Bộ giáo dục v đo tạo bộ y tế
viện vệ sinh dịch tễ trung ơng
___________________________

nguyễn thị lan phơng
xây dựng phơng pháp đánh giá kháng
nguyên ngoại v nội độc tố trong vắcxin
ho g - đề xuất tiêu chuẩn sản xuất vắcxin ho
g an ton cao tại viện vắcxin nha trang Chuyên ngành: Vi khuẩn học
Mã số: 62.72.6801
Tóm tắt luận án tiến sĩ y học
Phản biện 3: PGS.TS. Đào Xuân Vinh Luận án đã đợc bảo vệ trớc hội đồng chấm luận án cấp nhà nớc họp tại:
Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ơng vào hồi 9h ngày 24 tháng 6 năm 2006 Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Th viện Quốc gia
- Th viện Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ơng

2
MỞ ĐẦU
Bệnh ho gà do vi khuẩn B.pertussis gây nên. Trước đây bệnh xảy ra rất
thơng thường, đặc biệt là ở trẻ em, gây nên những hậu quả nghiêm trọng.
Sau hơn 40 năm sử dụng vắcxin ho gà dưới dạng vắcxin phối hợp bạch
hầu, ho gà và uốn ván (vắcxin DPT) trong chương trình tiêm chủng mở
rộng (CTTCMR), đến nay bệnh cơ bản đã được kiểm sốt.
3
1. Xõy dng 4 phng phỏp ỏnh giỏ khỏng nguyờn ngoi c t ho g v
ni c t trong vcxin ho g ton t bo bt hot.
2. Xác định và đánh giá tơng quan giữa các thành phần kháng nguyên,
ảnh hởng của một số yếu tố liên quan đến tính an toàn và công hiệu của
vắcxin ho gà sản xuất tại Viện Vắcxin Nha Trang là căn cứ đề xuất tiêu
chuẩn sản xuất vắcxin ho gà an toàn cao.
Nhng úng gúp mi v giỏ tr thc tin ca lun ỏn
L cụng trỡnh u tiờn ti Vit Nam xõy dng v thm nh hon chnh cỏc
phng phỏp xỏc nh hm lng v hot tớnh khỏng nguyờn c t ho g
v ni c t trong vcxin ho g ton t bo b
t hot. õy l nhng
phng phỏp cho kt qu nhanh nờn cú giỏ tr ng dng cao kim nh
trong qui trỡnh sn xut vcxin ho g ton t bo hin nay. ng thi cỏc
phng phỏp ny cũn l nhng cụng c hu ớch ỏnh giỏ cht lng khi
phỏt trin cỏc vcxin ho g tinh ch ti Vit nam.
Lun ỏn ó xỏc nh c hm lng v hot tớnh ca cỏc khỏng nguyờn
gõy c chớnh trong vcxin ho g v ỏnh giỏ s tng quan gia cỏc
khỏng nguyờn ú v
i c tớnh c hiu ca vcxin. õy l mt trong
nhng vn quan trng gii quyt tớnh an ton mc cao nht cú th
t c ca vcxin ho g ton t bo ang sn xut ti Vit nam.
Xỏc nh c cỏc nh hng ca phng phỏp bt hot, thi gian lu tr
nh hng ca cht hp ph i vi tớnh an ton v cụng hiu ca v
cxin
ho g m trc õy cha cú tỏc gi no ỏnh giỏ mt cỏch cú h thng.
xut c tiờu chun sn xut vcxin ho g an ton cao vi nhng ch
tiờu c th, cú th ng dng ngay qui trỡnh xut ny trong thc t sn

