bộ giáo dục v đo tạo bộ y tế

Trờng đại học y h nội
***

Phạm Đăng Khoa

Nghiên cứu Tính đa hình thái
của một số gen nhạy cảm
Trong bệnh Lupus ban đỏ hệ thống Chuyên ngành: miễn dịch học
Mã số: 3.01.09 Tóm tắt Luận án tiến sĩ y học 24Chữ viết tắt

bp (base pair): cặp bazơ
CD (cluster of differentiation): cụm biệt hoá
CD40L (CD40 ligand): phối tử của CD40
DNA (desoxyribonucleic acid): axit deoxyribonucleic
ds DNA (double-stranded DNA): DNA xoắn kép
HLA (human leukocyte antigen): kháng nguyên bạch cầu ngời
IL (interleukin): interleukin
MHC (major histocompatibility complex): phức hợp hoà hợp mô
chủ yếu
NA (neutrophil antigen): kháng nguyên bạch cầu hạt trung tính
PCR (polymerase chain reaction): phản ứng chuỗi do polymerase
SLE (systemic lupus erythematosus): bệnh lupus ban đỏ hệ thống
SNP (single nucleotide polymorphism): tính đa hình thái của
nucleotide đơn
TNF (tumor necrosis factor): yếu tố gây hoại tử u
1
đặt vấn đề

Tự miễn là một trong ba nhóm bệnh lí miễn dịch, đợc đặc trng
bởi sự xuất hiện các tự kháng thể chống lại các cấu thành của chính

DRB1, FcRIIA, FcRIIIA, FcRIIIB, C4A, TNFRII và IL-10
promoter ở bệnh nhân SLE ngời Việt nam.
3. Lần đầu tiên đa ra nhận xét về mối liên quan giữa tính đa hình
thái của các gen nêu trên với SLE ở ngời Việt nam.
Cấu trúc của luận án
Luận án dài 104 trang, ngoài phần Đặt vấn đề, Kết luận và Kiến
nghị, gồm 4 chơng. Chơng 1: Tổng quan (33 trang); Chơng 2: Đối
tợng và phơng pháp nghiên cứu (17 trang); Chơng 3: Kết quả (18
trang); Chơng 4: Bàn luận (32 trang). Luận án có 124 tài liệu tham
khảo, 4 phụ lục, 21 bảng, 11 biểu đồ và 9 hình.

Chơng 1: tổng quan ti liệu
1.1. Bệnh tự miễn
Bệnh tự miễn là một trạng thái bệnh lí do có sự kết hợp của tự
kháng thể với tự kháng nguyên mà gây ra viêm và dẫn đến tổn thơng
thực thể và chức năng tại tế bào, mô hay cơ quan.
Hiện nay để chẩn đoán xác định bệnh tự miễn, ngoài những kĩ
thuật kinh điển trong miễn dịch học, những kĩ thuật hiện đại trong
sinh học phân tử đã đợc áp dụng. Điều này không những đã giúp cho
việc chẩn đoán xác định đợc chính xác hơn mà còn cho phép đi sâu
tìm hiểu về cơ chế bệnh sinh của bệnh. Những kĩ thuật đó là:
- Kĩ thuật phát hiện tự kháng thể dịch thể trong máu.
- Kĩ thuật sinh thiết kết hợp với kĩ thuật sinh học, bao gồm:
+ Kĩ thuật hoá mô miễn dịch.

3
+ Kĩ thuật lai bằng DNA.
+ Kĩ thuật phân tích DNA bằng PCR.
Cơ chế bệnh sinh của các bệnh tự miễn cho đến nay vẫn cha hoàn
toàn đợc sáng tỏ. Dù sao trong cơ chế bệnh sinh của các tổn thơng

