Bộ y tế
viện huyết học truyền máu trung ơng
tổng kết
đề tài nghiên cứu khoa học
cấp bộ
Nghiên cứu ứng dụng quy trình thu gom,
làm sạch và bảo quản tế bào gốc sinh máu
sử dụng cho ghép tuỷ đồng loài
Chủ nhiệm đề tài :
GS. TSKH. Đỗ Trung Phấn
Cơ quan chủ trì :
Viện Huyết học - Truyền máu TW
Viện trởng: PGS. TS. Nguyễn Anh Trí
7596
20/01/2010 Hà Nội, 11/ 2008
GS.TSKH. Đỗ Trung Phấn
Danh sách
Các thành viên tham gia nghiên cứu Chủ nhiệm đề tài :
GS. TSKH. Đỗ Trung Phấn
Th ký đề tài :
ths. nguyễn Quang Tùng
Cán bộ nghiên cứu Chức danh khoa học
1. Đỗ Trung Phấn GS. TSKH (Viện HHTMTW)
2. Nguyễn Quang Tùng ThS Y khoa (Đại học Y HN)
3. Trần Thị Mỹ Dung ThS Y học (Đại học Y HN)
4. Nguyễn Thị Thu Hà PGS. TS (QY 108)
5. Lê Xuân Hải TS (Viện HHTMTW)
6. Lý Tuấn Khải TS (QY 108)
7. Nguyễn Tiến Hải BSCKI (QY 108)
8. Trần Hồng Thủy BSCKII (Viện HHTMTW)
Với sự hỗ trợ của tập thể cán bộ công nhân viên Viện Huyết học Truyền
máu, và bộ môn HHTM, Đại học Y Hà Nội. Đặt vấn đề
Tế bào gốc- một vấn đề lớn của nhân loại thế kỷ XXI. Tế bào gốc đang
hàng tế bào gốc là cần thiết, đặc biệt là ngân hàng máu cuống rốn. Đây là
nguồn vô tận, bỏ đi nhng dễ thu hoạch. Trên thế giới đã có hàng trăm ngân
hàng máu cuống rốn, các ngân hàng đó đã l trữ đợc hàng vạn mẫu máu
cuống rốn đã đợc sàng lọc và loại bỏ các bệnh nhiễm trùng, di truyền, đã xác
định đợc Phenotype HLA, nhóm máu ABO, tạo ra nguồn lựa chọn tối u cho
điều trị. HLA đóng vai trò quyết định thành công của ghép, nếu có nguồn
ngời cho tơng đồng 6/6 hoặc 5/6 phenotype thì tiên lợng thành công rất
cao. Chính vì lẽ đó việc xây dựng ngân hàng tế bào gốc và thực hiện trao đổi
quốc tế trong khu vực và thế giới thì tần suất tìm đợc nguồn cho tơng đồng
là rất lớn, kết quả ghép tế bào gốc càng cao.
ở Việt Nam, bệnh viện Truyền máu Huyết học TP Hồ Chí Minh đã có
ngân hàng máu cuống rốn từ 2005, hiện đã chọn đợc >1400 mẫu, bớc đầu
đã sử dụng ghép đồng loài cho 5 bệnh nhân Thalasemia có kết quả[9]. ở miền
Bắc có một số nơi áp dụng ghép tế bào gốc, nhng cha có ngân hàng tế bào
gốc. Do đó viện Huyết học-Truyền máu TW đã có kế hoạch xây dựng ngân
hàng tế bào gốc cung cấp cho điều trị.
Xuất phát từ yêu cầu trên đây năm 2002, mặc dù có rất nhiều việc làm
cho chơng trình an toàn truyền máu (dự án WB), trang thiết bị thiếu thốn, cơ
sở chật hẹp, nhng chúng tôi đã đề nghị Bộ Y tế xét duyệt đề tài này nhằm
góp phần chuẩn bị các điều kiện về kỹ thuật và cán bộ cho xây dựng ngân
hàng tế bào gốc tại Viện Huyết học-Truyền máu TW phục vụ cho khu vực
phía Bắc, với 2 mục tiêu sau đây:
1. Nghiên cứu ứng dụng quy trình thu gom, làm sạch và bảo quản tế bào
gốc máu ngoại vi huy động, tuỷ xơng, máu cuống rốn sử dụng cho ghép tế
bào gốc đồng loài.