1.1.4 Đáp ứng miễn dịch
Đáp
ứng miễn dịch dịch thể và đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào là
cơ chế bảo vệ quan trọng. Miễn dịch qua trung gian tế bào có vai trò trong
đáp ứng miễn dịch tự nhiên và duy trì sự bảo vệ lâu dài sau mắc bệnh.
Đáp ứng miễn dịch của vắcxin ho gà toàn tế bào giống với quá trình nhiễm
trùng tự nhiên. Đáp ứng miễn dịch của vắcxin ho gà vô bào trên người bao
gồm cả 2 hướng ch
ọn lọc Th1 và Th2.
1.2 Sản xuất và kiểm định vắcxin ho gà
1.2.1 Vắcxin ho gà toàn tế bào bất hoạt
Liên quan đến sản xuất vắcxin ho gà toàn tế bào bất hoạt bao gồm các yêu
cầu về chủng giống, môi trường, nuôi cấy lên men, tách lọc thu sinh khối,
bất hoạt và pha chế vắcxin. 5
Kiểm định vắcxin ho gà toàn tế bào bất hoạt theo tiêu chuẩn của
TCYTTG.
1.2.2 Vắcxin ho gà vô bào
Vắcxin ho gà vô bào là vắcxin tinh chế thường chứa các kháng nguyên PT,
FHA và PRN. Tuy nhiên thành phần kháng nguyên, hàm lượng kháng
nguyên chưa có sự thống nhất của các nhà sản xuất.
Tiêu chuẩn của vắcxin ho gà vô bào giống với vắcxin ho gà toàn tế bào
nhưng trong phương pháp kiểm định cần xác định hàm lượng của các
kháng nguyên và hiệu quả đáp ứng miễn dịch trên súc vật thí nghi
ệm vaø
xác định công hiệu của vắcxin. Kiểm tra an toàn đặc hiệu bằng thử nghiệm
tăng trọng chuột.
1.3 Xây dựng và đánh giá phương pháp phân tích

- Độc tố ho gà mẫu chuẩn Quốc tế JNIH-5 (Viện NIBSC - Anh) - Kháng
thể đơn dòng kháng độc tố ho gà (Biken -Nhật bản) - Cộng hợp kháng
thỏ g
ắn biotin ( Sigma)
- Fetuin (Sigma)
- Lysat ( Bio Whitake) - Endotoxin chuẩn (Cambrex)
2.1.2.Tế bào – Môi trường – Dung dịch
- Tế bào CHO –K1 (Viện Biken - Nhật)
- Môi trường EMEM + 10% HTBTB (Sigma)
- Các dung dịch đệm, dung dịch thuốc nhuộm…
2.1.3 Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt 11-14g; 15-17g
2.1.4 Hoá chất: Tetramethylbenzidine, Tween 20, axit sulfuaric…
2.1.5 Dụng cụ thiết bị: Multichannels, máy đọc ELISA, máy siêu âm
đồng hoá, máy ly tâm lạnh, tủ ấm, cân…
2.2 Phương pháp
2.2.3 Xây dựng các phương pháp xác định kháng nguyên độ
c tố ho gà
PT và nội độc tố trong vắcxin ho gà toàn tế bào bất hoạt
 Các bước cơ bản để hình thành và ứng dụng phương pháp mới: xác định
các điều kiện tối ưu của phương pháp, xây dựng qui trình thực hiện và
thẩm định phương pháp (độ nhạy, độ đặc hiệu, độ chính xác, độ đúng).
 4 phương pháp xác định kháng nguyên ngoại độc tố ho gà và nội
độc tố là: 7
- Xây dựng và chuẩn hoá phương pháp ELISA định lượng nồng độ
kháng nguyên độc tố ho gà PT trong vắcxin ho gà toàn tế bào.
- Xây dựng, chuẩn hoá và thẩm định phương pháp chuẩn độ độc tố ho
gà hoạt động trên tế bào CHO-K1.


8
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ
3.1. Xây dựng các phương pháp xác định độc tố ho gà PT và nội độc tố
trong vắcxin ho gà toàn tế bào
3.1.1. Xây dựng và chuẩn hoá phản ứng ELISA định lượng nồng độ PT
3.1.1.1 Tối ưu các điều kiện của phản ứng ELISA
- Nồng độ fetuin tối ưu: 25μg/ml
- Nồng độ kháng thể thỏ kháng PT: 1/500
- Cộng hợp phù hợp cho hệ
ELISA -fetuin: Cộng hợp kháng thỏ gắn
Biotin và SBC 1/5000
3.1.1.2. Xây dựng đường chuẩn
Khoảng tuyến tính có OD từ 0,1-1,4 tương đương nồng độ PT trong mẫu
thử từ 0,03μg/ml đến 0,25 μg/ml (hình 3-3).
Hình 3 -3. Đồ thị đường chuẩn của phản ứng
3.1.1.2. Kết quả xác định độ nhạy của phản ứng:
LOD của phản ứng có OD là 0,090255 và LOQ có OD tương đương
0,1416. D
ựa theo đường chuẩn độ nhạy của phản ứng là 0,025 μg/ml.
3.1.1.3. Kết quả xác định tính đặc hiệu:

- Trong điều kiện bình thường với các mẫu thử không tinh khiết (PM 46
Ỉ 48) và canh khuẩn ho gà (BP134: 1306, BP 134: 3306 và BP509: 1406)
Phương pháp có tính ổn định đạt u cầu độ chính xác và độ đúng
(CV=3,17 % , tỷ lệ phục hồi của tất cả các mẫu đạt > 90% trung bình đạt
94,55%.)
3.1.2 Kết quả xây dựng và chuẩn hố phương pháp chuẩn độ độc tố ho
gà PT hoạt động trên tế bào CHO –K1.
3.1.2.1. Tối ưu hố các đ
iều kiện cho phản ứng CHO –K1
- Mơi trường ni tế bào: Mơi trường EMEM có 10% huyết thanh bào
thai bê hay có 5% huyết thanh bào thai bê và 10% Glutamin thuận lợi cho
tế bào CHO-K1 phát triển.
- Số lượng tế bào trong phản ứng chuẩn độ: 10
6
tế bào/ml
- Thời gian gây nhiễm: thời gian gây nhiễm 72h cho thấy tế bào có hình
thái đặc hiệu nhất. Cho tế bào cùng lúc chuẩn độ hay cho trước khi chuẩn
độ 24h đều có kết quả như nhau
3.1.2.2.Tính đặc hiệu của độc tố ho gà tác động trên tế bào CHO–K1
Tính đặc hiệu thể hiện bằng sự biến đổi đặc hiệu hình thái của tế bào khi
được tiếp xúc với độc tố ho gà hoạt động hoặc vi khuẩ
n ho gà độc. Hiệu
quả này khơng xảy ra khi tế bào tiếp xúc với các vi khuẩn khác hay các 10
khỏng nguyờn khỏc ca ho g hoc khi c t PT hot ng b trung ho
bi khỏng huyt thanh ho g ton phn ( bng 3-11 v 3-12).
Bng 3-11 Tỏc ng ca mt s chng vi khun trờn t bo CHO-K1
Mu th Bin i hỡnh thỏi t bo

(+): tế bào bị tác động đặc hiệu (-) tế bào bình thờng 11

3.1.2.3 Xác định nồng độ tối thiểu của độc tố ho gà tác động trên tế
bào CHO –K1
Phương pháp có thể phát hiện được độc tố ho gà hoạt động ở nồng độ
62,5pg. Đây cũng chính là độ nhạy của phản ứng.
3.1.2.4. Độ lặp lại và độ đúng của phương pháp
 Độ chính xác: Hệ số biến thiên trung bình:
- Trong cùng phản ứng : CV= 2,8 %
- Giữa các lần thực hiện phản
ứng: CV= 15,03%
 Độ đúng: Tỷ lệ phục hồi: trung bình 114,,9%
 Phương pháp đạt tính ổn định với các mẫu thử ho gà (PM) khác nhau
(CV%= 7,8 , tỷ lệ phục hồi = 94,23%).
3.1.3. Kết quả xây dựng và chuẩn hố phương pháp xác định yếu tố
kích hoạt tăng lympho bào (LPF) trên chuột nhắt trắng
3.1.3.1.Chuẩn hố qui trình thử nghiệm
 Tiêu chuẩn của chuột thí nghiệm
Số lượng bạch cầu máu ngọai vi trung bình củ
a chuột nhắt trưởng thành,
giống đực, 15-17g/con, 4-5 tuần tuổi, cùng lứa, khoẻ mạnh là 4651,94 ±
1330,66 BC/mm
3
(hình 3-10).
 Chọn đường tiêm và thời gian lấy máu
Số lượng bạch cầu tăng cao nhất vào ngày thứ 5 và 6 tuỳ theo đường tiêm.
Duy trì ổn định 4-5 ngày sau đó và giảm từ từ đến ngày thứ 21 thì bình