1.3.2. Vai trò của cơ địa và đột biến gen trong SLE
1.3.2.1. Vai trò của cơ địa trong SLE
Cơ địa là tổng hợp tất cả các đặc điểm hình thái và chức năng của
cơ thể, những đặc điểm đó khá bền vững, có tính di truyền và quyết
định mức độ phản ứng của cơ thể trớc những yếu tố xâm nhập.
Ngày nay, nhờ những thành tựu trong lĩnh vực miễn dịch gen học,
càng ngày ngời ta càng thấy rõ vai trò của cơ địa trong cơ chế bệnh
sinh của nhiều bệnh, trong đó có các bệnh tự miễn nói chung và SLE
nói riêng. Trong các locus gen tạo nên cơ địa của một cá thể, ngời ta
nói nhiều tới vai trò của hệ thống MHC.
Những mô tả đầu tiên về mối liên quan của các alen thuộc MHC
lớp II với SLE đã đợc công bố khoảng 20 năm trớc đây. Những nhận
xét này sau đó đã đợc xác nhận và thấy là HLA-DR2 và HLA-DR3
gây ra một cách riêng rẽ với nguy cơ tơng đối 2-3 lần cao hơn đối với
sự xuất hiện SLE ở ngời Âu Mĩ. ở những bệnh nhân ngời Mĩ gốc
Phi (là chủng ngời HLA-DR3 không phổ biến), HLA-DR2 và HLA-
DR7 đợc thấy có liên quan với SLE.
1.3.2.2. Vai trò của đột biến gen trong SLE
Tham gia trong cơ chế bệnh sinh của SLE, ngoài vai trò cơ địa (hệ
thống MHC) nh đã nói ở trên, trong những năm gần đây, ngời ta nói
nhiều và tập trung tìm hiểu về vai trò của các gen nhạy cảm với bệnh.
Đó là các gen mã cho các thành phần tham gia trong một số khâu then
chốt thuộc cơ chế bệnh sinh của bệnh, ví dụ receptor với phần Fc của

5
IgG (FcR), các cấu thành của hệ thống bổ thể, các cytokin liên quan
trong phản ứng viêm (TNF, IL-10 ). Khi các gen này có đột biến sẽ
ảnh hởng tới chức năng các sản phẩm do chúng mã hoá và do vậy có
ảnh hởng tới các bệnh có liên quan.
*Mối liên quan của gen m hoá cho Fc

độc tế bào và thực bào.
Tính đa hình thái thờng gặp nhất của
FcRIIIA là một đột biến điểm với sự thay thế T cho G ở vị trí
nucleotide 559 dẫn đến sự thay thế tơng ứng của Phenylalanine (F)
cho Valine (V) ở vị trí 158. Tính đa hình thái này gây ra sự thay đổi về
chức năng, cá thể đồng hợp V/V có khả năng gắn IgG1 và IgG3 tốt
hơn cá thể đồng hợp F/F.
FcRIIIB có hai dạng xác định bằng huyết thanh (NA1 và NA2)
do có 5 điểm khác nhau về nucleotide (G/C, C/T, A/G, G/A và G/A lần
lợt ở các vị trí nucleotide 141, 147, 227, 277 và 349) và dẫn đến 4
điểm khác nhau trong chuỗi amino acid (R/N, N/S, D/N và V/I lần lợt
ở các vị trí amino acid 36, 65, 82 và 106; có một đột biến câm C/T-
147). Tính đa hình thái này có ý nghĩa đối với chức năng sinh lí, khả
năng thực bào ở các cá thể có NA2 kém hơn ở các cá thể có NA1.
*Mối liên quan của gen m hoá cho bổ thể và SLE
Bổ thể bao gồm khoảng 20 protein huyết tơng có chức năng gây
ra đáp ứng viêm, xử lí phức hợp miễn dịch và thải loại các vi khuẩn
gây bệnh. Trong nhiều năm gần đây, ngời ta đã chú ý đến mối liên
quan chặt chẽ giữa sự thiếu hụt các cấu thành bổ thể đầu của con
đờng đặc hiệu (C1, C4, C2) với sự xuất hiện của SLE. SLE xuất hiện
ở gần 100% các cá thể thiếu hụt hoàn toàn C1 và C4, ở khoảng 30-
50% các cá thể thiếu hụt hoàn toàn C2. Cấu thành C4 đợc mã hoá bởi
2 gen, C4A và C4B. C4A null có liên quan với SLE ở một số tộc
ngời khác nhau. Sự thiếu hụt thờng gặp nhất là hiện tợng xoá trên
diện rộng (28kb) làm mất cả gen C4A và gen 21-OH. Sự thiếu hụt
thờng gặp thứ hai là hiện tợng ken thêm vào 2 bp ở codon 1213

