Bộ y tế
Viện dinh dỡng
^\[]
báo cáo kết quả đề tài nghiên cứu khcn Khảo sát ô nhiễm nấm mốc A. flavus
và định lợng độc tố Aflatoxin bằng kỹ
thuật ELISA trong một số thực phẩm
tại Hà Nội
Chủ nhiệm đề tài : BS. Nguyễn Lan Phơng
Đơn vị chủ trì : Khoa Thực phẩm & VSATTP
Cơ quan chủ quản : Viện Dinh Dỡng
Thời gian thực hiên : Năm 2006


Điện thoại: 049717090
6. Bộ, địa phơng chủ quản: Bộ Y Tế
Địa chỉ:138A Giảng Võ - Ba Đình - Hà Nội
Điện thoại:
7. Tổng kinh phí: 30.000.000,00đ (Ba mơi triệu đồng)
Trong đó, từ ngân sách Nhà nuwớc: 30.000.000,00đ (Ba mơi triệu đồng)

8. Thời gian thực hiện: Bắt đầu tháng 7/2006 Kết thúc tháng 12/2006
9. Chủ nhiệm đề tài : Nguyễn Lan Phơng Bác sỹ CK Vi sinh
Địa chỉ liên hệ : Labo vi sinh Khoa Thực phẩm &VSATTP
Điện thọai: 049716294

10. Danh sách cá nhân tham gia nghiên cứu

H
ọ và tên
Học hàm /học vị
Hà Thị Anh Đào PGS -TS, Dợc sỹ
Nguyễn Lan Phơng Bác sỹ
Phạm Thanh Yến Bác sỹ
Bùi Thị Mai Hơng Thạc sỹ, Bác sỹ
Nguyễn ánh Tuyết
Cử nhân 3

11. Bảo mật thông tin
A. Phổ biến rộng rãi B. Phổ biến hạn chế C. Không phổ biến


4
Bộ ytế
Viện dinh dỡng
^\[] báo cáo

Đề tài

Khảo sát ô nhiễm nấm mốc A. flavus
và định lợng độc tố Aflatoxin bằng kỹ
thuật ELISA trong một số thực phẩm
tại Hà Nội
Chủ nhiệm đề tài : BS. Nguyễn Lan Phơng
Đơn vị chủ trì : Khoa Thực phẩm & VSATTP
Cơ quan chủ quản : Viện Dinh Dỡng
Cán bộ phối hợp : Ths. Bùi Thị Mai Hơng

3.1. Đối tợng nghiên cứu 20
31.1. Địa điểm nghiên cứu 20
3.1.2. Thời gian nghiên cứu 20
3.1.3. Đối tợng nghiên cứu 20
4.2. Phơng pháp nghiên cứu 20
3.2.1. Thiết kế và phơng pháp nghiên cứu 20
3.2.2. Cỡ mẫu nghiên cứu 20
3.2.3. Cách thu thập mẫu 20
3.2.4. Phơng pháp phân tích 21
3.2.4.1. Phơng pháp xác định A. flavus trong ngũ cốc 21
3.2.4.2. Phơng pháp định lợng aflatoxin trên ELISA bằng
kít phát hiện độc tố Veratox- HS 22
3.3. Đánh giá kết quả 24
3.4. Xử lý số liệu 24
4. Kết quả nghiên cứu 26
4.1. Kết quả khảo sát ô nhiễm nấm mốc A. f lavus 26
4.1.1. Thực trạng nhiễm nấm mốc chung ở các mẫu phân tích 26
4.1.2. Một số loại nấm mốc nhiễm của từng nhóm hạt ngũ cốc
26
4.1.3. ô nhiễm mốc trong ngô, lạc, gạo trên địa bàn các quận 26
4.2. Kết quả định lợng Aflatoxin trên máy ELISA 27
4.2.1. Xác định khoảng tuyến tính và đờng chuẩn 27
4.2.2 Giới hạn về định lợng và phạm vi định lợng 28

6
4.2.3 Độ thu hồi của kỹ thuật 29
4.2.4 Kết quả định lợng Aflatoxin của các mẫu trên ELISA 29
5. bàn luận 32
6. Kết luận 34
7. Kiến nghị 35

