Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
®ỔV
LÊ THỊ THU HẰNG
NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN
NẤM BỆNH Aspergillus flavus SINH Độc TỐ AFLATOXIN
BẰNG KỸ THUÂT PCR
LUẬN VĂN THẠC sĩ NÔNG NGHIỆP
Chuyên ngành: BẢO VỆ THựC VẬT Mã
số: 60.62.10
Người hướng dẫn khoa học: TS. PHẠM XUÂN HỘI
HÀ NỘI - 2009
- Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này
là trung thực và chưa hề sử dụng để bảo vệ một học vị nào.
- Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này
đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ
rõ nguồn gốc.
Tác giả

LỜI CAM ĐOAN
Nhân dịp này, tôi xin gửi lời cám ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Phạm Xuân Hội, người đã tận tình dạy bảo,
trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt quá trình làm việc cũng như thực hiện nghiên cứu khoa học và hoàn thành luận văn
này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô và các cán bộ trong Bộ môn Bệnh Cây đã tận tình dạy dỗ và giúp đỡ
tôi trong suốt quá trình học tập tại Bộ môn. Nhân dịp này tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa, các
thầy cô trong Khoa Nông học, Viện đào tạo Sau đại học - Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội đã dạy dỗ và tạo
điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường.
Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ, anh chị em trong Bộ môn Bệnh học Phân tử Thực vật - Viện Di truyền
Nông nghiệp đã giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình công tác và nghiên cứu khoa học tại Bộ môn trong thời gian
vừa qua.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã nhiệt tình động viên giúp đỡ tôi trong quá trình học

High performance thin layer
chromatography
KAc Kalipotassium acetate
PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp
SDS Sodium lauryl sulfate
TLC Thin - layer chromatography
TE Tris- EDTA
7
màu sắc chủng nấm trên môi trường CAM để phát hiện chủng nấm A.
flavus sinh độc tố Aflatoxin 53
 !"#$%
&'()*+,-.'/0*A. flavus,1'2
345  67
8
4.9
DANH MỤC HÌNH
STT Tên hình Trang
2.1Chu kỳ của nấm A. flavus trên ngô vàng Error! Bookmark not defined.
2.2Cấu tạo vi thể của nấm Aspergillus flavus Link - Cơ quan sinh
sản gồm: bọng (vesicular); thể bình (metular); và bào tử (conidi) 11
2.3Mối quan hệ di truyền của một số loài nấm Aspergillus spp.Error!
Bookmark n
2.4Hình thái cuống sinh bào tử của nấm A.flavus và nấm A. oryzaeError!
Bookmark
2.5Màu sắc khuẩn lạc của các loài nấm Aspergillus spp. trên môi
trường nuôi cấy (PDA) Error! Bookmark not defined.
2.6
2.7
2.8 4.1B Thu nhận mẫu nấm A. flavus từ các mẫu, A: Ngô; B: Đậu tương
2.9 trên môi trường PDA đặcError!

2.20 Sản phẩm PCR được nhân lên từ ADN tổng số các chủng A.
flavus được phân lập từ các mẫu Gạo, phân tích trên gel Agarose 1%
với các cặp mồi: A: mồi ver-1; B: mồi omt-1; C: mồi nor-l\ D: mồi
apa-2 nhân các đoạn genError! Bookmark not defined.
2.21 Mật độ xuất
hiện của ba, hai và một gen trong phản ứng PCR đặc hiệu với các cặp mồi riêng rẽ,
sử dụng khuôn là các mẫu ADN nấm A. Jlavus 48
2.22 H
ình ảnh điện di sản phẩm khuyếch đại Multiplex PCR của các mẫu
nấm A. flavus phân lập từ các mẫu Đậu tương trên gel agarose 1%:
M: marker; 1-4: A.flavus Hà Nội; 4 - 8: A.jlavus Thanh Hoá; 9: đối
chứng A. niger chuẩn
54
2.23 Hình ảnh điện di sản phẩm khuyếch đại Multiplex PCR của các mẫu nấm A.
flavus phân lập từ các mẫu Ngô trên gel agarose 1%:
2.24 M: marker; 1 -
11: A. flavus Thanh Hoá ; 12 - 15: A. jlavus Hà Nội; 16: đối chứng A. nỉger chuẩn 54
2.25 Hình ảnh điện di sản phẩm khuyếch đại Multiplex PCR của các mẫu nấm A.
flavus phân lập từ các mẫu Gạo trên gel agarose 1%:
2.26 M: marker; 1 - 5: A. flavus Sơn La ; 6 - 11 : A. jlavus Hà Nội ;
2.27 12: đối chứng
A. niger chuẩn 54
4.15 Hình ảnh điện di sản phẩm khuyếch đại Multiplex PCR
của các mẫu nấm Ả. flavus phân lập từ các mẫu Lạc trên gel
agarose 1%:
2.28 M: marker; 1 - 5: A. flavus Nghệ An ; 6 - 10: A. flavus Hà Nội;
2.29 11-14:A.
flavus Hải Dương; 16: đối chứng A. niger chuẩn 54
4.16 Tần số xuất hiện các tổ họp gen được nhân lên trong phản ứng
2.30 Multiplex

