VIỆN CHĂN NUÔI

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN TỔ HỢP CÔNG NGHỆ SINH SẢN
PHỤC VỤ CÔNG TÁC VÀ NHÂN GIỐNG BÒ

CNĐT : NGUYỄN THỊ THOA
C/phút)
sau khi khử nớc một phần ở nhiệt độ phòng với phôi bò đã thành công (Bùi Xuân
Nguyên và cs. 1984). Năm 2003, Lu Công Khánh và cng s đã báo cáo thành công
việc nghiên cứu ứng dụng đông lạnh chậm phôi bò bằng glycerol. Năm 2005 Nguyễn
Thị Thoa và cng s đã nghiên cứu phơng pháp đông lạnh phôi Vitrivication (tạo thuỷ
tinh thể) bớc đầu đã thành công nhng tỷ lệ phôi sống sau đông lạnh còn thấp chỉ đạt
73,24%.
Trong nghiên cứu này đã đa ra đợc quy trình đông lạnh thuỷ tinh thể
(vitrification) cải tiến đã tăng tỷ lệ sống của phôi đông lạnh sau giải đông từ 73,24% lên
80%. Chúng tôi đa ra các quy trình ci tin với mục tiêu cung cấp chính xác về cỏc
bc tin hnh trong quy trình cho cán bộ nghiên cứu và kỹ thuật viên cú th ng dng
sn xut phụi in-vitro, phôi in-vitro, đông lạnh phôi trờn bũ sa tại Việt Nam. 1
BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SINH HỌC
2007-2010 THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI
Tên đề tài: “ Nghiên cứu cải tiến tổ hợp công nghệ sinh sản phục vụ công tác tạo
và nhân giống bò”
Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Thoa
Học vị : Thạc sĩ .
Điện thoại: 0913321521
Địa chỉ: Nhà số 1, Ngách 148, Phố Hoàng Ngân- Trung Hoà- Cầu Giấy- Hà Nội
Cơ quan : Viện Chă
n nuôi
Địa chỉ : Thuỵ Phương- Từ Liêm- Hà Nội Số điện thoại: 048389971

định số 167 của Thủ tướng Chính phủ về một số biện pháp và chính sách phát
triển bò sữa Việt Nam giai đoạn 2001-2010, ngày 20 tháng 10 năm 2001 là một
trong những minh chứng cho sự quan tâm đó. Trong thời gian từ 2001 đến nay,
thực hiện Chương trình phát triển bò sữa theo Quyết Định 167 của Thủ tướng
Chính phủ, chăn nuôi bò sữa Việt nam đã thu được nhiều kết quả tốt đẹp, phát
triển một cách bền vững đáp ứng nhu cầu tiêu dùng sữa ngày càng cao của xã
hội. Tổng đàn bò sữa và sản lượng sữa của cả nước tăng từ 40.000 con và 64.000
tấn năm 2001 lên 140.000 con và 290.000 tấn năm 2010. Chăn nuôi bò sữ
a đã
thực sự mang lại hiệu quả kinh tế và xã hội cao đối với nông nghiệp của Việt
Nam trong thời gian 2001-2010.

3
Để có được số lượng và chất lượng bò sữa HF Việt Nam như hiện nay là
kết quả áp dụng khoa học kỹ thuật và công nghệ sinh học trong lại tạo và nhân
giống bò sữa Việt Nam của các nhà khoa học trong suốt thời gian hơn 50 năm.
Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo và công nghệ phôi trong đó có kỹ thuật đông lạnh
tinh, phôi là một trong những kỹ thuật sinh sản quan trọng nhất đã và đ
ang được
áp dụng trong cải tiến và nhân giống bò sữa HF Việt Nam.
Đối với bò thịt mặc dù đã có nhiều tiến bộ kỹ thuật áp dụng trong công
tác lai tạo và nhân giống, nhưng chăn nuôi bò thịt tại Việt Nam vẫn chưa đáp
ứng kịp nhu cầu tiêu thụ thịt bò của thị trường nôi địa về số lượng và chất lượng.
Hầu hết các nhà hàng, khách sạn và siêu thị cao c
ấp vẫn phải nhập thịt bò từ Mỹ,
Australia, New Zealand. Theo số liệu thống kê năm 2009 sản lượng thịt trâu, bò
hơi chỉ đạt 330 ngàn tấn thịt trâu bò/năm; tương đương mức tiêu thụ trung bình
trên đầu người chưa đến 1,5 kg/thịt/năm là rất thấp so với mức tiêu thụ 9-10
kg/năm tại các nước trong khu vực như Trung Quốc, Nhật Bản.
Để phát triển chăn nuôi bò thịt, thành một ngành s