CDC Centers for disease control and prevention(Trung tâm kiểm soát và
phòng chống bệnh dịch)
FAO Food Agriculture Organization (Tổ chức thực phẩm và nông nghiệp
của Liên hợp quốc)
ASEAN
Association of Southeast Asian(Hiệp hội các quốc gia Đông Nam á)
QĐ-BYT
Quết định Bộ y tế
ELISA Enzyme Linked Immuno- Sorbent - Assay
HS High Sensitivity
HPLC
High Performance Liquid Chromatography(Sắc khí lng cao áp)
TLC Thin Layer Chromatography(sắc ký lớp mỏng)
TCN Tiêu chuẩn ngành
TQTP Thờng qui thực phẩm
VSATTP Vệ sinh an toàn thực phẩm
VSTP Vệ sinh thực phẩm
VSV Vi sinh vật
WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)
TTYTDP Trung tâm Y tế dự phòng
ppb Microgam/kilogam
Afla.(TS)

Aflatoxin(tổng số)
A. flavus Aspergillus flavus
Tp. HCM Thành phố Hồ Chí Minh
OD Optical Density(Mật độ quang)

mạch và sinh ra độc tố. Có nhiều loại độc tố vi nấm nhng Aflatoxin là một độc tố
đáng sợ nhất và nấm Aspergillus flavus là loài cung cấp lợng Aflatoxin chủ yếu.
Aflatoxin nhiễm vào trong các nông sản, thức ăn gia súc, ngời và gia súc ăn
phải thức ăn nhiễm Aflatoxin, độc tố này sẽ tích lũy ở một số cơ quan trong cơ thể
gây nhiễm độc gan, thận, xuất huyết đờng tiêu hoá, ung th gan. Các điều tra cho
thấy có sự tơng quan giữa hàm lợng Aflatoxin trong thực phẩm và số bệnh nhân
ung th gan ở nhiều nứơc nh
Thái Lan, Uganda, Kenya, malaysia, Nhật Bản,
Philippin[1]. Tại ấn Độ và nhiều nớc Châu Phi ngời ta còn nhận thấy những trẻ em
đợc nuôi dỡng kém thờng đễ bị nhiễm và tích luỹ Aflatoxin cao trong gan do ăn
nhiều bột lạc, ngô, đậu, hạt có dầu, thực phẩm lên men bị nhiễm nấm mốc[2].
ở Việt nam trong khi các bệnh truyền nhiễm đang từng bớc đợc đẩy lùi thì các
bệnh do ăn phải các loại thực phẩm có độc nói chung và độc vi nấm nói riêng lại có
chiều gia tăng. Hiện nay cha có thống kê nào nói lên số ngời bị ngộ độc vi nấm
nhng những liên quan của Aflatoxin với đời sống sức khoẻ cộng đồng đã đợc đề
cập đến. Các nhà khoa học cũng đã khuyến cáo phải đặc biệt chú ý đến tới lạc, ngô,
gạo và các sản phẩm chế biến từ chúng bởi rất dễ bị ô nhiễm nấm mốc và độc tố
Aflatoxin.
Nông sản, thực phẩm không chỉ sử dụng cho tiêu dùng nội địa mà còn cho xuất
khẩu. Một số thị trờng nớc ngoài thờng xuyên giám định lô hàng và loại bỏ các
chuyến hàng có hàm lợng độc tố vi nấm cao hơn 2-10ppb. Vì vậy nên nhu cầu kiểm
tra lợng Aflatoxin trong các sản phẩm ngày càng cao.
Để xác định hàm lợng độc tố Aflatoxin trong thực phẩm rất cần thiết phải lựa
chọn một phơng pháp phù hợp trong điều kiện kiểm tra nhanh, chính xác đối với
từng cơ sở, labo. Khá nhiều nớc đã chọn phơng pháp Sắc ký lỏng cao áp (HPLC),

9
là phơng pháp chính thức đợc chấp nhận trên toàn cầu[3]. Ngoài ra phơng pháp
Sắc ký lớp mỏng (TLC)
cũng đợc lựa chọn khi phòng thí nghiệm không đợc trang

