

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Tiểu luận: Sinh viên thực hiện : Lê Hoàng Lâm
MSSV : 06126069

GVHD : PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải



PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ
Nước ta là một nước có nền nông nghiệp phát triển. Trong đó ngành chăn nuôi
đóng một vài trò quan trọng trong cơ cấu kinh tế của nền nông nghiệp. Giai đoạn 2001-
2006, ngành chăn nuôi có mức tăng trưởng bình quân 7-8%/năm; năm 2007 chỉ đạt 4,6%
và năm 2008 đạt 6%.Theo số liệu thống kê 01.10.2008, Việt Nam có gần 2,90 triệu con
trâu; 6,34 triệu con bò; 26,701 triệu con lợn; 247,320 triệu con gia cầm; 1,48 triệu con dê,
cừu; 121 ngàn con ngựa. T
ỷ trọng ngành chăn nuôi trong Nông nghiệp đạt 20-
24,5% giai đoạn 2001-2006, năm 2007 đạt 24,4% và năm 2008 đạt 27%. Bên cạnh đó
do vị trí địa lí , Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới, độ ẩm cao là điều kiện thuận
lợi cho một số dịch bệnh phát triển.
Trong số một số bệnh thường gặp, chúng tôi đặc biệt chú ý đến bệnh lở mồm long
móng. Đây là một bệnh thường x

2.1.Bệnh lở mồm long móng
2.1.1. Nguyên nhân:
Do virus thuộc giống Aphthovirus, họ Picornaviridae có 7 type virus gây bệnh lở
mồm long móng: O, A, C, S.A.T–1, S.A.T- 2, S.A.T- 3 và ASIA-1. Hiện nay ở nước ta
có 2 type gây bệnh là A, O và Asia-1.
2.1.2 Sức đề kháng của virus
- Virus có sức đề kháng mạnh. Ở 600C tồn tại 5-15 phút, ở 1000C virus sẽ chết,
từ 0-40C tồn tại 425 ngày, trong đất ẩm virus sống hàng năm, trong thịt ướp lạnh virus
tồn tại khá lâu trong phân virus tồn tại 7 ngày, nước tiểu virus tồn t
ại 39 ngày.
- Virus dễ bị tiêu diệt bởi các loại thuốc sát trùng của công ty ANOVA như: NOVA-
MC.A30, NOVACIDE, NOVADINE, NOVASEPT, NOVAKON và các loại khác như:
NaOH 1% diệt virus từ 1-10 phút, formol 2%, nước vôi từ 5-10%.
2.1.3. Phương thức truyền lây
- Bệnh lây qua đường tiêu hóa, đường hô hấp và sinh dục là đường xâm nhập phụ.
Sự truyền bệnh trực tiếp do nuôi nhốt chung, chăn thả chung… hoặc lây gián tiếp qua
thức ăn, nước uống, dụng cụ chăn nuôi mang mầm bệnh, người, ph
ương tiện vận chuyển.
- Loài mắc bệnh: Trâu bò mắc bệnh nhiều nhất, rồi đến các loài sau: heo, dê cừu, thú
hoang dã… Bệnh có thể lây qua cho người, các loài một móng, ngựa, gia cầm không mắc
bệnh này.
2.1.4. Triệu chứng
Thời gian nung bệnh từ 2-7 ngày, trung bình là 3-4 ngày, gồm 3 thể bệnh
2.1.4.1. Thể thông thường
- Bệnh hay gặp ở vùng nhiệt đới, thú ủ rũ, lông dựng, da mũi khô, thú sốt cao 40-
41 0C kéo dài 3 ngày.
- Xuất hiện các mụn nước
ở da, vành móng kẻ chân, lưỡi, vú làm thú kém ăn,
nhai khó khăn.
3

4

(1) (2) (3)

(4) (5) (6) Hình 1.1: Một số hình ảnh triệu chứng, bệnh tích FMD trên bò: (1) Miệng chảy nhiều
nước bọt, (2)(3) Vết loét ở lưỡi, (4) Vết loét ở móng (5) Vết loét ở móng bò, (6)) miệng
loét ở lưỡi và môi, nưới răng.
2.1.6. Phòng bệnh
- Khi phát hiện dịch phải khai báo ngay với các cơ quan thú y và chính quyền địa
phương, cách ly thú bệnh, tránh tiếp xúc với thú khỏe và các loài thú khác
5