giống bò bò thịt, bò sữa. 5
PHN II
TNG QUAN CC VN CN NGHIấN CU
I. C S KHOA HC CễNG NGH CY TRUYN PHễI Bề
1.1. Kớch thớch noón bao phỏt trin ng lot bng s tỏc ng hormone
Nhiu tỏc gi cho thy rng tim nng sinh sn ca bũ ln hn rt nhiu so
vi kh nng sinh sn thc ca chỳng. Theo Erickson (1966) cho bit bung
trng ca bũ cú trờn 70.000 noón bao nguyờn thu cú th phỏt trin thnh t bo
trng th tinh v to phụi. Nghiờn cu trờn bũ cú chu k ng d
c u
Danell(1987) cho bit trung bỡnh s t bo trng là 12636 và ở bò không hoạt
động có số tế bào trứng là 10132, sự khác nhau này không rõ ràng (P>0,05).
Nghiên cứu về tế bào và mô học buồng trứng bò, Hafbigo (1947) đã công bố rằng
bê 3 tháng tuổi có 21000 và ở bò già có 2500 tế bào trứng.
bũ, mi chu k ch rng 1 trng, nu th tinh ch c mt bờ, trong
mt i bũ cỏi ch sinh c 7-8 bờ nh vy trong thc t s noón bo c s
dng hu ớch l rt ớt, i vi mt i con cỏi cao sn tht l lóng phớ.
Nhiu nghiờn cu cho thy trong một chu kì ở bò thờng có 2 đến 3 đợt

nghiên cứu trên chuột của Engle (1927); trên bò và cừu của
Col và Miller (1933); Parker và Hammond (1940) và Casida và cs. (1944). Các
phơng pháp GRTN trong giai đoạn này bớc đầu nghiờn cu chủ yếu trên cơ sở
về mối tơng quan tuyến yên-buồng trứng và sự phát hiện hocmon ECG và
estrogen ở phụ nữ có thai và ngựa chửa (Smith và Engle: 1927; Zondek và
Aschheim: 1927). Kết quả GRTN ở giai đoạn này còn rất hạn chế và vì vậy tỷ lệ
thụ thai sau cấy phôi chỉ đạt từ 2-10%.
Nghiên cứu xây dựng các phơng pháp GRTN một cách hệ thống và trên
cơ sở hiểu biết đầy đủ về cơ chế điều khiển sự phát triển nang và rụng trứng bắt

7
đầu thực hiện từ những năm 1970. Trong giai đoạn này, s phát triển công nghệ
phôi ở quy mô lớn đối với các đối tợng chăn nuôi quan trọng nh cừu, bò; các
phơng tiện nghiên cứu hiện đại và chính xác nh miễn dịch phóng xạ, siêu
âm cũng đã đợc áp dụng phổ biến trong nghiên cứu sinh học sinh sản. Những
đóng góp quan trọng liên quan đến việc xây dựng các phơng pháp GRTN trong
giai đoạn này đã đợc thực hiện trên cơ sở nghiên cứu quy luật phát triển nang,
rụng trứng và vai trò thể vàng trong hoạt động chu kỳ tính buồng trứng. Nghiên
cứu của nhiều tác giả cho thấy sự rụng trứng chỉ xy ra ở các nang đã phát triển
tới độ chín cần thiết, bao gồm sự tăng tối đa kích thớc nang và xoang chứa dịch
nang, và sự chín noãn đợc thể hiện qua các hiện tợng tan màng nhân, phân lập
cầu cực 1, và phân bố thể nhiễm sắc ở giai đoạn metaphase II (M II) (Thibault
1985, Blerk Van và bell, 1986).
Điều kiện cần thiết để các quá trình chín và rụng trứng xẩy ra là sự tăng
cờng phân tiết LH của tuyến yên trong máu ngoại vi. Sự chín và rụng trứng chỉ
xy ra sau khi xuất hiện đỉnh LH. Quan sát ở bò cho thấy trong chu kỳ bình
thờng, sự tan màng nhân xuất hiện khoảng 5 giờ sau đỉnh LH, sự hình thành
nhiễm sắc thể M II xẩy ra khoảng 17-22 giờ sau đỉnh LH, và rụng trứng xy ra
22 giờ sau đỉnh LH (Dieleman 1993). Vào thời điểm sắp rụng trứng, sự tăng các
thể tiếp nhận LH đợc quan sát thấy trong các nang khống chế sẽ dẫn tới tăng