Mục tiêu nghiên cứu
1. Xác định mức nhiễm nấm mốc A. flavus trong một số mẫu thực phẩm tại Hà
Nội
2. Định lợng độc tố Aflatoxin(tổng số) trong mẫu nhiễm nấm mốc A. flavus
bằng kỹ thuật ELISA
10
2. Tổng quan tình hình nghiên cứu
2.1.Vai trò của nấm mốc
Trong thế giới của nấm có nhiều loài nấm lớn và nấm nhỏ(vi nấm). Những nấm
ăn đợc là nguồn dinh dỡng quý và hơng vị đặc trng chỉ có nấm mới có. Chúng
có nhiều ý nghĩa trong nền kinh tế cùng nh trong lĩnh vực làm thức ăn. Nấm mọc
hoang dã hoặc nuôi trồng đều có hàm lợng protein, vitamin và chất khoáng cao.
Nhng cũng có loài sinh ra độc tố gây ra nỗi kinh hoàng cho ngời.
Nấm mốc thuộc vi nấm là loài thực vật không có chất diệp lục, nên chúng chỉ
sống đợc nhờ có hệ sợi bám vào các chất hữu cơ. Hệ sợi của nấm mốc có một số ăn
sâu vào cơ chất gọi là khuẩn ti dinh dỡng, một số mọc ra ngoài bề mặt cơ chất gọi
là khuẩn ti khí sinh. Một số sợi của khuẩn ti khí sinh dần dần sẽ phát triển thành cơ
quan sinh sản đặc biệt mang bào tử. Màu sắc của bào tử sẽ đặc trng cho màu của
nấm mốc khi già.
Nấm mốc phổ biến rộng trong tự nhiên, là một nhóm rất lớn, ngời ta thờng xếp
vào loại vi sinh vật. Chúng mọc trên cơ chất dinh dỡng và tạo thàng lớp lông mợt
có màu sắc khác nhau. Nhiều loài nấm mốc có ý nghĩa công nghiệp, ngợc lại nhiều
nấm mốc làm hỏng thực phẩm và hàng công nghiệp, làm thay đổi rất nhiều thành
phần hoá học của cơ chất và thải ra sản phẩm trao đổi chất. Sản phẩm trao đổi chất

trong sữa
U gan

Aspergillus
ochraceus
Hạt ngũ cốc,cà
phê, thịt hun khói
Ochratoxin

Fusarium
graminearum
Hạt ngũ cóc và sản
phẩm chế biến
Độc tố ở dạng thiên
nhiên
Buồn nôn, gây nôn
trên lợn
Fuarium
sporotrichoides
Hạt ngũ cóc và sản
phẩm chế biến
Fusariogenin
Gây bệnh giảm
bạch cầu
Penicilium
citrovirid
Gạo
Citreoviridin,
citrinin
Kích ứng da, độc

thức ăn do độc tố của một số chủng vi nấm, gây tử vong cho hàng loạt ngời và gia
súc. Thời kỳ đầu của thế kỷ XX tại ấn Độ đã xảy ra nhiều vụ ngộ độc do nguyên
nhân nhiễm mốc. Có bệnh sơ gan trẻ em, một bệnh đã lan rộng trên lục địa ấn Độ và
đợc xác định có liên quan tới độc tố vi nấm. ở miền Tây nớc này có một vụ dịch
viêm gan ở cả ngời và chó nguyên nhân đợc xác định là do ăn ngô mốc[2]. Có
những gia đình bị mắc bệnh sau 2-3 tuần ăn ngô mốc và chết cả nhà. ở Triều Tiên
một số tù binh bị viêm gan do ăn phải thực phẩm bị nhiễm mốc, nhiều trờng hợp gia
súc bị ngộ độc do ăn cỏ khô bị mốc, Ngựa bị thần kinh, choáng váng, khó thở, viêm
não chảy máu, gan thận bị h do ăn phải ngũ cốc bị mốc và đợc ghi nhận là độc tố
vi nấm[1,2].
Các tác hại của độc tố nấm có thể là gây ngộ độc cấp tính, mạn tính ngăn cản hệ

