BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ Y TẾ
ĐỀ TÀI ĐỘC LẬP CẤP NHÀ NƯỚC BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

TÊN ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG
NGÂN HÀNG TẾ BÀO GỐC DÂY RỐN KHU VỰC MIỀN NAM
VÀ ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ BỆNH Ở NGƯỜI
MÃ SỐ: ĐTĐL 2007/03 Cơ quan chủ trì đề tài: Công ty cổ phần hoá dược phẩm Mekophar
Chủ nhiệm đề tài: DS. Đặng Thị Kim Lan (Cty Mekophar)
Phó Chủ nhiệm đề tài: TS. Lê Văn Đông (Học viện Quân y)

IL
L
I
I
Ệ
Ệ
U
U 1. VĂN BẢN XÁC NHẬN VỀ SỰ THOẢ THUẬN CỦA CÁC TÁC GIẢ
VỀ VIỆC SẮP XẾP THỨ TỰ TÊN TRONG DANH SÁCH THỰC HIỆN
2. DANH SÁCH CÁN BỘ KHOA HỌC THAM GIA ĐỀ TÀI
3. BÁO CÁO THỐNG KÊ ĐỀ TÀI
4. BÁO CÁO KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CỦA ĐỀ TÀI
5. PHỤ LỤC BÁO CÁO KẾT QUẢ

CÔNG TY CỔ PHẦN HOÁ DƯỢC PHẨM
MEKOPHAR
__________________
CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Tp. Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 12 năm 2010

Chủ nhiệm đề tài/dự án DS. Đặng Thị Kim Lan
Thủ trưởng tổ chức chủ trì đề tài DS. Huỳnh ThịLan - 1 -
ĐỀ TÀI ĐỘC LẬP CẤP NHÀ NƯỚC:
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG NGÂN HÀNG TẾ BÀO GỐC DÂY RỐN
KHU VỰC MIỀN NAM VÀ ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ BỆNH Ở NGƯỜI
MÃ SỐ: ĐTĐL 2007/03 DANH SÁCH CÁN BỘ THAM GIA ĐỀ TÀI STT HỌ VÀ TÊN CƠ QUAN CÔNG TÁC
1. GS.TSKH. Phạm Mạnh Hùng
(Cố vấn khoa học)


25. YS. Đinh Thị Hải - nt -
26. YS. Nguyễn Xuân Trường - nt -
27. TS.BS. Phạm Việt Thanh Bệnh viện Từ Dũ
28. BS. CKII Huỳnh Văn Nhàn - nt -
29. BS. Ngô Thị Phương Mai - nt -
30. BS. Bùi Đặng Lan Hương - nt -
31. CN. Phan Thị Phương Trinh - nt -
32. NHS. Lâm Lâm Tuyền - nt -
33. NHS. Phạm Thị Thuý Phương - nt -
34. NHS Phan T Thanh Kim Huệ - nt -
35. NHS Phan Thị Rỷ - nt -
36. NHS. Nguyễn Thị Ngọc Trâm - nt -
37. TS.BS. Ngô Đăng Sơn Anh Bệnh viện An Sinh
38. TS.BS. Trần Quang Tuấn - nt -
39. BS. Huỳnh Thị Trong - nt -
40. BS. Trần Hùng Dũng - nt -
41. BS Nguyễn Thị Huệ - nt -
42. ThS.BS. Nguyễn Xuân Vũ Bệnh viện 175
43. ThS.BS. Lê Văn Hiền Bệnh viện Đại học Y Dược Tp.HCM
44. NHS. Trần Hà Diễm - nt -

- 3 -
45. PGS.TS. Phan Toàn Thắng Đại học Quốc gia Singapore
46. ThS. Phạm Văn Phúc Đại học KHTN, ĐHQG Tp.HCM
47. ThS. Trương Hải Nhung - nt -
48. TS. Bùi Xuân Nguyên Viện CNSH, Viện KHCNVN
49. TS. Nguyễn Thị Ước - nt -
50. Nguyễn Thị Mến - nt -
51. Trần Thị Thơm - nt -
52. TS.BS. Đinh Văn Hân Viện Bỏng Quốc Gia

L
Ụ
Ụ
C
C

Mục lục i
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt v
Danh mục các bảng viii
Danh mục các hình vẽ, đồ thị xi