buồng trứng. Trên 17 bò bình quân trứng rụng là 8,01,5 có 4 bò vẫn còn noãn
bao không rụng. Một nghiên cứu nữa đợc tiến hành trên 10 bò với sự kết hợp cả
PMSG và PGF
2

đã phối giống trong thời gian động dục. Trong tổng số 141 trứng
rụng đã thu đợc 97 phôi (đạt tỉ lệ 69% trứng rụng), trong đó có 88% phôi thụ
tinh. Từ những kết quả thu đợc tác giả có nhận xét rằng kết hợp PMSG với
PGF
2

cho kết quả tốt hơn khi dùng một mình PMSG để gây rụng trứng nhiều
trên bò. Boland và cs. 1978; Chupin và Procureur, 1982; Newcomb và cs. 11976)
cho thấy việc sử dụng eCG để GRTN ở bò thờng kèm theo các hạn chế có thể
ảnh hởng âm tính lên kết quả thụ tinh và sự phát triển phôi nh thời điểm xuất
hiện động dục không chính xác, động dục kéo dài. Trong các trờng hợp này tỷ
lệ bò có phản ứng rụng trứng cao (89% cú phản ứng), nhng chỉ có hơn 44% bò
có trên 5phôi/1 lần, và chỉ có 25% số phôi đạt tiêu chuẩn tốt. Trong thực tiễn khả
năng gây rụng trứng nhiều lặp lại trên cùng một cá thể cho phôi.

9
Hasler và cs (1983) đã làm thí nghiệm so sánh kết quả gây rụng trứng
nhiều bằng eCG lặp lại nhiều lần trến bò sữa Holstein cho thấy số trứng rụng
không giảm (10 thể vàng), nhng tỷ lệ thu phôi và tỷ lệ trứng thụ tinh có thể
giảm từ 30-40% ở những lần GRTN lặp lại. Savage và Maletoft (1984) đã sử
dụng Estradiol 17 hoặc GnRH với FSH-P .Với số bò là 54 đợc gây rụng
trứng nhiều từ ngày 10-12 của chu kì động dục với liều 28 FSH-P, mỗi ngày
tiêm hai lần với liều giảm dần, trong 4 ngày liên tục. Sau khi tiêm 48h mỗi bò
đợc tiêm 500mg PGF
2

mất nhiều thời gian phát hiện động dục và tạo động dục đồng pha đối với bò cho
phôi trong kỹ thuật cấy truyền phôi bò.
Năm 1986, tác giả Kostov và cs đã tiến hành gây rụng trứng nhiều ở bò
bằng Synchromate B và Estradiol, PMSG và PGF
2