hiện nhanh, nhậy, chính xác nấm Aspergillus sinh độc to Aflatoxin. Ngoài ra,
phương pháp PCR còn có thể phát hiện được chủng nấm Aspergillus lây nhiễm
[40].
2.37 Phương pháp chẩn đoán sử dụng kỹ thuật PCR được dựa trên kết
quả nghiên cứu hệ gen nấm Aspergillus sinh độc to Aflatoxin và con đường
sinh tổng hợp Aflatoxin. Các nghiên cứu cho thấy, ít nhất có 20 gen tham gia
1
3
vào con đường sinh tổng hợp Aflatoxin, bốn gen quan trọng là ver-1, omt-1,
nor-1 và apa-2 đã được công bố trình tự nucleotide và chức năng gen. Trình tự
nucleotide của các gen này là cơ sở để sinh tổng hợp các cặp mồi đặc hiệu cho
phản ứng PCR sử dụng sợi khuôn là ADN tổng số tách chiết từ sợi nấm hoặc
các mẫu xét nghiệm.
2.38 Điều kiện thời tiết Việt nam được xem là môi trường lý tưởng cho
sự sinh trưởng và phát triển của nấm Aspergillus. Điều này dẫn đến hàm lượng
và tỷ lệ nhiễm Aflatoxin ữên nông sản Việt Nam là ở mức cao trong khu vực
và đây là một trong những nguyên nhân quan ữọng dẫn đến giá trị nông sản
xuất khẩu của Việt nam rất thấp. Thực tế thì đã có nhiều lô hàng nông sản xuất
khẩu của nước ta như: lạc, đậu tương đã bị trả lại do phát hiện độ nhiễm
Aflatoxin cao quá mức cho phép. Vì vậy, việc nghiên cứu phát triển các
phương pháp chẩn đoán sớm nấm Aspergillus sinh độc to Aflatoxin có ý nghĩa
cực kỳ quan trọng trong việc hạn chế lây lan và giảm thiểu tác hại của nấm.
Phương pháp phát hiện mầm bệnh nấm Aspergillus sinh độc tố Aflatoxin bằng
kỹ thuật PCR chưa được nghiên cứu ở Việt nam. Với mục tiêu xây dựng
phương pháp chẩn đoán sớm, nhanh và nhạy góp phần làm giảm thiểu tác hại
của nấm Aspergillus trong sản xuất nông nghiệp và tăng giá trị nông sản xuất
khẩu của Việt nam ừên thị trường thế giới, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề
tài: "Nghiên cứu phương pháp chẩn đoán nấm bệnh Aspergillus flavus sinh
độc tố Aílatoxin bằng kỹ thuật PCR" với các mục tiêu chính như sau:
- Thu thập và phân lập các chủng nấm A. flavus trên một số nông sản (lạc,

gan và trong sữa của những bà mẹ có con bị xơ gan. Như vậy, theo ông giữa
xơ gan và Aflatoxin có một mối quan hệ khá chặt chẽ với nhau [3].
2.43 Ở Thái lan, năm 1967 nhóm nghiên cứu của Shank cho thấy các
1
5
mẫu lương thực thực phẩm bị mốc thì 50 - 60% số mẫu đó có Aflatoxin. Đồng
thời nhóm tác giả này tiến hành trên thức ăn gia đình (lấy mẫu lương thực thực
phẩm tại các gia đình) cũng thấy có 30 - 50% số mẫu có độc tố Aflatoxin.
Payet và cs (1966) cho biết ở Xênêgan nhiều trẻ em dưới 1 năm tuổi được ăn
70-140 g lạc/ngày trong 10 tháng liền để điều trị bệnh Kwashuovkov. Những
mẫu lạc này sau đó phát hiện có chứa 500 - 1000 ppb Aflatoxin BI. Như vậy
trung bình một ngày một trẻ em đã phải ăn từ 35 - 140 ppb. Hai đứa trẻ trong
số này mắc bệnh gan sau 4-6 năm. Những người công nhân làm việc trong dây
chuyền chế biến lạc có thể nhiễm Aflatoxin qua hô hấp. Một kỹ sư hóa chất
phụ trách khâu hấp tiệt trùng bột lạc bị chết và đã phát hiện được Aflatoxin BI
trong tế bào phổi [22].
2.44 Ở Hà Lan, những công nhân làm việc ở nhà máy ép dầu lạc có thể
tiếp nhận từ 0,039 ppb tới 2,5 ppb Aflatoxin trong một tuần lễ làm việc (Van
Nieweenhuize, 1973). Theo Baxter và cs (1981) có sự nguy hiểm khi tiếp xúc
với bụi lạc hay các sản phẩm nông nghiệp khác có chứa Aflatoxin, tuy mức độ
nguy hiểm chưa được xác nhận [1].
2.45 Theo thống báo của tổ chức nông lương thế giới (FAO), tổn thất
hàng năm ước tính khoảng 12 - 15 % ữên toàn thế giới, trong đó 25% nông sản
của toàn thế giới bị nhiễm các độc tố nấm mốc. Vì vậy, phòng chống độc tố
nấm mốc là vấn đề hết sức quan trọng trong sản xuất nông nghiệp và được các
nước trên thế giới đặc biệt quan tâm [3,4],
2.46 Ở Philippin các sản phẩm công nghiệp dùng làm thức ăn như lạc,
gạo, đậu tương và cà phê cũng được xác định là nhiễm Ẩ. ýlavus và độc tố
Aflatoxin ở các mức độ khác nhau và được thể hiện ở Bảng 2.1 [1],
2.47 Bảng 2.1 Sự có mặt của A. flavus và Aflatoxin ờ các mẫu lạc (từ 1967-

