm và 3 – 5
µm, đôi khi chỉ có 1 lớp [2, 11].

Hình 1.1. Cấu tạo vi thể của nấm Aspergillus flavus Link – Cơ quan sinh sản
gồm: bọng (vesicular); thể bình (metular); và bào tử (conidi).


10
Nấm A. flavus, A. parasiticus thường nhầm lẫn với loài A. oryzae trong sử
dụng (chúng có hình thái, cấu tạo và mối quan hệ di truyền rất gần nhau), như có
mầu khuẩn lạc xanh nhạt, cuống sinh bào tử không mầu, lớn như nhau, đầu thể
bình lưỡng tính hoặc đơn tính, bào tử hình cầu nhỏ... Vì vậy, chúng ta cần phải
kết hợp cả việc quan sát mầu sắc khuẩn lạc trong quá trình phân lập, nuôi cấy và
hình ảnh cuống sinh bào tử khi soi kính hiển vi để tránh nhầm lẫn khi phát hiện
các loại nấm này (A. flavus có kích thước cuống sinh bào tử (0,4 – 1mm) trong
khi đó A. oryzae là (1 – 2 mm) [2, 11].
1.3. Độc tố Aflatoxin
Độc tố nấm còn gọi là mycotoxin là nhóm hợp chất có cấu trúc đa dạng,
có khối lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi chất thứ cấp của các nấm
mốc và gây ngộ độc với động vật có vú, cá và gia cầm . Sự sinh trưởng và phát
triển của nó phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện sinh thái (Morrau 1974). Những
điều kiện đó là vùng sinh thái, khí hậu nhiệt độ, độ ẩm của không khí, lượng
nước có trong cơ chất… Sự sản sinh độc tố nấm mốc là kết quả của tác động qua
lại của kiểu gen (genotype) và điều kiện phát triển của chúng (Scheoedes và
Ashworth). Độc tố nấm là sản phẩm phụ tiết ra trong quá trình chuyển hoá. Quá
trình trao đổ chất gồm 2 giai đoạn: Trao đổi chất sơ cấp và trao đổi chất thứ cấp.
Quá trình trao đổi chất sơ cấp được hiểu là các phản ứng tạo thành chất cần thiết
đảm bảo sự sống và sự phát triển của tế bào còn trao đổi chất thứ cấp là quá trình
tạo thành các chất mà vai trò sinh lý của chúng chưa được rõ, chưa thật cần thiết

các độc tố nấm mốc khác đã ảnh hưởng đến con người như xác định các hội
chứng liên quan đến việc ăn phải bánh mì nhiễm Furarium graminearum, sự
nhận biết bệnh do nấm mốc Stachybotris và những nghiên cứu liên quan đến
bệnh giảm bạch cầu độc tố thực phẩm (ATA), và sự ăn phải các hạt lương thực
để qua mùa đông nhiễm Fusarium poae và Fuarium sporotrichioides ở nước Nga
trong chiến tranh thế giới lần thứ hai. Những số liệu có giá trị về mycotoxin và
các bệnh do mycotoxin đã thu nhận từ lĩnh vực thú y học. Các nghiên cứu trên
động vật thực nghiệm cho thấy độc tính của mycotoxin rất lớn. Hầu hết các sản
phẩm thực vật có thể là cơ chất cho sự phát triển của nấm mốc và sự tạo
mycotoxin tiếp theo. Vì thế nó tạo khả năng không những cho sự nhiễm trực tiếp