MỞ ĐẦU 1
Chương I – TỔNG QUAN 4
1.1. Tế bào gốc và ngân hàng tế bào gốc 4
1.1.1. Tế bào gốc là gì và tại sao cần lập ngân hàng tế bào gốc 4
1.1.2. Tế bào gốc dây rốn 7
1.1.3. Ngân hàng tế bào gốc dây rốn 8
1.1.4. Tiêu chuẩn của ngân hàng TBG máu dây rốn 9
1.1.5. Định danh TBG 14
1.1.6. Quản lý dữ liệu ngân hàng TBG 15
1.2. Biệt hoá in vitro
tế bào gốc dây rốn 16
1.2.1. Biệt hoá TBG tạo tế bào mỡ, tế bào giống tế bào thần kinh
và tế bào giống tế bào cơ tim 16
1.2.2. Biệt hoá TBG dây rốn 17

ii

2.1.14. Xét nghiệm HLA 34
2.1.15. Thiết kế phần mềm quản lý các mẫu TBG trong ngân hàng 34
2.2. Nội dung 2: Nghiên cứu biệt hoá TBG máu dây rốn và TBG
màng dây rốn thành một số loại tế bào có hình thái chuyên biệt 44
2.2.1. Biệt hóa TBG trung mô máu dây rốn thành tế bào mỡ 44
2.2.2 Biệt hóa TBG màng dây rốn theo hướng thành tế bào thần kinh 44
2.2.3. Biệt hóa TBG màng dây r
ốn theo hướng thành tế bào cơ tim 47
2.3. Nội dung 3: Nghiên cứu ứng dụng TBG dây rốn để điều trị bệnh
trên thực nghiệm và lâm sàng 48
2.3.1. Đối tượng nghiên cứu 48
2.3.2. Đánh giá tác dụng của TBG màng dây rốn lên vết bỏng 50
2.3.3. Đánh giá tác dụng của TBG màng dây rốn lên vết thương trên nền
đường máu cao 51
2.3.4. Xử lí số liệu 52
2.3.5. Ứng dụng TBG máu dây rốn để điều trị bệnh trên lâm sàng 53

Chương III – KẾT QU
Ả VÀ BÀN LUẬN
3.1. Nội dung 1: Xây dựng và vận hành ngân hàng tế bào gốc dây rốn 62
3.1.1. Cơ sở hạ tầng phòng thí nghiệm 62
iv
3.1.2. Thu thập, xử lý và bảo quản TBG máu dây rốn 64
3.1.3. Chất lượng của các mẫu TBG máu dây rốn sau bảo quản đông lạnh 73
3.1.4. Phân lập và định danh TBG màng dây rốn 75
3.1.5. Phân lập TBG trung mô từ máu dây rốn 84
1.3.6. Xây dựng phần mềm quản lý ngân hàng TBG dây rốn 85
3.2. Nội dung 2: Biệt hoá TBG máu dây rốn và TBG màng dây rốn
thành một số loại tế bào có hình thái chuyên biệt 92
3.2.1. Biệt hóa TBG trung mô máu dây rốn thành tế bào mỡ 92

TBG lập ngân hàng.
6. Danh sách các bé hiến dây rốn được khám và xét nghiệm kiểm tra sức
khoẻ sau 1 tuổi
7. Bảng tổng hợp kết quả xử lý phân lập TBG dây rốn và bộ hồ sơ hoàn chỉnh
của một sản phụ hiến dây rốn và các mẫu TBG thu được.
8. Kết quả xét nghiệm HLA các mẫu TBG có trong ngân hàng
9. Một số hình ảnh kết quả nghiên cứu và ho
ạt động của Đề tài