2.7 Lạc ở trại, bảo
quản
2.8 1
2.9 257
2.10 trong các chum,
kho
8 88
2.13 Lạc đã bóc vỏ
từ các
2.14 45 2.15 964
2.16 kho nông trại
8B 8C
2.19 Lạc còn trong
vỏ
2.20 25 2.21 0
2.22 Nhân lạc bóc vỏ
lụa
2.23 90 2.24 114
886
1
7
phải Aflatoxin có trong thực phẩm, đặc biệt là ngô nhiễm hàm lượng cao đáng
được quan tâm hơn lạc. Mặc dù lạc nhiễm Aflatoxin nhiều hơn ngô, nhưng
người ta chỉ ăn lạc với lượng nhỏ, trừ một số nước ăn lạc khá phổ biến như
Môdambic, Xênêgan, Xuđăng [1,3]
2.52 Những nghiên cứu của Ablas K. và cộng sự (2004) cho thấy sự
nhiễm Aflatoxin trên ngô do nấm A. jlavus gây nên là một vấn đề quan trọng ở
các vùng ữồng ngô của đồng bằng Missisipi của Mỹ. Trong 3 năm nghiên cứu
từ 2000 đến 2002, các tác giả đã nghiên cứu mức nhiễm A. flaws trong đất và
đã xác định rằng mức nhiễm A. Jlavus trong đất trồng ngô bị ảnh hưởng bởi

mốc gây hu hỏng, thối rữa, làm hỏng, giảm chất luợng và giá trị sử dụng còn
có rất nhiều loài nấm mốc tiết ra độc tố gây bệnh cho con nguời. Chính vì tác
hại của độc tố này gây nên với con nguời nên nhiều nuớc phát triển trên thế
giới nhu: Mỹ, Nhật Bản, các nuớc Eư, khi nhập luơng thục, thục phẩm nhu:
ngô, lạc, cà phê, chè, đã đua ra khung giới hạn về hàm luợng về Aflatoxin
phải ở duới mức cho phép. Thục tế thì đã có nhiều lô hàng nông sản xuất khẩu
của nuớc ta nhu: lạc, đậu tuơng đã bị trả lại do phát hiện độ nhiễm Aflatoxin
cao quá mức cho phép. Vì vậy, việc nghiên cứu phát hiện sớm và nhanh nấm
Aspergillus spp. sinh độc to Aflatoxin đang đuợc đặc biệt quan tâm nghiên
cứu. Mức độ nhiễm Aflatoxin trên ngô và một số tỉnh miền Nam và Bắc Việt
nam cho thấy tần xuất nhiễm Aflatoxin giao động từ 73,3% đến 95,8% trong
đó hàm luợng Aflatoxin trung bình cao nhất là 63,8 ppb và hàm luợng
Aflatoxin trung bình thấp nhất là 16,25 ppb đối với các tỉnh khác nhau [3, 4 ].
2.55 Ở Việt Nam, Đậu Ngọc Hào và các cộng sự đã nghiên cứu mức độ
2.56 nhiễm nấm mốc và Aflatoxin trên ngô của các tỉnh Sơn La và Thanh
Hóa. Kết quả phân tích của 24 mẫu ngô hạt và 24 mẫu ngô bột cho thấy các
mẫu này đã bị nhiễm Ả. flavus với tần số cao, từ 50 - 80 %. Các loài khác như
1
9
Ả. gỉacus, Ả. fumigatus và A. Candidas cũng nhiễm với tỷ lệ khá cao. Loài A.
ochraceus đã được phát hiện thấy ở tỷ lệ thấp. Các loài thuộc chi Fusarium đã
nhiễm với tần suất 15%. Kết quả nghiên cứu mức nhiễm Aflatoxin những mẫu
ngô trên đã cho thấy 33% số mẫu ngô hạt đã bị nhiễm Aflatoxin Bi từ 10 - 40
ppb, 83 % số mẫu bị nhiễm Aflatoxin B
2
từ 10 - 20 ppb, 72% mẫu ngô bột đã
bị nhiễm Aflatoxin Bi từ 25 - 250 ppb ; 9,5% số mẫu ngô bị nhiễm Aflatoxin
B
2
từ 10-20 ppb [1,3].