12
thống miễn dịch, gây suy giảm các chức năng của cơ thể và gây nên bệnh ung th.
Aflatoxin là nguyên nhân gây ung th nguyên phát ở ngời, gây nên một số bệnh
mạn tính nh xơ gan, viêm dạ dày mạn tính, gây nhiễm độc gen Ngời ta cũng phát
hiện về mối liên quan sau: Những vùng ăn nhiều gạo mốc có tỷ lệ ngời mắc và có
tổn thơng gan cấp và mạn tính, đặc biệt là các chứng xơ gan và ung th gan xơ
nhiễm nhiều hơn so với các vùng khác. Theo thống kê của một số tác giả những nớc
có đời sống cao nh Châu u, với điều kiện khí hậu lạnh khô thì tỉ lệ ung th gan do
Aflatoxin thấp hơn nhiều so với các nớc có đời sống thấp v khí hậu nóng ẩm.
Tác động của độc tố vi nấm đến ngời sản xuất, chế biến là phải gánh chịu sản
lợng thấp, sản phẩm không tiêu thụ đợc, mất thị trờng, mất phí giám sát và xét
nghiệm, phí kiện tụng - Ngời tiêu dùng thì phải chịu thực phẩm kém dinh dỡng,
ngộ độc thực phẩm cấp hoặc mạn, giảm thu nhập do nghỉ việc vì ốm bệnh. Hậu quả
gây hại của Mycotoxin trên động vật là sự chuyển hoá thức ăn kém, tốc độ tăng
trởng thấp. Đối với gia cầm giảm chất lợng thịt, giảm 50% tỷ lệ phát triển, đẻ ít
trứng và trứng bé hơn, giảm khả năng chống đỡ bệnh tật, từ đó làm giảm tính cạnh
tranh của ngành chăn nuôi trên thị trờng quốc tế.
Nhiễm Mycotoxin sẽ gây tổn thơng gan, thận, túi mật, tác động lên tim, tuần

sinh độc tố vi nấm rất phổ biến và nguy hiểm. Loại độc tố vi nấm chiếm vị trí quan
trọng nhất trong khu vực ASEAN là Aflatoxin, đợc xem nh là một chất gây ung th
nguyên phát và đợc nhiều ngời biết đến, nó liên quan tới sức khoẻ ở cả con ngời
và động vật[5].
Một số bệnh ngộ độc do nấm mốc
Hội chứng
chủ yếu
Nấm gây
bệnh
Cơ chất Độc tố Động vật cảm
thụ
Bệnh độc tố
gan
Aspergillus
flavus
Hạt, bột hạt có
dầu,khô dầu
Các Aflatoxin
Ngời, lợn, trâu,
bò, gà tây, vịt,
ngỗng, trĩ, chó,
Bệnh độc tố
thận
Penicilium
citrium
Lạc, gạo, ngô,
mạch, lúa mỳ
Xitrinin
Lợn, ngời
Xuất huyết

2
, có thể tìm thấy trong sữa và các sản
phẩm sữa từ những con vật nuôi ăn phải thức ăn bị nhiễm Aflatoxin. Ngộ độc thực
phẩm do độc tố nấm xảy ra trong điều kiện nhiệt độ và độ ẩm thích hợp để nấm mốc
phất triển.
Độc tố vi nấm trong nông sản dù có nhiễm từ trớc thu hoạch nhng vẫn tiếp

14
tục phát triển mạnh trong giai đoạn sau thu hoạch, các nghiên cứu cho thấy tỉ lệ ô
nhiễm này tăng nhanh hơn ở giai đoạn bóc vỏ, và sấy khô. Giới hạn 20 mcg/kg là dễ
đạt đợc ở ngày thứ hai sau thu hoạch khi mà hàm lợng độ ẩm của ngũ cốc ở vào
khoảng 26 -53%[7]. Sự gia tăng độc tố vi nấm vẫn tiếp tục, thậm chí cả sau khi đã
sấy khô tuỳ thuộc vào độ ẩm khác nhau ở từng loại ngũ cốc. Ngời nông dân thờng
phơi hoa màu dới ánh nắng mặt trời, thời gian phơi khô phải 48 giờ, nếu trời ma,
đặc biệt là ma phùn, độ ẩm cao, thiếu ánh nắng mặt trời, rất dễ tạo điều kiện phát
triển nấm mốc.
Trong kinh doanh thờng có một khối lợng lớn thóc, gạo, ngô, lạc, cà phê
đợc chất đống cha kịp làm khô để bao gói, đó là cơ hội để tạo ra nấm mốc.Trong
bảo quản ngũ cốc khi để độ ẩm 15 -18% trở lên là điều kiện thích hợp để hình thành
Aflatoxin. Bảo quản ngũ cốc ẩm trong túi nhựa hoặc để trên sàn kho hơn 10 ngày
cũng là điều kiện để nấm mốc phát triển.
2.4. Độc tính của Aflatoxin
2.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới:
Độc tố Aflatoxin, nó là nguyên nhân gây ra 10.000 trờng hợp tử vong hàng năm ở
các nớc có hệ thống kiểm soát nghèo nàn(J.I.Pitt,2004). Hoa kỳ đã đóng góp nhiều
bài nghiên cứu chung về nấm mốc độc nhng vẫn dành phần chủ yếu cho các đề tài
nhiễm độc do A. flavus và Aflatoxin gây ra.
Từ năm 1960 khi xảy ra hàng loạt gà tây ở Anh chết do ăn lạc mốc nhập từ
Brazin, các nhà khoa học lúc đó không xác định đựơc nguyên nhân và phát hiện
trong gan của gà tây bị nhiễm độc tố và đợc đặt tên là Aflatoxin. Năm 1961 ngời