2. Nghiên cứu đánh giá kết quả bảo quản dài ngày tế bào gốc ở nhiệt độ -
196
0
C.
trí: tuỷ xơng, máu ngoại vi, máu cuống rốn, giác mạc, não cơ tim, xơng,
gan, da ở đây chúng vừa là tế bào dạng nghỉ ngơi, vừa là dạng tế bào
thờng trực để khi cần thiết có nhu cầu chúng sẽ biệt hoá thành các tế bào
gốc kế cận tạo ra các tế bào chức năng [72].
1.1.2. Xếp loại và danh pháp tế bào gốc trùm (H.1)
Có 2 phơng pháp[21]:
a) Theo khả năng sinh sản và biệt hoá
* TBG toàn năng: tế bào gốc trùm (gangleader- stem cells) hay còn gọi
là tế bào gốc nguyên thuỷ (primitive stem cells) hay tế bào gốc toàn năng
(Totipotent stem cells) điều hoà chung sự phát triển của cơ thể, tạo ra tế bào
gốc của tất cả các cơ quan trong cơ thể.
* TBG đa năng (pluripotent stem cells hay multipotent stem cells) là
TBG trùm của các dòng tế bào riêng biệt thuộc cùng 1 cơ quan, nh cơ quan
tạo máu, cơ tim, xơng, tuyến tuỵ.
* TBG đơn năng (Unipotent stem cells) hay còn gọi là TBG đầu dòng,
chỉ sinh ra 1 dòng tế bào nhất định (ví dụ dòng hồng cầu: CFU-E).
b) Theo hớng phát triển phôi
* TBG phôi: Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng tế bào gốc phôi,
tơng tự nhu tế bào gốc trùm đã mô tả ở trên, khi nuôi tổ chức bào thai
trong môi trờng có các chất kích thích tăng trởng nh IL-3, Transferrin,
Albumin, Retinoic acid, erythropoietin tế bào gốc phôi đã phát triển thành
các tế bào máu nh HC, bạch cầu , tiểu cầu [77,79]. Tơng tự nh vậy, các
nhà nghiên cứu đã thành công khi xây dựng mô hình biến tế bào phôi bất động
thành tế bào cơ tim có thể co bóp đợc (59).Tế bào gốc phôi cũng có thể biến
thành tế bào biểu mô sắc tố võng mạc, và nếu đợc nuôi cấy trong môi trờng
thích hợp chúng sẽ biệt hoá thành tế bào có khả năng cảm thụ ánh sáng [73].
* TBG thai: Gần đây Phan Toàn Thắng đã phân lập thành công và nuôi tế
bào gốc từ màng đáy dây rốn trẻ sơ sinh trong môi trờng thích hợp đã tạo ra
đợc tế bào tuyến tuỵ và tế bào thần kinh trởng thành [71].
1.2. Tế bào gốc tạo máu(memopoietic stem cells: HSC)
1.2.1. Đặc điểm tế bào gốc tạo máu
HSC là các tế bào đợc tách ra từ tế bào gốc trùm, chúng có đặc điểm sau:
- Có khả năng tự tái tạo (self renewal) để tự duy trì nòi giống của chúng
nhng chỉ có tế bào gốc toàn năng có dấu ấn CD34 mới có khả năng này.
- Chúng có dấu ấn đặc hiệu CD34 có thể nhận biết đợc.
- Có khả năng sinh sản và biệt hoá thành tất cả các tế bào máu trởng thành.
Tế bào gốc = TBG
(Stem cells)
Theo khả năng sinh sản
TBG "Trùm" (gang-leader SC)
(TBG toàn năng - Totipotent stem cells)
TBG đa năng
(Multipotent SC)
TBG sinh sản nhiều dòng TB
TBG đơn năng
(Unipotent SC = TBG đơn dòng)
TBG chỉ sinh 1 dòng TB
cho 1 cơ quan
Apoptosis
Theo quá trình phát triển
TBG phôi
TBG thai
TBG trởng thành
TBG "Trùm"
các cơ quan
TBG
thần
kinh
TBG
(differentiation) của HSC, có thể xếp HSC thành 3 nhóm nh sau:
- Tế bào gốc tạo máu toàn năng hay tế bào gốc trùm tạo máu
(Pluripotential HSC) thí dụ CFU S. Tế bào này có khả năng tạo ra tất các tế
bào gốc kế cận của tế bào máu trởng thành.