7
thuộc exon 29 dẫn đến việc tạo thành bộ ba mã hoá stop, làm ngừng
quá trình tổng hợp chuỗi protein C4A.

1082.
Những hiểu biết sâu sắc và đầy đủ hơn về lĩnh vực gen học trong
SLE là một cơ sở đáng tin cậy cho việc đề xuất các phác đồ điều trị
mới ngày một hiệu quả hơn đối với SLE.
1.4. Chiến lợc điều trị đối với SLE
Điều trị SLE là sự phối hợp nhiều mặt: tuyên truyền, giáo dục;
theo dõi chung về tình trạng nhiễm khuẩn và các yếu tố nguy cơ tim
mạch; điều trị các biến chứng kết hợp với các phác đồ điều trị thuốc
tuỳ thuộc vào từng ngời bệnh.
Phác đồ điều trị SLE luôn đợc thay đổi và ngày càng có hiệu quả
hơn, đó là nhờ vào sự hiểu biết ngày càng tốt hơn về cơ chế bệnh sinh
của bệnh. Có thể chia sự tiến bộ của các phác đồ điều trị SLE làm 3
giai đoạn lớn:
- Giai đoạn 1: các phác đồ kinh điển nhằm ức chế chung đáp ứng
miễn dịch.
- Giai đoạn 2: các phác đồ nhằm ức chế miễn dịch có chọn lọc.
- Giai đoạn 3: các phác đồ điều trị làm thay đổi cơ địa, các phác đồ
này đợc đề xuất nhờ những hiểu biết ngày càng sâu hơn về cơ chế
bệnh sinh mức độ phân tử. Ví dụ vấn đề truyền tế bào gốc tạo máu.
Nhìn chung các phác đồ điều trị theo hớng này còn đang ở giai đoạn
thử nghiệm và kết quả còn hạn chế.

9
Chơng 2: đối tợng v phơng pháp nghiên cứu

Chơng 3: kết quả

3.1. Xác định typ gen của HLA-DRB1

Bảng 3.1. Tần suất các typ gen của HLA-DRB1
ở nhóm bệnh và nhóm chứng
HLA-DRB1 Nhóm bệnh
(n=87)
Nhóm chứng
(n=82)
DR1 0 (0%) 0 (0%)
DR2 22 (25,3%)
*
9 (11,0%)
DR3 10 (11,5%) 8 (9,7%)
DR4 8 (9,2%) 10 (12,2%)
DR5 22 (25,3%) 25 (30,5%)
DR6 7 (8,0%) 7 (8,5%)
DR7 1 (1,1%) 2 (2,4%)
DR8 5 (5,7%) 3 (3,6%)
DR9 8 (9,2%) 13 (15,8%)
DR10 4 (4,6%) 5 (6,1%)
*

2
= 5,77 và p < 0,05

Trong các typ gen, chỉ có tần suất của DR2 ở nhóm bệnh là cao
hơn ở nhóm chứng một cách có ý nghĩa (25,3% so với 11,0%;
2

10 (10,1%)
* 11 (11,8%)
50 (53,8%)
32 (34,4%)
Alen
R131
H131

104 (52,5%)
94 (47,5%)
**

72 (38,7%)
114 (61,3%)

*

2
=16,6 và p<0,01 so với nhóm chứng

**

2
=7,4 và p<0,01 so với nhóm chứng

3.3. Xác định typ gen của FcRIIIA
Sự phân bố tần suất 3 typ gen giữa 2 nhóm khác biệt không có ý

Alen
V158
F158

50 (37,3%)
84 (62,7%)
**

49 (39,5%)
75 (60,5%)