- Phòng bệnh bằng vệ sinh là rất quan trọng, thường xuyên sát trùng chuồng trại,
dụng cụ chăn nuôi, bãi chăn thả, bằng các loại thuốc sát trùng của ANOVA như: NOVA-
MC.A30, NOVACIDE, NOVASEPT, NOVADINE, NOVAKON.
- Khi xảy ra bệnh phải xử lý thật kỹ toàn bộ chuồng trại, dụng cụ chăn nuôi bằng
các loại thuốc sát trùng, các gia súc mắc bệnh phải tích cực điều trị phụ nhiễm và tránh
lây lan bệnh, xác chết phải được xử lý theo các quy
định của ngành thú y. Không được
phép bán chạy hoặc tự ý giết mổ bán thịt các gia súc mắc bệnh.
- Định kỳ tiêm phòng bệnh lỡ mồm long móng bằng vaccin (1 năm tiêm 1-2 lần

+Sử dụng NOVA PREDNI-C để kháng viêm hạ sốt tiêm bắp liều 1ml/25-
30kg thể trọng, dùng cho đến khi hết triệu chứng bệnh. Kết hợp sử dụng NOVA-
B.COMPLEX, NOVA-ATP COMPLEX, NOVASAL để tăng sức đề kháng bệnh và mau
hồi phục.
2.2.CẤU TRÚC GENOME CỦA VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG (FMDV)
Bộ gen của FMDV là ARN đơn chuỗi (+) gồm 8.5kb, tương ứng với 2,6.10
6
(dal)
có hệ số lắng 146S. Vỏ capsid gồm 4 loại protein vỏ: VP1,VP2, VP3, VP4, mỗi loại gồm
60 copy. VP1 có đặc tính sinh miễn dịch. Genome FMDV gồm 3 phần: Vùng 5’ không
dịch mã (5’ UTR- Untranslated Region) mang một đoạn poly C, vùng mã hóa (coding
region), vùng 3’ không dịch mã (3’UTR) và vùng không tương đồng (heteropolymeric)
và một đuôi poly(A) cần thiết cho sự sao chép virus. 7

Toàn bộ genome của FMDV mã hóa cho một protein đơn. Sau khi dịch mã,
protein này được phân cắt thành 4 sản phẩm sơ cấp: Amino terminal L protease, phân cắt
ở đầu cuối cacboxyl, P1-2A, tiền chất của protein vỏ; sẽ trải qua giai đoạn polyproteinsau
dịch mã với sự tham gia của các protease virus để tạo 1 promoter. 5 copy của promoter sẽ

dụng khi RNA đích là quá dài hay chứa quá nhiều cấu trúc bậc hai đến nỗi sự
tổng h
ợp cDNA không bắt đầu hiệu quả bởi oligo (dT) hay primer chuyên biệt. Trong
hầu hết trường hợp, mục đích của những nhà nghiên cứu là tạo cDNA ban đầu dài và
chứa nhiều thành phần của phân tử bổ sung với trình tự RNA đích. Do đó primer chuyên
8

biệt là lựa chọn tốt nhất. Tiếp đến là oligo (dT) cũng tốt cho sự lựa chọn. Random
hexamer không chuyên biệt và tạo ra những phân tử cDNA dài, ngắn khác nhau được sử
dụng khi những phương pháp kia không hiệu quả.
- Nhân sợi cDNA thứ nhất lên nhiều bản bằng PCR. Giai đoạn này gồm có 3 bước như
sau:
+ Denature (biến tính): Chuyển dây đôi thành dây đơn
+ Annealing (bắt cặp): Primer gắn vào vị trí trên dây khuôn mẫu có mã đối
xứng vớ
i nó.
+ Extension (kéo dài): Kéo dài chuỗi mới nhờ enzyme polymerase.
Ba giai đoạn này lặp lại nhiều lần, để tạo nhiều sản phẩm khuếch đại. Ba giai
đoạn này xảy ra trong điều kiện nhiệt độ khác nhau (ví dụ: 94
o
C, 55
o
C, 72
o
C) với sự trợ
giúp của enzyme polymerase. Sự lặp lại theo chu kỳ thường xảy ra khoảng 30 lần để làm
tăng lượng sản phẩm. Độ dài của sản phẩm PCR tùy thuộc vào số đoạn và chiều dài của
primer trong phản ứng, điều kiện chất buffer, nhiệt độ bắt cặp của primer.
Reverse transcriptase, là một DNA polymerase phụ thuộc vào RNA làm
khuôn mẫu. Hiện có hai loại Reverse transcriptase được giới thiệu trên thị