- Tế bào gốc đa năng (multipotent) thí dụ CFU- GEMM , CFU- L, tế bào
này có khả năng tạo ra nhiều (nhng không phải tất cả) tế bào gốc kế cận
thuộc 2 nhóm tuỷ và lymepho, còn gọi là tế bào gốc định hớng.
- Tế bào gốc đơn năng (unipotent) thí dụ: CFU E, CFU G, CFU M,
CFU T, tế bào này chỉ có khả năng tạo ra một dòng tế bào chuyên biệt (dòng
hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu ) nên còn gọi là tế bào gốc đầu dòng. (H.2). Tất
cả tế bào gốc tạo máu đều có thể nhận biết bằng dấu ấn (CD). Thí dụ, tế bào
gốc trùm tạo máu CFU-S có CD
34
+
; tế bào gốc đa năng (CFU- GEMM) có
CD
33
+
, CD
34
+ ,
tế bào gốc dòng lympho có CD
7
+
, CD
34
+
. Tế bào gốc đơn năng
(đầu dòng) dòng hồng cầu có CD
38
Hình 2: Sơ đồ tóm tắt quá trình sinh sản và biệt hoá của tế bào gốc
1.2.3. Các nguồn cung cấp tế bào gốc tạo máu
* Tuỷ xơng:
Nguồn tế bào gốc tạo máu sử dụng cho ghép đợc thu thập từ tuỷ xơng, từ
máu ngoại vi, máu cuống rốn và gan phôi (nguồn này hiện mới chỉ đợc ứng
dụng trong các thử nghiệm in vitro, cha đợc trong các nghiên cứu lâm sàng).
Nguồn cung cấp tế bào định hớng tạo máu đợc sử dụng cho ghép đầu
tiên là từ tuỷ xơng của ngời cho. Trong 20 năm qua nguồn cung cấp chính
tế bào gốc cho ghép là tuỷ xơng. Tế bào CD34 trong tuỷ xuơng chiếm
khoảng 1/100 đến 1/10000 tế bào có nhân trong tuỷ. Tuy nhiên một hạn chế
lớn của tế bào gốc tuỷ xơng là chọc hút tủy phải gây mê và bệnh nhân phải
nằm viện khoảng 1 tuần, ngoài ra nếu phải truyền máu thì có thể lây nhiễm
các bệnh qua đờng truyền máu (tự thân).
Hiện nay, nguồn tế bào gốc từ tuỷ xơng chủ yếu đợc sử dụng cho ghép
đồng loại, hoặc trong một số trờng trờng ghép tự thân nhng không thể huy
động đợc TBG ra máu. Không có nguy cơ lẫn tế bào ung th (tumor free
graft), đồng thời cung cấp khả năng miễn dịch chống ung th. Những bệnh lý
chính đợc chỉ định kiểu ghép này bao gồm bệnh lý có tổn thơng tủy xơng,
suy giảm miễn dịch, rối loạn chuyển hoá bẩm sinh hoặc bệnh lý huyết sắc tố.
Nguồn tế bào sử dụng ghép có thể thu thập từ tuỷ của ngời cho hoà hợp
toàn bộ hoặc một phần, có hoặc không có liên hệ huyết thống. Một số ngân
hàng dữ liệu về tuỷ xơng đã đợc thiết lập trên khắp thế giới, trong đó lớn
nhất là chơng trình ngời hiến tuỷ quốc gia Mỹ, hàng năm có trên 2000
CD
3
+
CD
19
CD
16/56
+
CD
41
+
+ CD
16
+
CD
36
+
+ CD
71
+
CD
33
+
+ CD
38
+
cho cùng huyết thống (related donor). Theo báo cáo của Trung tâm quốc tế về
đăng ký ghép tuỷ (International Bone Marrow Transplant Registry) trong
những năm 1998 đến 2000 có đến trên 90% các trờng hợp tự ghép ở ngời
trởng thành sử dụng tế bào gốc huy động ra máu ngoại vi, tỷ lệ sử dụng tế
bào gốc từ tuỷ chỉ chiếm khoảng 5%. Huy động tế bào gốc đợc tiến hành đối
với ngời tình nguyện bằng G CSF có thể thu số lợng tế bào CD34đủ lớn
cần thiết, đồng thời tránh đợc các biến chứng khi phải gây mê để thu hoạch
từ tuỷ xơng. Các nghiên cứu lâm sàng so sánh khi sử dụng tế bào gốc máu
ngoại vi với sử dụng tế bào gốc từ tuỷ cho thấy: kết quả mọc ghép sớm hơn,
khả năng hồi phục miễn dịch nhanh hơn, tỷ lệ tử vong liên quan đến biến
chứng ghép ở nhóm sử dụng tế bào gốc máu ngoại vi thấp hơn, nguy cơ xuất
hiện bệnh ghép chống chủ tơng đơng ở cả hai nhóm [69,80] nhng bệnh
ghép chống chủ mạn lại gặp nhiều hơn ở bệnh nhân nhận tế bào gốc máu
ngoại vi huy động[69].