vi

D
D
A
A
N
N
H
HM
M
Ụ
Ụ
C
CC

AABB Hiệp hội ngân hàng máu Hoa Kỳ (American Association of
Blood Banks)
ABCG2 ATP-binding cassette sub-family G member 2
BC Bạch cầu
BCHTT Bạch cầu hạt trung tính
bFGF Basic fibroblast growth factor (Yếu tố tăng trưởng nguyên
bào sợi căn bản)
BN Bệnh nhân
CFU Đơn vị tạo bào lạc (Colony forming unit)
CK-18 Cytokeratin 18
CK-19 Cytokeratin 19
CLEC Tế bào gốc biểu mô màng dây rốn (Cord lining epithelial
stem cell)
CLMC Tế bào gốc trung mô màng dây rốn (Cord lining
mesynchymal stem cell)
CRC CellResearch Corporation
D Ngày (day)
DMSO Dimethyl sulfoxide
ĐVDT Đơn vị diện tích
vii
EGF Yếu tố tăng trưởng biểu bì (Epidermal growth factor)
FACT Foundation for the Accreditation of Cellular Therapy
GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
HC Hồng cầu
HES Hydroxyethyl starch
hGAPDH Human glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
HLA Kháng nguyên bạch cầu người (Human Leukocyte Antigen)

TM-HH Truyền máu – Huyết học
Tp.HCM Thành phố Hồ Chí Minh
TTM Tiêm tĩnh mạch
US FDA Cục quản lý dược phẩm và thực ph
ẩm Hoa Kỳ (United State
Food and Drug Administration)
VEGF Vascular endothelial growth factor (Yếu tố tăng trường nội
mô mạch máu)
VK Vi khuẩn
ix

D
D
A
A
N
N
H
HM
M
Ụ
Ụ
C
CC

Tên các phòng thí nghiệm và trang thiết bị chủ yếu 58
Bảng 3.2:
Cân nặng, tuổi thai và lượng máu máu dây rốn thu được 65
Bảng 3.3:
Phân bố lượng máu dây rốn thu được theo tuổi thai, cân
nặng của trẻ và phương pháp thu thập 65
Bảng 3.4:
Tỷ lệ
các nguyên nhân phải loại bỏ mẫu máu dây rốn 67
Bảng 3.5:
Kết quả xử lý tách TBG máu dây rốn 69
Bảng 3.6 :
Kết quả đánh giá tế bào sau bảo quản đông lạnh 74
Bảng 3.7:
Kết quả PCR với tế bào biệt hóa hướng tiền thần kinh 101
Bảng 3.8:
Diễn biến vết bỏng sau ghép TBG biểu mô 107
Bảng 3.9:
Thay đổi diện tích vết thương sau ghép TBG biểu mô 108
Bảng 3.10:
Tốc độ biểu mô hoá v
ết thương ghép TBG biểu mô 108
Bảng 3.11:
Liên quan thời gian và số vết thương khỏi hoàn toàn 109
x
Bảng 3.12:
Tần suất xuất hiện vi khuẩn qua các thời điểm nghiên cứu 109
Bảng 3.13:
Mật độ vi khuẩn ở các vết thương cấy khuẩn dương tính 111
Bảng 3.14:

Bảng 3.28:
Đặc điểm hình thái mô vết thương tại các thời điểm 124
Bảng 3.29:
Thay đổi số lượng tế bào viêm tại mô vết thương 125
Bảng 3.30:
Thay đổi số lượng nguyên bào sợi tại mô vết thương 125
Bảng 3.31:
Thay đổi số lượng tân mạch tại mô vế
t thương 126
Bảng 3.32:
Thay đổi chỉ số phân bào lớp mầm tại mô vết thương 126
Bảng 3.33:
Diễn biến tại chỗ vết thương 129
xi
Bảng 3.34:
Thay đổi nồng độ Glucose máu 130
Bảng 3.35:
Thay đổi cân nặng chuột thí nghiệm 131
Bảng 3.36:
Thay đổi diện tích vết thương 132
Bảng 3.37:
Tốc độ thu hẹp vết thương 134
Bảng 3.38:
Thời gian liền vết thương 135
Bảng 3.39:
Sự thay đổi các chỉ số huyết học 136
Bảng 3.40:
Kết quả xét nghiệm sinh hóa máu chuột 137
Bảng 3.41:
Danh sách bệnh nhân dự tuyển ghép TBG máu dây rốn 156

CC
C
Á
Á
C
CH
H
Ì
Ì
N
N
H
H TRANG
Hình 1.1:
Phân loại TBG theo nguồn gốc và thời điểm phân lập 5
Hình 1.2:

Số đơn vị TBG máu dây rốn công tính đến tháng 10/2010

Hình 3.5:
Kết quả phân tích bằng kỹ thuật western blot biểu hiện của
các kháng nguyên hoà hợp mô HLA-G và HLA-E ở các
TBG biểu mô và TBG trung mô màng dây rốn 78
Hình 3.6:
Mức độ biểu hiện của một số gen ở TBG biểu mô màng dây
rốn khảo sát bằng Realtime-PCR
79
Hình 3.7:
Biểu hiện của albumin ở TBG biểu mô màng dây rốn 80
Hình 3.8:
Biểu hiện của và mucin-1 (CD227),
CK18 và CK19ở TBG
biểu mô màng dây rốn 81
Hình 3.9:
Tỷ lệ % tế bào trong chế phẩm TBG trung mô màng dây
rốn dương tính với các dấu ấn bề mặt khảo sát bằng
flowcytometry 82
Hình 3.10:
Mức độ biểu hiện của một số dấu ấn bề mặt của TBG trung
mô màng dây rốn khảo sát bằng kỹ thuật flowcytometry
83
Hình 3.11:
TBG trung mô máu dây rốn trong quá trình phân lập và cấy
chuyền 84
Hình 3.12:
Biểu hiện một số dấu ấ
n bề mặt của TBG trung mô máu
dây rốn 85
Hình 3.13:

Kết quả PCR với TBG màng dây rốn biệt hóa theo hướng
tạo tế bào tiền thần kinh và tế bào cơ tim
100
Hình 3.26:
Hình thái và kết quả nhuộm MD huỳnh quang các TBG
màng dây rốn trước và sau biệt hoá theo hướng tạo tế bào
cơ tim 104
Hình 3.27:
Thay đổi cân nặng thỏ ghép TBG biểu mô màng dây rốn 106
Hình 3.28:
Chủng loại vi khuẩn vết b
ỏng đắp tấm TBG biểu mô 110
Hình 3.29:
Chủng loại vi khuẩn vết bỏng đắp màng transwell 110
Hình 3.30:
Thay đổi cân nặng thỏ ghép TBG trung mô màng dây rốn 116
Hình 3.31:
Chủng loại vi khuẩn vết thương vùng nghiên cứu 123
Hình 3.32:
Chủng loại vi khuẩn vết thương vùng đối chứng 123
Hình 3.33:
Hình thái cấu trúc mô vết thương vùng A trước ghép TB 127
Hình 3.34:
VT vùng A ngày nghiên cứu thứ 5 127
xv
Hình 3.35:
Mô vết thương vùng A ở ngày nghiên cứu thứ 10 128
Hình 3.36:
Thay đổi nồng độ Glucose máu chuột 130
Hình 3.37:

Tế bào gốc (TBG) là tế bào có khả năng biệt hoá thành nhiều loại tế bào
khác để thay thế cho các tế bào bị mất đi do già và chết tự nhiên hay do chấn
thương vì nhiều nguyên nhân khác nhau, vì vậy có thể sử dụng TBG để tạo ra
các tế bào mới thay thế cho các tế bào bị tổn thương hoặc mất chức năng, đem
lại triển vọng chữa được nhiều bệnh nan y. Ghép TBG từ tuỷ xươ
ng, từ máu
ngoại vi hay từ máu dây rốn đã được tiến hành để chữa thành công nhiều bệnh
về cơ quan tạo máu, bệnh chuyển hoá và suy giảm miễn dịch bẩm sinh. Bên
cạnh đó một số thử nghiệm lâm sàng ứng dụng TBG để chữa các bệnh nan y
khác như tiểu đường týp I, bại não, suy tim sau nhồi máu cơ tim, liệt do chấn
tương tuỷ sống, một số bệnh ung thư và bệnh lý gen v.v. cũ
ng đang được triển
khai ở nhiều nước trên thế giới trong đó có Việt Nam.
Dây rốn và nhau thai nối thai nhi với hệ thống tuần hoàn của người mẹ, có
chức năng đảm bảo quá trình trao đổi chất giữa thai nhi và cơ thể mẹ. Các
nghiên cứu phôi thai học và kháng nguyên bạch cầu người (Human Leukocyte
Antigen – HLA) của các tế bào từ dây rốn cho thấy chúng có nguồn gốc từ
thai nhi chứ không phải từ người mẹ. Các nghiên c
ứu về TBG cho thấy dây
rốn có nhiều loại TBG bao gồm các TBG tạo máu, TBG biểu mô, TBG trung
mô, TBG nội mô chứa trong máu dây rốn, trong lớp gel Wharton (Wharton’s
jelly) hay trong lớp màng bao dây rốn. Các TBG này có thể dùng ngay để
chữa bệnh hay làm nguyên liệu để nghiên cứu biệt hoá tạo ra các chế phẩm tế
bào phục vụ cho chữa bệnh hoặc phát triển thuốc.
Ở nước ta, ước tính hàng năm riêng nhu cầu điều trị bệnh máu bằng ghép
TBG tạo máu cũng đã khoả
ng 300-500 trường hợp. Nhu cầu điều trị các
khuyết hổng mô và suy chức năng tế bào/cơ quan mà triển vọng có thể áp