giảm trung bình 80% v aflatoxin B
2
giảm 60%. Nh vậy lạc mốc dù
đợc rang ở nhiệt độ cao, ăn vo vẫn nguy hiểm.
Aflatoxin tác động có thể gây đột biến gen tế bào động vật, ngoài ra còn gây rối
loại tổng hợp ADN. Xảy ra quá trình đột biến phần lớn là tế bào gan, sau đến tế bào
thận. Tại một nghiên cứu ở Trung Quốc lấy mẫu nớc tiểu kiểm tra tình trạng tích luỹ
trong cơ thể đã xác định Aflatoxin có thể xem là chỉ số đánh dấu sinh học trong nớc
tiểu xác định nguy cơ gây ung th nguyên phát [8]. Theo cơ quan bảo vệ môi trờng
toàn cầu tại 16 nớc: úc, áo, Brazin, Canada, Guatemala, Đức, ý, Nhật, Kenia,
Mexico, Hà Lan, Thuỵ Điển, Thuỵ Sỹ, Anh, Mỹ, Liên Xô cũ đã thông báo sự nhiễm
Aflatoxin trong thực phẩm là nghiêm trọng và thờng tập trung vào một số sản phẩm
ngũ cốc và hạt có dầu nh: ngô, lạc, đậu đỗ, cà phê v.v[1].
ở Liên xô cũ đã thành lập một tổ chức chuyên nghiên cứu về độc tố vi nấm, Nhật
bản lại chủ yếu quan tâm đến nấm mốc gây độc trên gạo, ở châu Âu ngời ta quan
tâm đến các bệnh độc tố nấm nói chung. Báo cáo của Stoloff năm 1985 cho biết mức
nhiễm Aflatoxin trong lạc khi nhập vào Mỹ thờng có d lợng trên 25ppb[8].
Hiện nay đã xác nhận có 6 loại dẫn xuất của Aflatoxin(B
1
, B
2
, G
1
, G
2
, M
1
, M
2
), có

. Mối nối đôi của cấu trúc AflatoxinB
1
rất

16
khôn
g
bền vữn
g
, sẵn sàn
g
nối với các chất khác sinh ra độc tố.
Trong 6 loại Aflatoxin thờng gặp nhất là nhóm Aflatoxin(B
1
,B
2
) và nhóm
Aflatoxin(G
1
, G
2
), đợc phân biệt trên cơ sở nhóm Aflatoxin (B
1
, B
2
) phát màu huỳnh
quang xanh lơ thẫm (Blue) còn nhóm Aflatoxin (G
1
, G
2
o
o
o o
o

OCH
3

OH

A
flatoxin M
1

A
flatoxin B
2
o o
o o
o

OCH
3A
flatoxin G
1
o
o
o o
o

OCH
3A
flatoxin G
2

17

Xác định đợc lợng nhiễm Aflatoxin cho phép trong lơng thực, thực phẩm là rất

ăn gia súc
Ochrato
xinA trong
ngũ cốc
Autralia - 0,5 - - -
Canada - - 20 - 20
Codex - 0,5 - - -
EU 4 2 0,05 - 5 -
Hàn Quốc - 10 0,5 - 10 -
Philippin 20 20 - - - -
Indonesia 20 - - - - -
Thailand 20 - - - - -
Malaysia 35 - - - - -
Singapo 5 - 0,5 - - 2,5
Nhật - 10 - - 10 -
Mỹ 20 - 0,5 20 100 -300 -
Trung Quốc
-
20 ngô,
10 gạo
0,5 - - -
ở Mỹ không ăn nội tạng nên qui định để liều cao và để bảo vệ ngời tiêu dùng.
2.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nớc:
Phần lớn các mẫu ngô, lạc, đậu tơng, thức ăn chăn nuôi đem phân tích đều