* Nguồn tế bào gốc từ máu cuống rốn
Năm 1989, lần đầu tiên tiến hành ghép thành công tế bào gốc máu cuống
rốn cho bệnh nhi Fanconi, và đến nay hàng nghìn trờng hợp ghép đã đợc
tiến hành để điều trị bệnh máu ác tính và không ác tính[ 41].
Trong khoảng 15 năm trở lại đây máu cuống rốn đã và đang trở thành
nguồn quan trọng cung cấp TBG cho ghép đồng loài. Đây là một nguồn cung
cấp tế bào gốc rất lớn đáng lẽ bỏ đi, dễ thu hoạch. Trong máu cuống rốn rất
giàu tế bào định hớng tạo máu ở giai đoạn sớm và giai đoạn đa dòng (early
and committed progenitor cells ); số lợng tế bào CD34 từ 1/100 đến
1/10000 tế bào có nhân, có khả năng sinh sản gấp 2 lần tế bào gốc tuỷ và máu
ngoại vi ngời trởng thành [ 37,42] nhng có nhợc điểm là lợng thu đợc
nhỏ, liều tế bào gốc chỉ đủ ghép cho trẻ em< 10 tuổi. Tuy nhiên gần đây một
số tác giả đã dùng tế bào gốc pool của 2 mẫu máu cuống rốn có gen HLA
tơng đồng [49,81] do đó có thể dùng cho cả ngời trởng thành. Nhng
muốn làm đợc điều này cần có một lợng lớn máu cuống rốn để lựa chọn.
hiệu quả cao, máu cuống rốn có thể tạo thành ngân hàng lớn. Có nh vậy mới
có thể chọn lọc đợc nguồn tế bào gốc pool tơng đồng về miễn dịch (HLA)
sử dụng cho ngời lớn [25,34,49]. Gần đây một số ít các tác giả chú ý nghiên
cứu tế bào máu gan phôi bởi vì ở đó có nhiều tế bào gốc trùm với khả năng
phân chia và biệt hóa lớn, có thể dùng nuôi cấy ex - vivo để tạo ra một lợng
lớn đủ dùng cho điều trị[12,46].
*. Ngoài ra còn một nguồn nữa ngày nay đang đợc nhiều nhà nghiên
cứu khai thác và có thể có triển vọng lớn, đó là tế bào gốc nuôi cấy, phơng
pháp này cũng có thể tạo một lợng lớn tế bào gốc, bao gồm 2 loại sau đây:
- Nuôi cấy khuếch đại ngoài cơ thể (ex Vivo expansion) tế bào gốc
máu cuống rốn[22,43,75].
- Nuôi cấy khuyếch đại ngoài cơ thể tế bào gốc máu ngoại vi [55] bằng
IL 3, G CSF GM CSF GF
- Nuôi cấy dài ngày tế bào biểu mô của màng ối [56], hoặc nuôi cấy tế
bào biểu mô và trung mô của dây rốn có thể tạo tế bào gốc đa dòng nh tế bào
gốc tạo máu, tế bào thần kinh, cơ tim [71,72,77], tế bào giác mạc [73] Các
loại tế bào gốc này có u điểm lớn là khả năng miễn dịch còn thấp nên nguy
cơ bệnh ghép chống chủ ít, khả năng đậu ghép nhiều hơn các nguồn khác
1.3. Các nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc
Từ các nghiên cứu cơ bản trên đây, nhiều nhà lâm sàng đã tiến vào trận
địa sôi bỏng này. Nhiều chính phủ đã đa vào chơng trình nghiên cứu quốc
gia nh Mỹ, Anh, Nhật Bản, Trung Quốc, Triều Tiên, Singapore, Thái lan ở
Trung Quốc từ 2001 đã thiết lập trung tâm điều trị bằng liệu pháp tế bào gốc,
đã thành công trong điều trị bệnh tim mạch. Năm 2003 ở Brazin, Mỹ đã ghép
tế bào gốc giác mạc cho bệnh nhân hỏng mắt. ở Bangkok đã có trung tâm điều
trị liệu pháp tế bào gốc trởng thành lấy từ chính cơ thể bệnh nhân. Nhận thấy
tâm quan trọng của tế bào gốc trong tơng lai, nhiều nớc đã có đầu t lớn
cho chơng trình này. ở Nhật, Chính phủ đã dành khoản kinh phí lớn xây
phòng thí nghiệm hiện đại nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc vào điều trị, ở
Liều thông thờng là 2.10
8
tế bào có nhân/kg cân nặng của ngời nhận.