3.1.4 Chun hoỏ phng phỏp LAL xỏc nh nng ni c t trong
vcxin ho g ton t bo bt hot
3.1.4.1.Xỏc nh nhy thc t cca phn ng
nhy thc t ca phn ng l 0,09333 EU/ml 0,0246 . Trong 6 ln
thc hin nhy ca phn ng u trong gii hn qui nh (50%-200%). 13
3.1.4.2. Tính ổn định của phản ứng khi xác định nội độc tố trong một
số mẫu vắcxin ho gà
Bảng 3-23 Nồng độ nội độc tố trong 1 số mẫu vắcxin ho gà PM
MÉu
thö(30
OIU/ml)
Nång ®é nội độc tố (EU/ml)
TB SD CV%
LÇn 1 LÇn 2 LÇn 3
PM 44 1200 1000 1200 1133,3 115,4 10,1
PM 45 3700 3500 4280 3826,7 405,1 10,5
PM 46 9800 10000 9500 9766,6 251,7 2,5
PM 0106 5000 7250 6500 6250 1145,6 18,3
PM 0206 9500 9800 9474 9591,3 181,1 1,9
PM 0306 5000 6000 4500 5166,7 763,4 14,7
PM 0406 5000 6000 4800 5266,7 642,9 12,2
PM 0506 16364 17000 15800 16388 600,4 3,7
PM 0606 18000 15000 12500 15166,7 2753,7 18,1
PM 0706 18000 12500 18000 16166,7 3174,4 19,6
PM 0806 10000 12500 12500 11666,7 1443,3 12,37
Trung b×nh 9126,3 1043,5 11,4
Nồng độ nội độc tố trong vắcxin ho gà thay đổi tuỳ theo lô. Hệ số biến

3
)
PM 31 ND (*) 0,399 33000
PM 35 ND (*) 0,299 26320
PM 37 ND (*) 0,199 17160
PM 38 ND (*) 0,199 20650
PM 39 ND (*) 0,399 30080
PM 45 0,46 0,097 9560
PM 46 0,735 0,125 8240
PM 47 0,724 0,130 10650
PM 48 0,733 0,13 9840
PM 0406 0,752 0,184 17600
PM 0506 0,78 0,136 12540
PM 0606 1,48 0,162 15480
PM 0806 1,26 0,196 22600
RP5 1,36 0, 750 56800
ND (*): Kh«ng thùc hiÖn
Nồng độ độc tố ho gà hoạt động trong vắcxin ho gà không vượt quá 0,4
μg/ml. (bảng 3-25)
3.2.3.Tương quan giữa đậm độ vi khuẩn ( độ đục) và nồng độ nội độc
tố với tăng trọng chuột
Số lượng vi khuẩn và nồng độ nội độc tố có ảnh hưởng đến sự tăng trọng
của chuột đặc biệt sau 18h và 24 giờ. Trọng lượng củ
a chuột chỉ hồi phục
sau ngày thứ 3 (hình 3-12, 3-13, 3-14). 15
-3
-2

5
6
7
18 24 48 72 96 120 144 168
Th
ờ
i gian (h)
Tăng trọng trung bình (g)
30 (OUI/ml) 15 (OIU/ml) 7.5 (OIU/ml) NMSL
RP5Hình 3-13 Tương quan giữa tăng trọng chuột và đậm độ vi khuẩn khi sử
dụng mẫu thử là vắcxin ho gà mẫu chuẩn RP5

-1
0
1
2
3
4
5
6
7
18 24 48 72 96 120 144 168
Th
ờ
i gian (h)
Tăng trọng trung bình (g)
30 (OIU/ml) 15 (OIU/ml) 7.5 (OIU/ml) NMSL

80
100

120
140
036912
Th?i gian ( tháng )
T
?
l
?
t
?

ng MWG
(%)

PM b
?
t ho
?
t nhi
?
t PM b
?
t ho
?
t formalin 0,1%
20
40
60
80
100
120
036912
Thời gian (tháng)
T
ỉ
l
ệ
gi
ả
m LP (%)
PM b
ấ
t ho
ạ
t nhi
ệ
t PM b
ấ
t ho
ạ
t formalin 0,1%Hình 3-17 Tính ổn định LPF của vắcxin ho gà