18
nhiễm nấm mốc với nhiều mức độ khác nhau, tron
g
đó đa số nấm mốc có khả năn
g

25/30(83,3%), ở nhóm chứng là 2/20(10%)[12].
Độ ẩm lớn, thời gian ma kéo dài, đã tạo điều kiện cho nấm mốc độc phát triển
nhanh, bên cạnh đó việc bảo quản lơng thực thực phẩm của ngời dân nớc ta cũng
cha đợc chú trọng, càng làm tăng thêm sự ô nhiễm độc tố vi nấm. Điều tra của
Viện Dinh Dỡng (1992) nhận thấy tỉ lệ nhiễm Aflatoxin trên ngô bị mốc ở 2 miền
Nam Bắc khá cao từ 73,3% - 95.5%, với hàm lợng từ 16 -100ppb. Năm 1990 - 1995
Viện đã kiểm tra 387 mẫu lơng thực thực phẩm nhận thấy có 73 mẫu (19%) bị
nhiễm Aflatoxin và có 19 mẫu có hàm lợng vợt quá giới hạn cho phép[13]. Một
khảo sát của Cục An toàn vệ sinh thực phẩm trong vùng ngô, lạc tại Nghệ An cũng

19
cho thấy 243 mẫu sản phẩm có tới 90% mẫu có nhiễm Aflatoxin và 56/243 mẫu có
hàm lợng vợt quá giới hạn cho phép[14].
Hiện nay một số loại thực phẩm nhiễm độc tố vi nấm Aflatoxin vẫn đợc bán
cho ngời sử dụng, đó là do nhà sản xuất không loại bỏ đợc loại nguyên liệu đã
nhiễm Aflatoxin. Nghiên cứu của Nguyễn Xuân Mai, Từ Thị Hơng Viện Vệ sinh Y
tế Công cộng Tp. HCM về hệ nấm mốc và lợng Aflatoxin có trong bánh dầu đậu
phộng tại một số cơ sở sản xuất nớc chấm ở Tp. HCM cho thấy: Trong 10 mẫu dầu
đậu phộng và nớc tơng kiểm tra nồng độ Aflatoxin có từ 1-7.5 ppb[15]. Hàm lợng
này vẫn nằm trong giới hạn cho phép nhng điều quan trọng là quá trình tích tụ của
độc tố này trong gan khi hàm lợng độc tố vợt quá ngỡng cho phép sẽ gây ung th
gan. Nghiên cứu của Bùi Thanh Hà - Đỗ Thị Tính trong bệnh phẩm gan và dịch cổ
trớng ở những bệnh nhân ung th gan nguyên phát cho thấy 100% mẫu bệnh phẩm
gan có Aflatoxin nồng độ từ 1,1-3,1ppb và 100% mẫu dịch cổ trớng có Aflatoxin
nồng độ từ 0,7-1,7 ppb [16,17].
Trong quá trình sản xuất chế biến long thực, thực phẩm một số lợng ngũ cốc
đã bị loại ra do nhiễm Aflatoxin thì lại đợc dùng lại làm thức ăn cho gia súc, gia
cầm. Tại Viện Vệ sinh Y tế Công cộng 1998 - 2000 kiểm nghiệm 115 mẫu thực
phẩm có nguồn gốc ngũ cốc và các loại hạt có dầu thì tỉ lệ nhiễm độc tố vi nấm
Aflatoxin cao từ 30% - 67% đặc biệt ở thức ăn gia súc 94%[18].