. Kết quả bò đã động dục sau
tiêm 96h và có 17,6% số bò không động dục. Số bò có thể vàng từ 2-4; 5-10; 11-
15 và trên 15 tơng ứng là 3; 6; 2 và 4 con. Sau khi gây rụng trứng nhiều bằng
FSH và Estradiol. Dieleman và cs. (1987) báo cáo kết quả gây rụng trứng nhiều ở
bò bằng sử dụng PMSG, PGF
2

và anti-PMSG. Bình quân số trứng rụng và noãn
bao tơng ứng là 15,72.5 và 15,41,6 cho mỗi bò thí nghiệm. Kết quả ở bò thí
nghiệm cao gấp 2 lần so với bò đối chứng về số lợng trứng rụng và độ tin cậy
(P<0,05).
Kim và cộng sự (1987) đã công bố kết quả của việc sử dụng PMSG và
antiPMSG. Thí nghiệm đã tiến hành trên 80 bò và chia làm 3 lô: lô A : PMSG
và antiPMSG; lô B: PMSG +monoantiPMSG và lô C: FSH tiêm 4 ngày mỗi
ngày 2 lần. Bình quân số thể vàng trên bò là:12,4; 11,9 và 4,4, bìmh quân noãn
bao không rụng là 1,2; 2,2 và 0,4 tơng ứng cho các lô A; B; C. Số phôi tơng
ứng cho các loại A, B và C là 8,2 (66,1%);7,3(61,3%) và 3,9(88,6%). Trong đó tỷ
lệ phôi có khả năng cấy trên các phôi thu đợc là 5,9(71,9% ; 5,11(69,8%0; và
3,6 (92,3%) tơng ứng cho các lô A; B; C. Kết qủ tơng tự cũng đợc Kostov
thông báo (1986) về gây rụng trứng nhiều ở bò dùng PMSG và anti-PMSG .
Bergfelt và cs. (1994) đã thông báo nh sau: bò tơ Simental từ 17 đến 22
tháng sau khi gây rụng trứng nhiều đã động dục 100%, số trứng rụng và phôi

11

dục là phơng pháp hiệu quả và đơn giản để tăng hiệu quả của eCG và chất lợng
phôi thu đợc. Tuy vậy, anti-eCG có thể cho những kết quả khác nhau tuỳ theo
phơng pháp sử dụng. Chất lợng phôi sẽ giảm sút khi anti-eCG đợc đa vào
trớc khi xuất hiện đỉnh LH.
Trạng thái buồng trứng của bò cho vào thời điểm gây rụng trứng nhiều là
yếu tố ảnh hởng quan trọng đến kết quả gây rụng trứng nhiều. Theo Lindell và
cs. (1986), xử lý FSH vào ngày thứ 9 của chu kỳ của bò cho kết quả rụng trứng
và chất lợng phôi cao hơn hẳn so với xử lý vào ngày thứ 3 hoặc 6. Gouding và
cs. (1990) cũng thông báo kết quả tơng tự trên đối tợng bò thịt.
Về góc độ sinh lý và môi trờng, các nghiên cứu đã đợc công bố cho thấy
các yếu tố cá thể, giống, mùa vụ đề ảnh hởng rất lớn tới kết quả gây rụng trứng
nhiều ở bò. Kết quả thí nghiệm của Foote và Onuma (1976) cho thấy tuỳ thuộc
theo trạng thái cá thể phản ứng rụng trứng ở bò có thể dao động từ 0-104 trứng
rụng/con. Trong trờng hợp gây rụng trứng nhiều nằng cùng một quy trình, bò có
trạng thái sinh sản bình thờng cho 10 trứng rụng trong đó có 6,4 trứng tốt, trong
khi bò vô sinh chỉ cho 6 trứng rụng và 2,4 trứng dùng đợc. Phản ứng rụng trứng
ở bò có chu kỳ ngắn hơn 15 ngày cũng kém hơn so với bò có chu kỳ dài 15-27
ngày (Crister và cs (1988).
Tuổi bò lúc xử lý gây rụng trứng nhiều cũng ảnh hởng quan trọng đến kết
quả tạo phôi. Phản ứng rụng trứng nhiều ở bò tơ cha đẻ và bò đẻ 1-5 lần thờng
cao hơn so với bò đã đẻ trên 6 lần (Grevet 1982). Chất lợng phôi thu đợc sau
gây rụng trứng nhiều ở bò sữa 12 tháng tuổi kém hơn so với bò sữa đã đẻ 1-2 lứa;
trong trờng hợp bò tơ, số trứng rụng có xu h
ớng cao hơn (22 thể vàng/con/lần),