nucleotide b
ị tác động là: G, A, C, G+A, T+C. Kết quả của các xử lý hoá học là sự hình
thành năm tập hợp nucleotide, các oligonucleotide trong một tập hợp có kích thước
khác nhau nhưng đều chấm dứt tại cùng một loại nucleotide. Cuối cùng năm
phân đoạn trên được đem phân tách trên gel polyacrylamide. Vị trí của các
oligonucleotide trên gel tương ứng với kích thước của chúng và đuợc phát hiện nhờ
đầu có đánh dấu phóng xạ. Kết quả được đọc trên bảng phóng xạ
tự ghi.
2.4.2. Phương pháp enzyme học thông qua việc sử dụng các
dideoxynucleotide của Sanger.
Phương pháp này dựa vào sự tổng hợp nhờ enzyme DNA polymerase mạch bổ
sung cho trình tự DNA mạch đơn cần xác định. Đặc trưng của phương pháp là ngoài bốn
loại nucleotide thông thường còn sử dụng thêm bốn loại dideoxynucleotide là
những deoxynucleotide trong đó nhóm 3’OH được thay thế bằng H. Điều này khiến các
dideoxynucleotide không còn khả năng hình thành các nối phosphodiester và do đó sẽ
làm ngừng quá trình tổ
ng hợp.
Trình tự DNA cần xác định cần phải được tạo dòng trong một vector mạch đơn
(phage M13). DNA polymerase sử dụng có thể là đoạn Klenow của DNA polymerase I,
Taq polymerase hay Sequanase. Sự tổng hợp mạch mới bắt đầu bằng từ một mồi bắt cặp
với một trình tự chuyên biệt trên phage M13, với sự hiện diện của bốn loại
nucleotide trong đó một loại được đánh dấu đồ
ng vị phóng xạ (
35
S). Phản ứng tổng hợp
được tiến hành trong bốn phân đoạn riêng. Người ta lần lượt cho vào mỗi phân đoạn
một trong bốn loại dideoxynucleotide với hàm lượng rất nhỏ. Do hàm lượng thấp nên
thỉnh thoảng mới có một dideoxynucleotide được sử dụng vào phản ứng tổng hợp một
olidonucleotide và lập tức sự tổng hợp oligonucleotide đó ngừng lại. Tính xác suất thì
trong mỗi phân đoạn s

vùng cần xác định trình tự đã biết trớc và ứng dụng chủ yếu là nhằm phát hiện nhanh
một đột biến điểm. PHẦN III:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1.Vật liệu
Trong nghiên cứu này, chúng tôi nghiên cứu trên 82 chủng virus type A trong đó
có 80 chủng được phân lập và phục hồi từ những ổ dịch khác nhau trên 15 bang của Ấn
Độ từ 1984-2000 và 2 chủ
ng đã có vaccine IND/490/97 và A10-Indian Vaccine Strain
(A10-IVS) . Những chủng này vẫn được lưu giữ tại kho dữ liệu quốc gia của Ấn Độ về
FMDV
3.2.Phương pháp
Quy trình chung cho quá trình xây dựng cây sinh dòng của 82 chủng FMDV
11


3.2.1. Nuôi virus-và thu hoạch tế bào
82 chủng virus được cấy chuyền 3-5 lần trong môi trường tế bào một lớp BHK-
21(Baby hamster kidney cell line ) . Ta tiến hành thu các tế bào nhiễm bệnh nổi lên trên
mặt môi trường đem cất ở 70
o
C trước khi sử dụng
3.2.2.Li trích RNA tổng số
RNA tổng số được ly trích bằng bộ kít li trích RNA (Qiagen)
3.2.3. Chạy RT-PCR và giải trình tự
Phản ứng reverse transcriptase (RT) tạo cDNA
- Thành phần phản ứng RT:
• Primer (NK61,5’GACATGTCCTCCTGCATCTG-3’) 20pmol
• AMV Reverse Transcriptase 1 µl