Thời gian tiến hành đề tài từ 7/2006 đến 12/2006
3.1.3 Đối tợng nghiên cứu: 3 nhóm ngũ cốc
Bột gạo và bột mỳ, ngô và bột ngô, lạc và bột lạc
3.2. Phơng pháp nghiên cứu
3.2.1 Thiết kế nghiên cứu
Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả dựa trên một điều tra cắt ngang thực trạng
ô nhiễm nấm mốc và lợng độc tố Aflatoxin trong lạc, ngô, gạo mỳ từ tháng 7/2006
đến 12/2006
Phơng pháp nghiên cứu: Mẫu gạo mỳ, ngô, lạc đợc mua ngẫu nhiên trong một số
chợ của Hà Nội. Tại Labo Vi sinh Khoa Vệ sinh thực phẩm của Viện Dinh Dỡng, xác
định sự ô nhiễm nhiễm nấm mốc Aspergillus flavus của gạo mỳ, ngô, lạc theo TCVN
số 5166 - 1990 và số 52 TCN- TQTP 0001:2003, nuôi cấy phân lập tìm ra những mẫu
nhiễm nấm mốc A. flavus, sau đó định lợng độc tố Aflatoxin(tổng số) từ những mẫu
có nấm mốc a. flavus, A. parasiticus trên máy ELI SA bằng bộ kít thử Veratox-HS
aflatoxin của hãng NEOGEN (Mỹ).
3.2.2. Cỡ mẫu: Chọn mẫu ngẫu nhiên theo công thức:
n = z
2
p(1-p)/e
2

n: Là số mẫu phân tích, với độ

tin cậy là 90% -> z =1,64
p: Là tỉ lệ mẫu có a. flavus theo các nghiên cứu trớc khoảng 80%[14,15]
e: sai số 10% = 0,1
Mẫu tính toán: Theo công thức tính đợc 43 mẫu cho một nhóm thực phẩm
Tổng số mẫu: 43 mẫu/nhóm x 3 nhóm = 129 mẫu sẽ đợc phân tích tìm nấm A.flavus.
Sau khi xác định số mẫu có nấm A. flavus sẽ đợc lu giữ lại để định lợng độc tố
Aflatoxin(tổng số) bằng ELISA.

C/30 phút.
Mẫu đợc xay nhỏ, cân 25g cho vào 225 ml nớc thạch1
0
/
00
để pha loãng đồng
nhất đợc nồng độ1/10. Tuỳ mẫu có thể pha loẫng 1/100, 1/1000
Dùng pipet vô trùng hút chính xác 1ml mẫu thử cho vào hộp lồng vô trùng. Đun
chảy thạch Sabouraud, để nguội đến 45
0
C chỉnh pH của thạch đến 4,5 - 5,5 bằng
dung dịch axit lactic 20%. Rót vào hộp lồng12-15ml thạch, xoay đều trộn rồi để
các đĩa thạch đông tự nhiên sau đó đặt vào tủ ấm 28
0
C trong 5 ngày.
Đếm và ghi lại những đĩa có khuẩn lạc nghi ngờ là có nấm A.flavus, sau đó
dùng que cấy nhọn đầu lấy một ít bào tử cấy mấy điểm cách đều nhau trên đĩa
thạch Czapeck, ủ ấm 28
0
C trong 5 ngày, không lật ngợc đĩa.
Định danh nấm mốc A.flavus trên đĩa thạch Czapeck và lấy khóm nấm làm tiêu
bản và quan sát vi thể ở vật kính 10, 40: Khóm nấm mốc có đờng kính 3-5cm
trên thạch Czapeck sau 5 ngày, khóm nấm lúc đầu hơi vàng, sau trở nên xanh
lục hoặc vàng lục, đôi khi hoá nâu khi già. Nấm mốc A. flavus có vách cuống
conidi xù xì, có gai, bông lớn hình cầu, hình phóng xạ hoặc hình cột lỏng lẻo,
hình tia, bọng hình cầu đến gần cầu. Thể bình một hoặc hai tầng chủ yếu hai
tầng.