*

2
= 0,36 và p>0,1 so với nhóm chứng

**

2
= 0,13và p>0,1 so với nhóm chứng

3.4. Xác định typ gen của FcRIIIB

Bảng 3.4. Tần suất typ gen và alen của gen mã hoá cho FcRIIIB
Tần suất Nhóm bệnh
(n = 67)
Nhóm chứng
(n = 66)
Typ gen
NA 1/1

2
= 7,5và p<0,01 so với nhóm chứng 13
Sự phân bố tần suất 3 typ gen giữa 2 nhóm khác biệt có ý nghĩa.
Đặc biệt, cá thể đồng hợp NA2/2 ở nhóm bệnh là 18 (26,9%) và nhóm
chứng là 7 (10,6%), sự khác biệt này có ý nghĩa với
2
= 5,77 và
p<0,05.
ở nhóm bệnh, tần suất alen NA2 cao hơn ở nhóm chứng một cách
có ý nghĩa với
2
=7,5 và p<0,01.

3.5. Xác định typ của C4A
Sự thiếu hụt C4A do hiện tợng chèn 2 bp ở codon 1213 thuộc
exon 29 không đợc phát hiện thấy ở cả bệnh nhân SLE và ở cả ngời
chứng. Sự khuếch đại bằng PCR vùng exon 29 chứa vị trí chèn chỉ phát
hiện thấy duy nhất type không bị đột biến (chiều dài đoạn khuếch đại
là 59 bp).

3.6. Xác định typ gen của TNFRII
Kết quả cho thấy không có sự khác nhau có ý nghĩa trong tần suất
typ gen và tần suất alen giữa 2 nhóm bệnh nhân và chứng.
Bảng 3.5. Tần suất typ gen và alen của gen mã hoá cho TNFRII
Tần suất Nhóm bệnh
(n = 44)
Nhóm chứng

**

2
=0,38 và p>0,05 so với nhóm chứng

14
3.7. Xác định typ gen của IL-10 promoter
Bảng 3.6. Tần suất typ gen và alen của gen mã hoá cho IL-10
promoter
Tần suất Nhóm bệnh
(n = 64)
Nhóm chứng
(n = 57)
Typ gen
G/G
G/A
A/A

18 (28,1%)
*
31 (48,4%)
15 (23,4%)

6 (10,5%)
30 (52,6%)
21 (36,8%)
Alen
G
A


ở ngời, các gen HLA nằm trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể số
6, bao gồm HLA lớp I, lớp II và lớp III.
Trong vùng DRB (thuộc HLA lớp II), năm locus gen đã đợc
nhận biết, kí hiệu là DRB1, DRB2, DRB3, DRB4 và DRB5. Trong đó

15
locus DRB1 đợc xem là quan trọng nhất trong việc kiểm soát đáp ứng
miễn dịch cũng nh trong việc tạo ra các quyết định kháng nguyên
khác alen cùng loài chính.
Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy chỉ có tần suất của DR2 ở
nhóm bệnh là cao hơn ở nhóm chứng một cách có ý nghĩa (25,3% so
với 11,0%;
2
= 5,77; p < 0,05), điều này thể hiện mối liên quan của
DR2 với sự xuất hiện SLE ở ngời Việt nam.
Cũng giống nh kết quả nghiên cứu của chúng tôi, các tác giả
khác khi khảo sát ở các tộc ngời Đông Nam á nói riêng và châu á
nói chung (Nhật bản, Hàn quốc, Trung quốc, Thái lan, Malaysia) đều
nhận thấy mối liên quan của SLE với HLA-DR2. Kết quả nghiên cứu
của chúng tôi một lần nữa khẳng định DR2 là typ gen chủ yếu của
locus HLA-DRB1 qui định tính nhạy cảm với SLE ở những tộc ngời
Đông Nam á nói riêng và châu á nói chung.
4.2. Các gen mã hoá cho FcR
Gần đây nhiều nghiên cứu đã nhận thấy tính đa hình thái của
FcR có vai trò nh những yếu tố di truyền ảnh hởng đến tính nhạy
cảm đối với SLE và nhiều bệnh tự miễn khác.
4.2.1. Gen mã hoá cho FcRIIA
FcRII ở ngời là một glycoprotein có khối lợng phân tử 40 kD,
chỉ gắn IgG dới dạng phức hợp và có sự phân bố rộng rãi nhất trên bề
mặt tế bào. Cho đến nay, tính đa hình thái chỉ đợc thấy ở FcRIIA.