kit(QIAGEN). Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch đem đi giải trình tự với fmol Cycle
Sequencing kit(promega) và primer Cy5 đã được đánh dấu (antisense 5’-
GAAGGGCCCAGGGTTGGACTC). Trong một vài trường hợp, một primer đánh dấu
được thêm vào (pA-1C612,TAGCGCCGGCAAAGACTTTGA) được sử dụng để hoàn
thành việc giải trình tự gen 1D. Việc giải trình tự được th
ực hiện trên hệ thống phân tích
ALFexpress II DNA (pharmacia)
3.2.4. Phân tích dữ liệu sau khi giải trình tự
Các trình tự phân tử được so sánh dựa trên phần mềm Clustal W sẵn có trong
chương trình OMIGA
TM
(Oxford MolecularLtd,England) . Phân tích cây sinh dòng được
thực hiện bằng phần mềm PHYLIP version 3.5c . Trong quá trình phân tích khoảng cách
tiến hóa cũng được tính toán bằng phần mềm DNADIST. Khoảng cách nền được sử dụng
để tạo cây họ hàng bằng phần mềm NEIGHBOR. Cây cuối cùng được vẽ bằng TreeView
1.5.2. Những cây địa hình được đánh giá bằng việc phân tích mối quan hệ từ 100 bản sao
của dữ liệu gốc được thiết lập trong chương trình BOOTSTRAP, DNADIST,
NEIGHBOUR và CONSENSE . O2/Brescia/1947
được kể đến trong phân tích như một
loài xa lạ.Một sự so sánh độc lập khác của trình tự nucleotide và cấu trúc phía sau của
cây UPGMA được thực hiện bằng chương trình “EpiSeq”( được viết bởi N.J. Knowles,
Pirbright Laboratory,UK). Các phân tích được thực hiện trên chương trình DNASTAR
(DNASTAR, Inc, Hoa Kỳ). Các trình tự được lấy từ GenBank / EMBL hoặc đã được
công bố trước đó để so sánh (nhập số accession hoặc số tham khảo trong dấu ngoặc đơn)
A10-Holland (M20715), A10-61 (X00429), A12-119b (J02187), IND 17/77 (AF
204108),A5/Spain/86 (M72587), A5/Tubingen , A24/Pirbright , Iran/4/98 (trình t
ự cung
cấp bởi Drs. N. J. Knowles and R. P. Kitching, IAH, Pirbright), A22/550 Azerbaijan/65
(A22/Azerbaijan/65; X74812), A24/Cruzeiro/Brazil/55 (A24/Brazil/55; K03340),
A27/Cundinmarca/Colombia/76 (A27/Colombia/76; K03341), Argentina/79 (K03345),



Hình 1: Cây UPGMA xây dựng từ trình tự gen 1D, biểu thị mối quan hệ di truyền của các chủng
FMDV serotype A. Genotype (kiểu gen) được đánh dấu từ I-X ( theo thứ tự thời gian phân lập)
đ
ư
ợ
c hi
ể
n th
ị
tron
g
các nhánh
15

4.2.Các Genotype trong cây sinh dòng
4.2.1.Genotype I
Kiểu gen này đại diện cho 16 chủng được phân lập trong khoảng 5 thập kỉ (1942-
1986), bao gồm các virus từ Columbia,Greece, India, Italy,Morocco,Netherlands và
Spain. Trong nghiên cứu này, chúng tôi lưu ý đến những kiểu gen lâu đời nhất của
FMDV serotype A. 4 chủng được phân lập bao gồm cả A10-IVS được đưa vào nhóm
này. Độ biến động giữa 2 chủng A10-IVS và A10-Holland là khoảng 1,3%. Những bằng
chứng này cho thấy 3 chủng phân lập thì có mối quan hệ gần với A10-IVS( độ biến
động 1.8-2.2%)
để chỉ ra rằng có sự biến đổi chủng virus từ các chủng vacxin là có thể
xảy ra Những virus thuộc genotype này được phân lập ở Ấn Độ từ 1984-1986 và không
tìm thấy chúng nữa sau năm 1986. Armstrong và các cộng sự đã tường thuật mối quan hệ
gần gũi cuộc các dòng virus Ấn Độ trong quá trình phục hồi suốt năm 1986 với A10-
Holland/42 bằng việc sử dụng kháng thể đơn dòng