âm tính gi
ả hay dương tính giả. Độ đúng và độ chính xác được kiểm chứng
với những mẫu thử là nước cốt ho gà khác nhau (mẫu kiểm định) vẫn đạt
được ở mức độ cho phép nhỏ hơn 15% như kết quả đã chỉ ra ở bảng
3.7 và 3-8.
19

4.1.2 Phương pháp chuẩn độ PT trên tế bào CHO-K1
Chuẩn hoá qui trình thực hiện: Các bước của qui trình thực hiện của
chúng tôi cũng tương tự với qui trình của 2 viện RIVM và Biken song các
điều kiện của phản ứng được chuẩn hoá để phù hợp với mẫu thử là vắcxin
ho gà toàn tế bào và theo điều kiện phòng thí nghiệm hiện có bao gồm: Số
lượng tế bào trong 1 giếng 100µl (10
6
tế bào/ml).Thời gian đọc kết quả
72h, sau khi nhuộm. Có thể cho tế bào đồng thời với mẫu thử hay nuôi tế
bào trên phiến trước 24h.
Độ đặc hiệu và độ nhạy: Những biến đổi hình thái đặc hiệu của tế bào
CHO-K1 khi tiếp xúc với độc tố ho gà đã được chỉ ra trên các hình 3.3 đến
3.6. Về cơ chế thực sự của sự biến đổi hình thái này hiện nay cũng chư
a
được giải thích rõ ràng. Độc tố PT hoạt động bằng cách ly giải ADP-
ribosylation của phân tử GTP của một protein điều hòa gắn trên màng tế
bào. Cơ chế hoạt động này tương tự như độc tố bạch hầu và 1 số ngoại độc
tố khác có cấu trúc dạng A –B nhưng sự biến đổi hình thái tế bào CHO-K1
chỉ xảy ra đặc hiệu đối với độc tố ho gà PT.
Kết quả

3
.

Chuẩn hoá qui trình thực hiện: Do có những khác biệt đáng kể đáng kể
giữa các qui trình thực hiện giữa các nơi khác nhau nên nghiên cứu đã
khảo sát và chọn những thông số cơ bản, tối ưu để xây dựng qui trình thử
nghiệm bao gồm: đường tiêm, thời gian lấy máu, liều tiêm, mẫu chuẩn và
cách tính kết quả.
Mẫu chuẩn: Mẫu chuẩn được so sánh với mẫu chuẩn Hà lan PU585 đảm
b
ảo tính ổn định.
4.1.4. Phương pháp LAL chuẩn độ nội độc tố
Theo hướng dẫn của nhà sản xuất bộ kít và hướng dẫn của Dược điển châu
Âu, cần phải xác định lại độ nhạy thực tế của phản ứng LAL khi thực hiện
phản ứng. Nếu độ nhạy thực tế nằm trong khoảng 50-200% so với độ nhạy
nhà sản xuất
đưa ra thì kết quả của phản ứng là hợp lệ. Khi xác định lại độ
nhạy của phản ứng LAL, kết quả thu được đều trong giới hạn cho phép.
Vì phản ứng LAL là một phản ứng enzym, nên có thể bị ức chế bởi một số
yếu tố có thể có trong mẫu thử. Cách tốt nhất để phát hiện có yếu tố ức chế
trong mẫu thử hay không là thự
c hiện một loạt các độ pha của mẫu thử có
thêm nội độc tố chuẩn có nồng độ tương đương gấp 2 lần độ nhạy của
lysate (mẫu spike). Nếu kết quả của những mẫu này dương tính chứng tỏ
phản ứng không bị ức chế. Trong thiết kế phương pháp luôn luôn mỗi một
mẫu thử đều thực hiện đồng thời các mẫu “spike” (là m
ẫu thử có thêm
25µl nội độc tố chuẩn có nồng độ 0,125 EU/ml). Nếu các mẫu “spike”
không vượt quá 20000 EU/ml. Vì thế giới hạn tối đa có thể đề xuất cho
nồng độ nội độc tố trong vắcxin ho gà là không vượt quá 25000 EU/ml.
Nghiên cứu ảnh hưởng của chất hấp phụ cho thấy để vắcxin ho gà sau hấp
phụ đạt công hiệu tối thiểu 8 IU/ml theo yêu cầu của TCYTTG thì công
hiệu tối thiểu đối với vắcxin ho gà của Vi
ện trước khi hấp phụ cần đạt 6,96
IU/ml và đậm độ tối thiểu là 27 OIU/ml. Đậm độ này không lệch ra ngoài
qui định của TCYTTG cho phép đậm độ vi khuẩn tối thiểu trong 1 liều 22
vắcxin không được vượt quá 20 OIU. Để hài hoà với các chỉ tiêu khác liên
quan trong nghiên cứu, đậm độ vi khuẩn hiện tại nên đề xuất ở khoảng 27
– 30 OIU/ml (13,5 -15 OIU/liều).
Tại thời 6-9 tháng các chỉ số sinh học bao gồm công hiệu, an toàn và chỉ
số tăng bạch cầu của vắcxin ho gà bất hoạt nhiệt ở mức độ ổn định cao và
phù hợp với các mức giới hạn về an toàn, công hiệu và LPF đề xuấ
t ở trên.
Theo Ackland N. nếu kết quả MWG không đạt nên để vắcxin ở 4
o
C trong
một khoảng thời gian nữa để giảm độc tính xuống mức có thể chấp nhận
được. Trong thời gian này PT tiếp tục bị bất hoạt ở 4
o
C đồng thời chất bảo
quản merthiolate có trong vắcxin cũng tham gia thúc đẩy quá trình bất hoạt
này. TCYTTG cũng khuyến cáo hạn dùng của vắcxin ho gà không vượt
quá 1 năm, vì thế thời gian sử dụng của vắcxin ho gà bất hoạt nhiệt sản
xuất tại Viện Vắcxin trong giới hạn 6-9 tháng là hợp lý. Đối với vắcxin ho
gà bất hoạt thêm với formalin 0,1% có thể các chỉ số về tính an toàn đạt tốt