khu vực trung tâm có màu vàng nhạt, rìa mép màu trắng mịn. Sau 48 giờ hình
thành nhiều bào tử miền trung tâm, xuất hiện các khối bào tử chin, màu vàng
nhạt đã chuyển sang màu vàng lục. Từ 72 - 96 giờ, khuẩn lạc phát triển mạnh
và đạt cực đại ở ngày thứ 6-7 khi nuôi cấy ở nhiệt độ phòng. Khuẩn lạc có kích
thước tới 4 - 5 cm, hình thành nhiều vòng tròn đồng tâm đều đặn, thường có 5
- 6 vòng tròn màu xanh lục trên bề mặt khuẩn lạc, rất dễ phân biệt với nhiều
loại nấm mốc khác. Quan sát đặc điểm vi thể dưới kính hiển vi ở bội số thấp
(XI6) cũng có thể phân biệt được do cơ quan sinh sản của loại nấm này rất
phong phú. Cơ quan sinh sản có hình hoa cúc. Bọng tròn có kích thước từ 25 -
45 pm, giá conidi (conidiophores) (cuống sinh bào tử) mọc thẳng từ sợi xù xì
có kích thước từ 400 - 1000 pm; rộng 5-15 pm. Bào tử trần (conidi) hình tròn
hoặc hình ovan, có đường kính từ 2 - 4 pm. Thể bình có hai lớp, kích thước từ
10 - 15 pm và 3 - 5 pm, đôi khi chỉ có 1 lớp [1, 12].
2.2.2 Phân biệt A. Jlavus trong nhóm A.flavus oryzae.
2.60 Trong nhóm A. flavus oryzae có 5 loài gồm A. oryzae Cohn, A. flavus
2.61 Link, A. parasiticus Speare, A. micro virido citrinus Constantin Lucet, và
A. effuses Tiraboschi. Cả 5 loài này rất dễ nhầm lẫn với nhau về hình thái học,
về màu sắc điển hình trên môi trường nuôi cấy: loài A. oryzae Cohn được sử
2
1
dụng rộng rãi trong công nghiệp lên men đậu tương, trong công nghiệp sản
xuất các men (enzym) phục vụ cho công nghiệp lên men rượu bia, sản xuất
thức ăn chăn nuôi, do vậy cần phải được phân biệt để tránh nhầm lẫn với hai
loài A. flavus và A. parasiticus sản sinh độc tố Aflatoxin. Cả 5 loài này rất phổ
biến trên phạm vi toàn thế giới và chiếm phần đông trong họ Aspergillus.
Chúng được biết đến do sự có mặt ở nhiều loại cơ chất khác nhau. Trong công
nghiệp lên men của các nước phương Đông: ngũ cốc, sản phẩm chế biến từ
lương thực như bánh mì, mì sợi, hàng hoá làm bằng da, thịt, sản phẩm từ
trứng, sữa, đậu tương, nước hoa quả, rau quả, hàng dệt, giấy, từ côn trùng,
phân rác, từ phổi của chim, từ ruột của bệnh nhân Chúng còn có thể tìm thấy

furanocouramin, là sản phẩm ừao đổi chất tạo bởi nấm Á. flaws và A.
Hình 2.2 Cấu tao vi thể của nấm
Aspergillus flavus Link - Cơ quan
sinh sản gồm: bọng (vesicular); thể
bình (metular); và bào tử (conidỉ).
2
3
2.65 parasiticus. Hiện có khoảng trên 16 loại độc tố Aflatoxin đã được tìm thấy, có
kí hiệu Bi, B
2
, GI, G
2
, MI, M
2
, PI, Qi, được phân biệt trên đặc tính lý hóa và độc
tính của chúng [1],
2.66 Các Aflatoxin Bi, B
2
và Gi, G
2
đã được nhiều phòng nghiên cứu xác
định cấu trúc hoá học. Thoạt đầu các nhà hoá học đã xác định có hai Aflatoxin có
công thức CI
7
HI
2
0
6
và CI
7

2
tồn tại ở nồng độ thấp hơn.
Hình 2.6 Cấu trúc hoá học của Aílatoxỉn (Jones, 1977).
2
5