valin (V) thành phenylalanin (F) ở vị trí amino acid 158 trong domain
giống Ig gần màng. FcRIIIA-158F có khả năng gắn IgG1 và IgG3
thấp hơn FcRIIIA-158V và xuất hiện với tần suất cao ở bệnh nhân
SLE.
Sự phân bố tần suất typ gen FcRIIIA trong nghiên cứu của
chúng tôi ở bệnh nhân SLE ngời Việt nam cho thấy không có sự khác

17
biệt có ý nghĩa giữa nhóm bệnh và nhóm chứng. Kết quả nghiên cứu
của chúng tôi phù hợp với kết quả của một số tác giả khi khảo sát trên
bệnh nhân ngời Nhật bản, Hàn quốc và ngời Mĩ gốc Phi. Trái lại,
kết quả của chúng tôi không phù hợp với kết quả khảo sát ở ngời Âu
Mĩ, ở tộc ngời này tần suất alen FcRIIIA-158F ở nhóm bệnh cao
hơn nhóm chứng một cách có ý nghĩa (74% so với 57%, p<0,01).
Nh vậy, theo kết quả nghiên cứu của chúng tôi, không có sự
khác biệt có ý nghĩa trong sự phân bố tần suất typ gen và alen của gen
mã hoá cho FcRIIIA giữa nhóm bệnh và nhóm chứng. Vậy, phải
chăng tính đa hình thái của gen mã hoá cho FcRIIIA không có vai trò
trong cơ chế bệnh sinh của SLE ở ngời Việt nam.
4.2.3. Gen mã hoá cho FcRIIIB
Tính đa hình thái của FcRIIIB có ý nghĩa đối với chức năng
sinh lý, cá thể mang NA2 có khả năng thực bào kém hơn cá thể mang
NA1. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tần suất NA2 ở nhóm
bệnh cao hơn một cách có ý nghĩa so với nhóm chứng. Kết quả này
phù hợp với kết quả khi nghiên cứu trên bệnh nhân SLE ở ngời Nhật
bản. Mặt khác, khi khảo sát trên ngời Âu Mĩ cũng nh ngời
Malaysia và Trung quốc, các tác giả lại thấy không có sự liên quan
giữa tính đa hình thái của FcRIIIB và SLE.
Nh vậy theo kết quả nghiên cứu của chúng tôi trên bệnh nhân
SLE ngời Việt nam, tần suất alen NA2 (alen tạo cho FcRIIIB khả

bổ thể C4A không gặp ở bệnh nhân SLE ngời Nhật bản, ngời Hàn
quốc và ngời Trung quốc.
Nh vậy, kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy không có
tình trạng thiếu hụt C4A do hiện tợng chèn 2 bp ở codon 1213 thuộc
exon 29. Vậy, phải chăng trong cơ chế bệnh sinh của SLE ở ngời Việt
nam không có vai trò của tình trạng thiếu hụt C4A.