12
mà còn là nguồn mang mycotoxin vào sữa thịt. Trong số các mycotoxin thì
Aflatoxin là độc tố được phát hiện sớm nhất và được nghiên cứu đầy đủ nhất về
mọi phương diện. Aflatoxin thường được tạo bởi hai loài nấm quen biết là A.
flavus và A. parasiticus.
1.3.1. Tính chất hoá lý của Aflatoxin
Các Aflatoxin gồm 4 hợp chất của nhóm bis-furanocoumarin, là sản
phẩm trao đổi chất tạo bởi nấm A. flavus và A. parasiticus, được đặt tên là
B1, B2, G1, G2. Các Aflatoxin thường nhiễm trên các sản phẩm thực vật.
Bốn chất được phân biệt trên cơ sỏ màu phát quang của chúng. B là chữ
viết tắt của Blue (màu xanh nước biển) và chữ G là chữ viết tắt của Green
(màu xanh lá cây). Aflatoxin B1, B2 trong sữa bò được chuyển hoá được
gọi là Aflatoxin M1 và Aflatoxin M2 (M là một chữ viết tắt của Milk).
Trong bốn loại Aflatoxin thì Aflatoxin B1 thường được tìm thấy ở nồng
độ cao nhất, tiếp theo là G1, trong khi đó B2 và G2 tồn tại ở nồng độ thấp
hơn.
Aflatoxin B1 có màu huỳnh quang xanh da trời, Aflatoxin G1 có màu
huỳnh quang xanh lá cây. Aflatoxin

C17H12O6
C17H14O6
C17H12O7
C17H34O7
C17H12O7
C17H14O7

321
314
328
330
328
330

268-269
286-289
244-246
229-231
299
293

Aflatoxin M
Aflatoxin M2
1.3.2. Aflatoxin và 1tác động của nó đối với sức khỏe con người
Hình Nông
1.2. Cấu
trúc hoá
Aflatoxin
Theo Tổ chức
lương



15
Bảng 1.2. Các loài thuộc chi Aspergillus và các mycotoxin tạo thành
Loài nấm
A. flavus

Mycotoxin
Aflatoxin , acid koji, acid nitro-propionic, acid Aspergillic,
aspertoxin,...

A. parasiticus

Aflatoxin

A. niger

Aflatoxin

A. fumigatus

Aflatoxin , fumigacillin, gliotoxin

A. oryzae

Oryzacilli, acid koji

A. versicolor

Versicolorin A, B, C; aversin, sterogmatocystin

biết Aflatoxin là một trong những chất gây ung thư gan mạnh nhất tác động qua
đường miệng nếu hấp thu một tổng lượng 2,5mg Aflatoxin trong thời gian 89
ngày có thể dẫn đến ung thư gan hơn 1 năm sau. Năm 1961, ở Anh người ta đã
tiến hành thực nghiệm trên chuột cống, cho ăn thức ăn đã nhiễm mốc trong đó
20% là bột lạc thối, sau 6 tháng thấy xuất hiện ung thư gan. Robinson nghiên cứu
trên trẻ em Ấn Độ bị xơ gan, bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng, ông đã tìm
thấy Aflatoxin trong nước tiểu của những trẻ bị xơ gan và trong sữa của những
bà mẹ có con bị xơ gan. Như vậy, theo ông giữa xơ gan và Aflatoxin có một mối
quan hệ khá chặt chẽ với nhau [5].
Ở Thái lan, năm 1967 nhóm nghiên cứu của Shank cho thấy các mẫu
lương thực thực phẩm bị mốc thì 50 – 60% số mẫu đó có Aflatoxin. Đồng thời
nhóm tác giả này tiến hành trên thức ăn gia đình (lấy mẫu lương thực thực phẩm
tại các gia đình) cũng thấy có 30 – 50% số mẫu có độc tố Aflatoxin.
Ở Hà Lan, những công nhân làm việc ở nhà máy ép dầu lạc có thể tiếp
nhận từ 0,039 ppb tới 2,5 ppb Aflatoxin trong một tuần lễ làm việc Theo Baxter
và cs (1981) có sự nguy hiểm khi tiếp xúc với bụi lạc hay các sản phẩm nông
nghiệp khác có chứa Aflatoxin, tuy mức độ nguy hiểm chưa được xác nhận [2].
Độc tính với các Aflatoxin , người ta đã thấy có một loạt những triệu
chứng gắn liền với sự nhiễm độc cấp tính và những sự biến đổi liên quan đến các
sự nhiễm độc mãn tính. Loại sau này có bản chất di truyền và tương ứng với ba
kiểu: Gây ung thư, gây quái thai và gây đột biến. Hậu quả của việc nhiễm