Nhận xét đại thể
Thạch Czapek / ủ
28 1
0
C/ 5 ngày Soi tiêu bản kính

Nhận xét vi thể

3.2.4.2. Phơng pháp định lợng aflatoxin(tổng số) trên ELISA bằng kít phát hiện
độc tố Veratox HS của hãng NEOGEN (Mỹ)
Kít phát hiện độc tố Aflatoxin Veratox - HS là một thử nghiệm miễn dịch trực tiếp
(ELISA), xác định lợng độc tố Aflatoxin(tổng số) trong các loại thức ăn và thực phẩm
có khả năng nhiễm Aflatoxin nh ngũ cốc, bột ngũ cốc, hạt có dầu, lạc tơi, lạc chiên,
bột lạc, ngô, bỏng ngô, lúa mì, bột mì, cà phê, milo
Thạch Sabouraud/ ủ
28 1
0
C/ 5 ngày

Thành phần bộ kít
Phần hoá chất
1. 48 giếng nhỏ có gắn kháng thể.
2. 48 giếng trộn đợc đánh dấu màu đỏ.
3. 5 lọ loại 1,5ml dán nhãn màu vàng từ 0, 1, 2, 4 và 8 ppb Aflatoxin.
4. 1 lọ loại 7ml dung dịch cộng hợp men Aflatoxin-HRP nhãn xanh da trời.
5. 1 lọ loại 24ml dung dịch cơ chất K-Blue nhãn xanh lá cây
6. 1 lọ, 32ml dung dịch dừng phản ứng nhãn đỏ.
7. Methanol Grade ACS.
8. Nớc cất hoặc nớc không bị ion hoá.
Phần dụng cụ
1. Xy lanh chia độ 250 m.
2. Bình đựng dung tích 125ml.
3. Giấy lọc Whatman # 1, ống tiêm lọc, phễu lọc, các ống tuýp để chứa mẫu.
4. Máy trộn tốc độ cao Waring kèm một bình loại 1lít.
5. Máy nghiền.
6. Cân với trọng lợng cân từ 5 -25gram.
7. Thiết bị đọc, kèm bộ đọc 650nm.
+

24
8. Pipet man 12kênh, Pipet man 100 àl và đầu côn.
9. Khăn giấy và giấy thấm.
10. Thiết bị hẹn giờ, bút kính, chai rửa dạng bóp bằng nhựa loại 250ml.
11. Đĩa hình thuyền để đựng thuốc thử phản ứng.
Chuẩn bị mẫu và các chiết xuất
Mẫu kiểm tra lấy theo kỹ thuật lấy mẫu đã đợc chấp nhận. Mẫu đợc tán nhỏ và
trộn đều trớc khi tiến hành. Giữ mẫu ở nhiệt độ từ 2- 8
0
C cho đến khi phân tích.

chuẩn. Từ mật độ quang của các mẫu sẽ tính chính xác lợng độc tố Aflatoxin(tổng số)
Một số đặc điểm về chất lợng kỹ thuật của bộ kít

25
- Giới hạn
p
hát hiện: 0.5
pp
b (đợc xác định bằn
g
bình
q
uân của 10 mẫu khôn
g
chứa
độc tố Aflatoxin, cộng với 2 độ lệch chuẩn)
- Giới hạn về định lợng: 1ppb là điểm thấp nhất trên đờng cong biểu đồ.
- Phạm vi định lợng: 1- 8 ppb(với các mẫu định lợng trên 8ppb sẽ phải pha loãng ra
truớc khi kiểm tra)
- Phạm vi áp dụng: Ngũ cốc, sản phẩm ngũ cốc, milo, lạc tơi, lạc chiên bơ, bột lạc,
bỏng ngô, gạo các loại hạt của cây lúa mì.
3.3. Đánh giá kết quả
Đánh giá kết quả mẫu kiểm tra có đạt tiêu chuẩn vệ sinh hay không căn cứ vào
các chỉ tiêu trong danh mục tiêu chuẩn vệ sinh đối với lơng thực, thực phẩm theo QĐ
số 867 của Bộ Y tế ban hành ngày 4/4/1998[19]
Giới hạn cho phép theo QĐ 867 của nhóm ngũ cốc, đậu đỗ[19]:
TT
Thực phẩm Chỉ tiêu
Số khẩn lạc cho phép
trong1g hay 1ml

0,5
3
Các độc tố vi nấmkhác Thức ăn 35
Khi kết quả vợt quá giới hạn cho phép theo bảng trên thì thực phẩm đợc xác định
là không đạt tiêu chuẩn vệ sinh (bị ô nhiễm)
3.4. Xử lý số liệu
Lu giữ và xử lý số liệu theo phơng pháp thống kê y sinh học thông thờng, sử dụng
phần mềm EXCEL, phần mềm Microplate Manager 5.1.

Trích đoạn khuyến nghị

---