(Albania/96), tỷ lệ biến động 2.8-14,7% so với những chủng phân lập ở Ấn Độ.Hầu hết
những chủng được phân lập trên gia súc và 2 chủng được phân lập trên trâu (IND
39/2000 và IND 81/2000). IND 21/90 phân lập vào năm 1989 từ Assam là chủng lâu đời
nhất trong genotype này
4.2.8.Genotype VIII
Các virus thuộc kiểu gen này được tìm thấy ở Iran, SaudiArabia, và Thổ Nhĩ Kì.
Hai chủng được phân lập gầ
n đây cho thấy tỷ lệ biến động xấp xỉ 1,8% trái lại Iran/87 là
chủng được phân lập lâu nhất trong nhóm này cho thấy tỷ lệ biến động tối đa 8,8-12,4 %
so với những chủng còn lại trong nhóm này
4.2.9.Genotype IX
Kiểu gen này bao gồm 1 chủng từ Malaysia và 2 chủng có quan hệ gần nhau ( độ
tin cậy 96,7%) được phân lập từ năm 1993 đấn 1997. Sự khác biệt giửa các nu có thể
thấy trong nhóm
4.2.10.Genotype X
Kiểu gen này chỉ tìm th
ấy ở Iran, bao gồm 3 chủng được phân lập trong thời gian
2 năm (1997 và 1998). Tỷ lệ biến động tối đa khoảng 1,8% được so sánh giữa Iran/4/98
và Iran/17/97. Chúng biến động gần 19% so với những chủng phân lập khác cũng ở Iran
trong Genotype VIII. Kiểu gen này chia một nhánh với kiểu gen VII, cho thấy sự hiện
diện của cùng một tổ tiên chung giữa 2 kiểu gen này.
4.3. PHÂN TÍCH SỰ PHÁT SINH LOÀI TRÊN GEN 1D
Để phân tích mối quan hệ tiến hóa giữa những chủng FMDV phân lậ
p được, một
cây quan hệ đã được xây dựng dựa trên trình tự gen 1D (hình 2). Trong cây này, những
dòng Châu Âu và Nam Mỹ ( bao gồm dòng Indian A10) tạo thành một cụm so với các
dòng Châu Á. Đây là một điều thú vị , hầu hết các chủng trong mỗi cụm thì được chia
thành các dòng khác nhau theo kiểu tương tự như trong cây UPGMA, và được phân về
địa lý. Mặc dù các chủng được phân lập trong kiểu gen IV hình thành một nhóm phân
biệt trong cây UPGMA. Chúng không tạo thành một cụm đơn trong cây quan hệ và được

voi, IND 61/88), tất cả những chủng được phân lập có trình tự RRGD tại ví trí VP1 143-
146, trong khi hầu hết các chủng phân lập trong genotype VII (ngoại trừ IND 2/93, IND
96/96 và IND 104/2000),có TRGD tại cùng một vị trí. Một vị trí kháng nguyên nhỏ đã
được xác định rõ đặc điểm tại VP1 169 (tương ứng với 168 ở FMDV A22) trên virus
A10-Holland. Trong genotype IV và VI (ngoài trừ IND 170/88) hầu hết các chủng phân
lập đều có Arginine(R) , trong khi đó ở genotype VII (ngoạ
i trừ IND 21/90 và IND
2/93), Lysine (K) được tìm thấy tại vị trí VP1 168. Vị trí VP1 173 cũng có vai trò quan
trọng trong việc xác định điểm kháng nguyên, và một số amino acid thay thế được tìm
thấy trên những chủng được phân lập, Hai aminoacid thay thế tại VP1 109 (K→R) và
213 (L→Q) thì đặc trưng cho một chùng phân lập trên voi (IND 61/88) trong genotype
IV. Có 24 loại amino acid khac nhau trong đó có 15 loại nằm gần hay ngay tại vùng
kháng nguyên gữa 2 chủng vacxin được sử dụng gần đâylà IND 490/97 và IND 17/77.
Việc thay thế các amino acid được xem xét trong vùng kháng nguyên của nhữ
ng chủng
khác nhau được mong đợi là sẽ ảnh hưởng tới tính kháng nguyên của protein VP1. Trong
genotype I, cả 3 chủng có mối quan hệ thân thuộc với chủng vacxin A10-IVS thì khác
nhau tối đa 6 amino acid. Trong tất cả các chủng đã phân lập, bao gồm A10-IVS thiếu
mất 1 codon tại vị trí VP1 142 khi so sánh vói A10-Holland

18


Hình 2: Cây sinh dòng của FMDV serotype A suy ra bằng phương pháp neighbor-joining. Giá trị
bootstrap tin cậy của những dòng chính đã được chỉ định (giá trị trên 50% trong số 100 bản sao).
Những kí hiệu genotype ,được xác định trong cây UPGMA (hình 1) đã được chỉ định. Chiều dài của
nhánh đã giảm đến 50% để tiết kiệm không gian. Tỷ lệ của các thanh đại diện cho khoảng cách di
truyền
19



PHẦN VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.Công nghệ sinh học trong thú y – Nguyễn Ngọc Hải – Nhà xuất bản Nông Nghiệp
2.Ngành chăn nuôi Việt Nam trong xu thế hội nhập - Hoàng Kim Giao – Cục chăn nuôi
3. Genetic analysis of foot-and-mouth disease virus serotype A of Indian origin and
detection of positive selection and recombination in leader protease- and capsid-coding
regions - S B NAGENDRAKUMAR, M MADHANMOHAN, P N RANGARAJAN and
V A SRINIVASAN - November 19, 2001
4. Phylogenetic analysis of serotype A foot-and-mouth disease virus isolated in India
between 1977 and 2000 - C.Tosh, A.Sanyal, D.Hemadri, and R.Venkataramanan
5. http://www.ias.ac.in/jbiosci



MỘT SỐ PHỤ LỤC