13
nhng tỷ lệ phôi đạt tiêu chuẩn cấy phôi rất thấp (2/22 phôi) (Schilling và cs
1981). Olivera-Angel và cs (1984) nghiên cứu về tỷ lệ thu phôi và chất lợng của
phôi sau khi gây rụng trứng nhiều bằng eCG (2000 IU) trên bò thịt tơ và bò thịt
đang cho bú cho thấy ở bò tơ tỷ lệ thu phôi chỉ đạt 15% và tỷ lệ phôi phát triển

con cho và con nhận, bằng cách sử dụng kết hợp progestin và PGF.
1.2. Gõy ng dc ng pha v cy phụi cho bũ nhn
Gây động dục đồng pha (GĐDĐP) là quá trình kích thích cho cái nhận
phôi động dục đúng vào thời điểm động dục của cái cho phôi. Đồng pha giữa cái
nhận phôi và cái cho phôi còn có ý nghĩa trạng thái sinh lý sinh dục ở cái nhận
phôi phù hợp với tuổi của phôi. Nh vậy nếu tiến hành cấy phôi tơi, cái cho phôi
và cái nhận phôi phải đồng thời động dục. Khi cấy phôi đông lạnh, cái nhận phôi
đã động dục trớc đấy một thời gian, thờng là 7 ngày (đúng với tuổi của phôi).
Chu kỳ động dục của bò bình quân 21 ngày, dao động 17-24 ngày. Chu kỳ
này đợc phân thành các thời kỳ nhỏ kế tiếp nhau. Trớc động đực, động đực,
sau động đực và yên tĩnh. Nó đợc đặc trng bởi hai pha: pha noãn nang và pha
thể vàng. Mỗi thời kỳ, mỗi pha đều có những đặc điểm và biểu hiện riêng biệt, có
thể nhận thấy hoặc không thể nhận thấy đợc. Sự thay đổi về trạng thái sinh lý
của cơ quan sinh dục tơng ứng ở các thời kỳ nh: sng, xung huyết, phân tiết
niêm dịch, độ pH niêm dịch, thành phần các chất trong niêm dịch và sự vận động
của cơ quan sinh dục đặc biệt tử cung phải phù hợp, tơng ứng với trạng thái sinh
lý của hợp tử sau là phôi ở từng giai đoạn phát triển. Có nh vậy mới tạo điều
kiện cho phôi thai sống phát triển bình thờng trong cơ thể mẹ. Vì lẽ đó, cấy
truyền phôi chỉ đợc tiến hành cho những con nhận có trạng thái sinh lý sinh dục

15
phù hợp với giai đoạn phát triển của phôi hoặc phù hợp với tuổi phôi. Sự không
đồng pha sẽ làm cho mẹ nhận phôi đào thải phôi, phôi không thể tiếp tục sống,
phát triển trong tử cung mẹ nhận. Khi cái nhận phôi động dục đồng thời với cái
cho phôi, hoặc trạng thái sinh lý sinh dục của nó phù hợp với tuổi phôi ngời ta
gọi là đồng pha hoàn toàn và lấy số 0 làm biểu tợng. Ngời ta cũng lấy dấu (+)
hoặc (-) đặt trớc thời gian cái nhận phôi động dục trớc hoặc sau cái cho phôi để
biểu hiện mức độ đồng pha . Ví dụ +1: cái nhận phôi động dục trớc 1 ngày; -1:
cái nhận phôi động dục sau 1 ngày, v.v
Kết quả nghiên cứu của Rowson và ctv (1972) cho biết khi cấy phôi cho

triển ở số lợng thích hợp. 3- Cho sự rụng trứng đồng pha vào thời điểm dự kiến
bằng PGF
2