Thể tích tuỷ tối đa có thể thu là 1500ml. Một số trung tâm ghép tiến hành đếm
tế bào có nhân trong quá trình thu thập để quyết định thể tích cần thu gom.
Việc truyền máu tự thân có kế hoạch cũng cần phải tiên lợng và tiến hành
trớc thời điểm thu gom từ 2 3 tuần, và chỉ truyền lại sau khi đã hút dịch
tuỷ, để tránh hiện tợng pha loãng.
2.2.2. Thu gom tế bào gốc từ máu ngoại vi sau huy động
Những tế bào có CD34 (+) thu thập từ máu ngoại vi sau kích thích có khả
năng phục hồi cả ba dòng tế bào máu. Bình thờng TBG chiếm tỷ lệ rất thấp,
sau khi huy động có thể đạt từ 1- 3%.
Tế bào gốc máu ngoại vi sử dụng cho phép đồng loài đợc huy động
bằng các yếu tố kích thích tăng trởng (growth factors) đơn độc hoặc kết hợp
với hoá trị liệu. Thờng sử dụng các yếu tố kích thích tạo cụm dòng bạch cầu
hạt (G CSF: Granulocyte Colony stimulating factor), GM CSF hoặc kết
hợp cả hai. Nếu chỉ sử dụng các yếu tố kích thích hoá trị liệu đơn độc có thể
làm tăng số tợng tế bào có CD34 ra máu lên 10 đến 30 lần. Kết hợp cả hai
phơng pháp có thể làm tăng số lợng CD34 lên 50 đến 200 lần [6,54]. Các
nghiên cứu ghép tự thân cho thấy thời gian mọc ghép khi sử dụng tế bào gốc
huy động từ máu ngoại vi ngắn hơn so với tế bào gốc thu gom từ tuỷ
xơng[55], đặc biệt là thời gian phục hồi số lợng tiểu cầu. Thời gian nằm
viện của ngời bệnh rút ngắn đợc khoảng 7 đến 10 ngày[40].
Số lợng bạch cầu, số lợng tế bào đơn nhân và số lợng tế bào có CD34
(+) đợc sử dụng để chọn thời điểm thu gom thích hợp nhất. Với những bệnh
nhân điều trị hoá chất lần đầu, có thể tiến hành thu hoạch tế bào gốc khi số
lợng bạch cầu bắt đầu tăng lên hơn 5 G/l, nhng cần nói rõ rằng không có
mối liên quan chặt chẽ giữa số lợng bạch cầu và tỷ lệ tế bào CD34 ở máu
ngoại vi. Và dựa vào số lợng tế bào CD34 trớc khi thu gom để dự toán số
ngời mẹ cũng nh em bé và nên có kế hoạch thu gom từ trớc khi sinh.
Để giảm khả năng nhiễm khuẩn, dây rốn cần đợc sát khuẩn bằng cồn và
các dung dịch sát khuẩn khác. Sử dụng kim có kích thớc lớn, dẫn máu rốn
chảy theo trọng lực. Dung dịch chống đông nên sử dụng là CPD và CPDA vì
đẳng trơng và có pH trung tính.
Tiền sử cá nhân và gia đình của ngời mẹ (và nếu có thể của cả đứa trẻ
và bố đứa trẻ) cần đợc ghi rõ ràng trớc khi thu gom hoặc trong vòng 48giờ
kể từ khi thu gom. Đơn vị máu rốn sẽ không đợc sử dụng cho ghép đồng loại
nếu tiền sử gia đình (ngời mẹ, ngời bố hoặc anh chị em) có bệnh di truyền
và các bệnh lây truyền qua đờng truyền máu.