Đờng chuẩn ở nồng độ PT từ 0,03 g/ml đến 0,25 g/ml (OD từ 0,4
-1,4). Độ nhạy: 0,025 g/ml. Đặc hiệu với PT tinh chế và PT ở mẫu
không tinh khiết.
Hệ số biến thiên trong cùng phản ứng : 12,7%, giữa các phản ứng:
7,34%. Tỷ lệ phục hồi: 98,8%.
Phơng pháp thể hiện tính ổn định cao trong điều kiện bình thờng.
Phơng pháp chuẩn độ PT trên tế bào CHO-K1:
Các điều kiện tối u của phản ứng: Môi trờng nuôi tế bào EMEM +
10% HTBTB hay EMEM + 5% HTBTB + 10% glutamin. Số lợng tế
bào 10
5
TB/giếng. Thời gian đọc kết quả: 72h.
Độ nhạy: 62,5pg PT/giếng. Đặc hiệu cao với PT tinh khiết và PT
trong mẫu ho gà.
Hệ số biến thiên trong cùng phản ứng: 2,8%, giữa các lần thực hiện
phản ứng: 15,03%. Tỷ lệ phục hồi: 114,9%.
Phơng pháp thể hiện tính ổn định cao với mẫu thử ho gà không tinh
khiết.
Phơng pháp xác định hoạt tính gây kích hoạt tăng lymphô bào
Chuẩn hoá chuột thí nghiệm: chuột nhắt trắng giống Swiss, cùng lứa,
giống đực, trọng lợng 15-17g, 3-4 tuần tuổi.
Chuẩn hoá mẫu chuẩn: Mẫu chuẩn địa phơng RP5
Chuẩn hoá qui trình: 5 chuột cho 1 mẫu thử, đờng tiêm dới da,
chứng dơng: mẫu chuẩn RP5, chứng âm: nớc muối sinh lý. Liều
tiêm 1 liều tiêm cho ngời, 1ml/chuột. Thời gian đếm bạch cầu: 6 24
ngày. Tính kết quả: số lợng bạch cầu trung bình /mm
3