2


3
1. Nghiên cứu xây dựng và vận hành Ngân hàng TBG dây rốn. Do
Công ty cổ phần hoá dược phẩm Mekophar, Học viện Quân y, Bệnh
viện Từ Dũ, Bệnh viện An Sinh, Khoa Phụ sản Bệnh viện Đại học Y
Dược Tp.HCM, Phòng thí nghiệm tế bào gốc thuộc trường Đại học
KHTN Đại học Quốc gia Tp.HCM, Phòng thí nghiệm CellResearch
Corporation (Đại học Quốc gia Singapore) phối hợp thực hiện.
2. Nghiên cứu biệt hoá TBG máu dây rốn và TBG màng dây r
ốn thành
một số loại tế bào có hình thái chuyên biệt. Do Phòng thí nghiệm tế
bào gốc thuộc trường Đại học KHTN Đại học Quốc gia Tp.HCM và
Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt
Nam thực hiện.
3. Nghiên cứu ứng dụng TBG dây rốn để điều trị bệnh trên thực
nghiệm và lâm sàng. Do Viện Bỏng Quốc gia, Bệnh viện Y học cổ
truyền Trung
ương và Bệnh viện Truyền máu-Huyết học Tp. HCM
thực hiện.
Thành công của Đề tài này trước hết là giữ được những loại tế bào đặc
biệt từ máu và từ màng dây rốn để phục vụ cho mục đích nghiên cứu khoa
học và chữa bệnh sau này. Sản phẩm là các mẫu TBG mà Đề tài tạo ra còn có
thể đem trao đổi giữa các cơ sở nghiên cứu, điều trị khác nhau trong nước
cũ
ng như quốc tế. Điều này được minh chứng bằng ứng dụng điều trị bệnh ở
người mà Đề tài đã thực hiện. Người còn cơ hội cất giữ hoặc hiến TBG dây
rốn giúp cứu chữa người cần TBG để điều trị nhưng đã lỡ cơ hội cất giữ TBG
trước đó, đây là ý nghĩa nhân đạo và xã hộ
i cao cả của Đề tài. Bên cạnh đó,
các kết quả biệt hoá TBG từ máu và màng dây rốn và thử nghiệm điều trị các

G
GQ
Q
U
U
A
A
N
N
1.1. TẾ BÀO GỐC VÀ NGÂN HÀNG TẾ BÀO GỐC
1.1.1. Tế bào gốc là gì và tại sao cần lập ngân hàng tế bào gốc
Tế bào gốc (TBG) là những tế bào chưa có chức năng chuyên biệt, chúng
có khả năng tăng sinh mạnh mẽ, có tiềm năng phát triển thành nhiều loại tế
bào khác nhau và có khả năng tự thay mới. Nhờ những đặc điểm này mà TBG
đã thu hút được sự quan tâm nghiên cứu ứng dụng để chữa một s
ố bệnh của
cơ quan tạo máu, một số bệnh di truyền bẩm sinh liên quan đến chuyển hoá và
suy giảm miễn dịch, ung thư máu, và có nhiều hứa hẹn dùng để chữa được
nhiều bệnh nan y như tiểu đường, liệt do chấn tương tuỷ sống, suy tim do tổn
thương cơ tim, một số bệnh ung thư và bệnh lý gen [12, 14, 15, 27, 41, 85,
93]. Để thực hiện được các ứng dụng này, cần phải th
ực hiện 3 nhóm công
việc chính của công nghệ TBG là:
- Phân lập, bảo quản các loại TBG từ các nguồn khác nhau.