Bắt buộc tiến hành định nhóm ABO/Rh của đơn vị máu cuống rốn sau
khi thu thập, sàng lọc kháng thể bất thờng. Tiến hành định nhóm HLA, sau
đó tiến hành bảo quản. Nêu lu trữ đồng thời mẫu huyết thanh của ngời mẹ
để kiểm tra các bệnh lý truyền nhiễm mới sau này, tại thời điểm sử dụng đơn
vị máu cuống rốn. Nên tiến hành đếm số lợng CD34 và tỷ lệ tế bào sống tại
thời điểm giải đông đơn vị máu rốn trớc khi sử dụng.
2.2.4. Thu gom tế bào gốc từ nguồn nuôi cấy exvivo (Exvivo expansion)
Nuôi cấy khuyếch đại (expansion) exvivo tế bào gốc có số lợng ít, nh
tế bào gốc máu cuống rốn, số lợng tế bào gốc máu cuống rốn có khoảng
0.04-0.05% nhng nếu nuôi trong môi trờng có đủ chất dinh dỡng và phát
triển thì có thể tạo ra 1 lợng lớn đủ đáp ứng cho nhu cầu điều trị. Ví dụ nuôi
cấy khuyếch đại tế bào gốc máu cuống rốn sử dụng cho ghép tế bào gốc ở
ngời lớn. Kết quả nghiên cứu của Astori cho thấy với môi trờng nuôi cấy
đặc biệt, tế bào gốc máu cuống rốn khuyếch đại rất nhanh: tế bào có nhân
tăng gấp 180 lần, tế bào tạo GM-CSF tăng gấp 20 lần[ 22].
2.2.5. Thu gom tế bào gốc từ nguồn nuôi cấy dài ngày tế bào góc trùm
Nuôi cấy tế bào gốc biểu mô, tế bào gốc trung mô của dây rốn, tế bào
gốc phôi có thể thu đợc tế bào gốc cho cơ tim, thần kinh[71], tế bào gốc tạo
máu[77].Hớng này rất có ý nghĩa cho phát triển ghép tế bào gốc trong tơng
tế bào đồng nhất, đợc phân tách và sử dụng để thực nghiệm tái tạo quần thể
tế bào, hoặc thử nghiệm mở rộng ex vivo.
3.2. Xử lý loại bỏ tế bào ung th sử dụng cho ghép tự thân
Là quá trình làm sạch hay loại bỏ, loại trừ những tế bào ung th bị lẫn
khi tiến hành ghép tự thân. Với những bệnh nhân bệnh máu hoặc bệnh ác tính
thờng có xâm lấn tuỷ xơng (nh u lympho ), tồn l
u bệnh tối thiểu (MRD:
minimal residual disease) là nguyên nhân gây tái phát. Mặc dù tỷ lệ nhiễm tế
bào ung th trong chế phẩm tế bào gốc tách từ máu ngoại vi là rất thấp, thấp
hơn nhiều so với tế bào gốc thu gom từ tuỷ xơng, tuy vậy vẫn có thể lẫn
nhiều tế bào ung th. Một số nghiên cứu cho thấy có thể tế bào ung th cũng
đợc huy động từ tuỷ ra máu trong quá trình huy động tế bào gốc (45).
Tuy vậy, biện pháp này cũng vẫn còn đang đợc bàn luận, vì có thể
những phơng pháp loại trừ sẽ gây tổn thơng tế bào gốc. Khi tiến hành loại tế
bào u, khả năng giảm mức độ tồn lu hoặc tái phát bệnh cũng kèm theo việc
gia tăng nguy cơ không mọc ghép, tăng tỷ lệ chết do suy tuỷ kéo dài (45).
Có nhiều kỹ thuật hiện nay đợc áp dụng để loại bỏ, phá huỷ dòng tế bào
ung th, đồng thời bảo tồn tế bào định hớng tạo máu sử dụng cho phép.
* Kỹ thuật dợc lý học (Pharmacologic technique): Trong cơ thể, tác
dụng của hoá trị liệu chủ yếu tác động trên tế bào ung th, vì những tế bào này
nhạy cảm với hoá chất hơn tế bào bình thờng. In vitro, kỹ thuật này cũng sử
dụng nguyên lý đó, với liều hoá chất cao hơn mà không lo ngại sẽ ảnh hởng
đến các tế bào bình thờng, đồng thời liều hóa chất sử dụng cũng không đợc
gây độc khi truyền lại chế phẩm sau khi xử lý vào cơ thể ngời bệnh.