19
4.4. Gen mã hoá cho TNFRII
Cho tới nay đã có một số nghiên cứu về mối liên quan giữa tính
đa hình thái của gen mã hoá cho TNFRII với bệnh SLE. Khi khảo sát ở
bệnh nhân SLE ngời Nhật bản, ngời ta thấy tần suất alen 196R tăng
một cách có ý nghĩa so với nhóm chứng. Trái lại, ngời ta không thấy
sự khác biệt có ý nghĩa nào trong tính đa hình thái của gen mã hoá cho
TNFRII ở hai nhóm bệnh và chứng ở ngời Tây ban nha, ngời Anh và
ngời Hàn quốc. Trong nghiên cứu này, khi khảo sát ở bệnh nhân SLE
ngời Việt nam chúng tôi cũng nhận thấy không có mối liên quan giữa
tính đa hình thái của gen mã hoá cho TNFRII với sự xuất hiện SLE.
Nh vậy, theo kết quả nghiên cứu của chúng tôi trên bệnh nhân
SLE ngời Việt nam, không có sự khác biệt có ý nghĩa trong sự phân
bố tần suất typ gen và alen của gen mã hoá cho TNFRII giữa nhóm
bệnh và nhóm chứng. Vậy, phải chăng tính đa hình thái của gen mã
hoá cho TNFRII không có vai trò trong cơ chế bệnh sinh của SLE ở
ngời Việt nam.
4.5. Gen mã hoá cho IL-10 promoter
Tăng sản xuất IL-10 có thể tham gia trong cơ chế bệnh sinh của
SLE thông qua việc tạo ra tự kháng thể bởi tế bào B. Trong nghiên cứu
này trên ngời Việt nam, chúng tôi nhận thấy tần suất alen G (qui định
việc tăng sản xuất IL-10) của gen mã hoá cho IL-10 promoter -1082 ở
nhóm bệnh nhân SLE cao hơn nhóm chứng một cách có ý nghĩa. Nh

các quần thể có nguồn gốc khác nhau. Cuối cùng, đó là ảnh hởng của
môi trờng sống khác nhau giữa các dân tộc tác động qua nhiều thế
hệ.
Nhờ những hiểu biết về cơ chế bệnh sinh của SLE ở mức độ gen
học và sinh học phân tử, ngày nay ngời ta đã đề xuất những phác đồ
điều trị mới đối với SLE. Sau đây là một số loại thuốc chính.

21
4.7. Một số thuốc điều trị mới
4.7.1. Các thuốc làm giảm sản xuất hoặc loại bỏ tự kháng thể
LJP 394
Một chế phẩm triethylene glycol đợc gắn với 4 epitop dsDNA,
mỗi epitop có 20 bp. Hợp chất này, có tên là LJP 394, trọng lợng
phân tử 54 kD sẽ gắn với globulin miễn dịch bề mặt kháng dsDNA của
các tế bào B sản xuất kháng thể kháng dsDNA mà không cần sự tham
gia của tế bào Th. Sự kết hợp này dẫn đến hiện tợng chết theo chơng
trình của các tế bào B.
Rituximab
Rituximab, một kháng thể đơn dòng thể khảm kháng CD20 của
ngời, làm giảm nhanh chóng các tế bào B mang dấu ấn CD20 trong
máu thông qua hiện tợng gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể và độc
tế bào qua trung gian bổ thể. Bằng cách này, rituximab gây cảm ứng
hiện tợng chết theo chơng trình (apoptosis) và ức chế sự phát triển
của tế bào.
Loại bỏ các tự kháng thể
Loại bỏ hoàn toàn các tự kháng thể bằng cách thay huyết tơng
hoặc kích thích sự xuất hiện kháng thể kháng idiotyp để phong bế
chúng. Tiêm globulin miễn dịch vào tĩnh mạch có lẽ là dựa vào sự hiện
diện của các kháng thể kháng idiotyp tự nhiên đối với các tự kháng thể
bệnh lí.

và IL-8, sau đó là làm thay đổi phức hợp miễn dịch lu hành. Vì vậy,
dùng kháng thể kháng TNF sẽ làm giảm các tác dụng trên.
4.7.4. Phác đồ làm thay đổi cơ địa
Làm thay đổi cơ địa bằng truyền tế bào gốc là một vấn đề thời sự
hiện nay, không những đợc áp dụng trong các bệnh tự miễn (trong đó
có SLE) mà còn đợc áp dụng trong nhiều bệnh khác.