Mafosfamid (oxazaphosphorine hoạt hoá) và một số thuốc khác hiện đang
đợc thử nghiệm theo hớng này. Hiệu quả của việc ứng dụng những thuốc
này nhằm làm sạch tế bào ung th đối với những bệnh nhân ghép tuỷ tự thân
làm kéo thời gian suy tuỷ và tỷ lệ tế bào định hớng GM CSF chỉ còn lại
dới 1%.
nhiều tài liệu đã công bố, loại T lympho sẽ gây suy giảm miễn dịch, tăng khẳ
năng thải ghép, giảm khả năng ghép chống Leukemia[]. Vì vậy vấn đề loại T
lympho của dịch tế bào gốc hiện nay không đợc quan tâm nhiều nh vấn đề
chọn lựa HLA trong ghép. Ngoài ra số lợng T lympho ở máu cuống rốn rất
thấp, chức năng cha hoàn thiện[1,17].
3.4.Vấn đề loại hồng cầu trong dịch tế bào gốc:
Đây cũng là một vấn đề đợc nhiều nhà nghiên cứu đề cập. Loại hồng cầu
giúp giảm thể tích túi tế bào gốc do đó rút ngắn thời gian đông lạnh cũng nh tan
đông, giảm sử dụng các hoá chất bảo quản, giảm thiểu các yếu tố bất lợi cho
ngời nhận ghép cũng nh giảm tỷ lệ tế bào gốc bị chết do bảo quản [64,82].
4. Bảo quản lâu dài tế bào gốc tạo máu
4.1. Giảm thể tích bảo quản tế bào gốc
Đây là khâu quan trọng của xây dựng ngân hàng tế bào gốc. Và mặc dù
đợc tiến hành dễ dàng ở nhiều trung tâm ghép, nhng quá trình làm lạnh và
bảo quản tế bào gốc cũng có những nguy cơ mất tế bào gốc. Việc truyền tế
bào bảo quản lạnh cũng gây một số nguy cơ cho ngời nhận, một số trong các
nguy cơ đó có thể đe doạ tính mạng họ, và một số khác cha đợc hiểu cặn
kẽ. Hiện tợng mất tế bào gốc trong quá trình bảo quản lạnh và ảnh hởng của
hiện tợng này đến tốc độ mọc ghép vẫn cha đợc lợng giá chính xác. Có
nhiều yếu tố ảnh hởng đến kết quả của quá trình bảo quản lạnh, mỗi yếu tố
có ảnh hởng riêng đối với quá trình hồi phục của tế bào gốc qua từng bớc
của quá trình bảo quản và vì vậy, quá trình này cần đợc kiểm soát một cách
chặt chẽ. Hớng nghiên cứu hiện nay tìm ra những dung dịch, những quy trình
kỹ thuật đơn giản hơn mà lại đạt kết quả bảo quản tốt hơn, rẻ hơn, dễ thực
hiện hơn, ít độc hơn cho ngời nhận và cho tế bào bảo quản. Xuất phát từ mục
tiêu này gần đây nhiều nhà nghiên cứu bảo quản TBG nêu ra 1 số chú ý sau:
- Thể tích bảo quản mỗi túi đông lạnh (túi đặt trong cassette), dịch tế bào
dàn đều, đảm bảo độ mỏng, khi đông lạnh sẽ lạnh nhanh và đều, khi tan đông
cũng nhanh và đều. Trớc đây bảo quản trong lọ 3ml nên khi gây đông ngoài
0
C hoặc 25
0
C quá 9h sau xử lý thì số lợng colony giảm tác giả cho
rằng thời gian thích hợp cho chuẩn bị trớc đông lạnh là 9-24 h[57].
- Giai đoạn đông lạnh: từ 4
0
C xuống - 45
0
C với tốc độ -1
0
C/ phút. Từ -
45
0
C đến 135
0
C với tốc độ - 5
C
0
/ phút sau đó chuyển vào bình Nitơ lỏng -
196
0
C, duy trì dài ngày ở nhiệt độ này. Hàng tuần Nitơ lỏng đợc bổ sung để
cho túi tế bào gốc đợc ngập sâu trong Nitơ [64].
- Giai đoạn tan đông và sử dụng: nhiều tác giả thống nhất phải tiến hành
nhanh, túi tế bào gốc đợc ngâm trong chậu nớc ấm 37
0
C khi tan hết thì
truyền cho bệnh nhân. Túi tế bào gốc đợc bảo quản trong DMSO (10%) và
từ 0,1% đến 0.0004% tuỳ theo kỹ thuật. Kết quả các nghiên cứu đã công bố
đều cho thấy rằng tồn lu các tế bào u trong chế phẩm ghép có ảnh hởng đến
thời gian sống thêm của bệnh nhân ( ).
4.3.5. Sự phục hồi và hoạt động của tế bào gốc sau ghép:
Dựa vào diễn biến của bệnh nhân trên lâm sàng và diễn biến xét nghiệm.
5. Vấn đề ngân hàng tế bào gốc và sử dụng:
Đây là vấn đề có tính toàn cầu, nếu có nhiều ngân hàng với nguồn cung
cấp tế bào gốc máu cuống rốn dồi dào, các mẫu phẩm đạt tiêu chuẩn thống
nhất quốc tế lại có thể trao đổi giữa các ngân hàng thì tơng lai của ghép tế
bào gốc rất lớn, đặc biệt các sản phẩm xung quanh máu cuống rốn nh cuống
rốn, màng rau. Tất cả các sản phẩm này đều là sản phẩm bỏ đi, nay thu lại và
sử dụng thì thật là hữu ích. Giá trị khoa học của các sản phẩm này rất lớn.
Nhiều tác giả đã chứng minh rằng, chất lợng của tế bào có nhân và tế bào
gốc CD 34 gấp 10 lần tế bào gốc tuỷ và > 10 lần máu ngoại vi với các đặc
điểm sau (31,32,42,47):
- Khả năng tạo Colony rất lớn, khả năng sinh sản và biệt hoá rất lớn, khả
năng tự tái sinh lớn hơn tế bào gốc tuỷ và máu ngoại vi. 100ml máu rốn có giá
trị tơng đơng 1000ml dịch hút tuỷ xơng (32, 47).
- Khả năng đậu ghép đồng loài của tế bào gốc máu cuống rốn nhiều hơn
ghép tế bào gốc tuỷ và máu huy động
- Bệnh ghép chống chủ trong ghép tế bào gốc máu cuống rốn ít hơn và
mức độ cũng nhẹ hơn các tế bào gốc khác, ở giai đoạn II và IV (chỉ gặp 3% -
18%), giai đoạn III và IV ( 0 5% ). (Nếu có HLA tơng đồng 6/6 hoặc 5/6
thì kết quả rất mỹ mãn).
- Vấn đề liều tế bào gốc ghép cho ngời lớn đã đợc nghiên cứu và
đang mở ra triển vọng lớn, đó là:
+ Hỗn hợp (pool) nhiều đơn vị tế bào gốc máu cuống rốn có HLA tơng
đồng (Multiunit cord blood cells ), điều này có thể thực hiện đợc khi có hợp
quốc tế lớn (49, 53).
- Tất cả những ngời cho tình nguyện đợc t vấn, khám tuyển và xét
nghiệm sàng lọc trớc khi tham gia nghiên cứu theo tiêu chuẩn ngời cho máu
theo quy định của Pháp lệnh an toàn truyền máu 1992
2.1.2. Các mẫu tế bào gốc thu gom từ tuỷ xơng
- 15 mẫu dịch hút tế bào tuỷ xơng đợc tiến hành thu gom từ 15 ngời
cho tình nguyện, khoẻ mạnh, tuổi từ 22 đến 41.
- Tất cả những ngời cho tình nguyện đợc t vấn, khám tuyển và xét
nghiệm sàng lọc trớc khi tham gia cho tuỷ theo quy định của Pháp lệnh an
toàn truyền máu 1992.
2.1.3. Các mẫu tế bào gốc thu gom từ máu cuống rốn
- 112 mẫu máu cuống rốn của các sản phụ đẻ thờng tại bệnh viện Phụ
sản Hà Nội, sử dụng cho nghiên cứu xây dựng quy trình thu gom máu cuống
rốn đạt hiệu quả cao
- 34 mẫu máu cuống rốn có thể tích 90ml, sử dụng cho nghiên cứu xây
dựng quy trình loại hồng cầu bằng phơng pháp ly tâm.
- 20 mẫu máu cuống rốn có thể tích 90 ml, dùng cho nghiên cứu các
chỉ số tế bào huyết học, tế bào miễn dịch, tế bào gốc CD
34
trớc và sau khi
loại xử lý.
Copyright: Tài liệu đại học ©