, Progesterone, PMSG, PRID, CIDR.
Cũng nh việc gây rụng trứng nhiều, quá trình này chịu sự điều khiển nội
tiết của cơ thể và qua đó chịu sự ảnh hởng rõ rệt của các yếu tố môi trờng,
giống và trạng thái cơ thể.
Đánh giá chất lợng gây động dục đồng pha qua tỉ lệ động dục và thụ thai
cho thấy gây động dục đồng pha theo nguyên tắc rút ngắn giai đoạn thể vàng
bằng PGF trong trờng hợp bò đợc chọn lọc kỹ và nuôi trong điều kiện tiêu
chuẩn hoá có thể tỉ lệ thụ thai bằng hoặc cao hơn với động dục tự nhiên (75% so
với 68%). Việc gây động dục bằng Chlormadion Acetate Progesteron (CAP) đơn
lẻ không đáp ứng nhu cầu chuẩn bị con nhận phôi. Tỉ lệ động dục ở bò Zebu
Brahman: đợc tiêm hoặc cho ăn 50 mg CAP trong 5 ngày, chỉ đạt 22 - 41%
(Joche và cs, 1978).
Tỷ lệ động dục và thụ thai đợc cải tiến đáng kể khi Progesteron đợc kết
hợp với Estradiol-17. Sử dụng Synchro-Mate-B có thể cho kết quả 88% động
dục, 70% thụ thai ở bò Holstein đã đẻ vài lần (Anderson và cs, 1982). Kết quả
tợng tự cũng đã đợc Foote và Hunter (1964) công bố trong các thí nghiệm trên
bò thịt. ảnh hởng dơng tính của việc bổ xung Estrogen lên tỉ lệ động dục và thụ
thai cũng đã đợc thông báo ở bò Herefors-Angus đợc gây động dục bằng PGF
(Peters, 1984) hoặc Progesterone Releasing Intravanginal Divice (PRID; smith và
McGowan, 1982). Theo thông báo của tác giả này, việc bổ xung Estrogen
(400àg) và thời điểm 48 giờ sau khi tiêm PGF làm tăng tỷ lệ động dục và thụ thai

17
thêm 30%; song kết quả tơng tự không xảy ra trong trờng hợp bổ xung
Estradiol-17b vào thời điểm 48 giờ sau khi tiêm PGF.
Việc bổ xung Equin Chorionic Gonadotropin (eCG) cũng có thể đem lại

Progesteron vào trong âm đạo trong 12 ngày là 99% và trong đó 90% tỷ lệ bò có
động dục cùng ngày là 72% và 70%. Cũng theo Roche việc bổ xung Estradiol-
17 vào ngày đầu cấy Progesteron đem lại những cải tiến quan trọng: 94% bò
trong trờng hợp này có biểu hiện động dục đồng pha cung ngày.
nh hởng của Equin Chorionic Gonadotropin (eCG) và Estradiol-17 lên
sự đồng pha cũng đợc Nancarraw và Miller (1976) thông báo trên bò đợc xử lý
PGF, PGF kết hợp ECG (750 I.U) và PGF kết hợp với estradiol benzoate 500 àg.
Sai lệch thời gian xuất hiện động dục tơng ứng cho các lô trên là 5,5 - 7 giờ
(trên 78,9%); 3 giờ (trên 67,2%) và trên 2,4 giờ (trên 52,9%).
So sánh kết quả thụ thai sau cấy phôi ở bò có độ lệch pha khác nhau,
Hensen (1976) thông báo tỷ lệ thụ thai sau cấy phôi bò Belgian blue-white bred
đợc xử lý PGF dao động từ 40 tới 65% trong độ lệch pha cho nhận -24 tới + 12
giờ và cao nhất ở mức lệch: +6 giờ (trớc con cho, tức phôi trẻ hơn), -24 giờ (con
nhận rụng trứng sau con cho).
Theo Rowson và cs (1969) giới hạn lệch pha động dục chp phép tối đa là
24 giờ. Việc cấy phôi vào con nhận động dục 36 giờ trớc con cho hoặc hơn 12
giờ sau con cho đều cho kết quả chửa thấp, trong khi theo Hahn (1976) sự lệch
pha 0,5 ngày có thể chấp nhận.
Phơng pháp sử dụng hormone có thể khác nhau, phải đợc lựa chọn, điều
chỉnh cho từng trờng hợp cụ thể mới đem lại hiệu quả cao. Sử dụng SMB cho
kết quả 88% động dục, 70% có chửa ở bò Holstein (Anderson và ctv, 1982).

19
Kết quả cuối cùng của cấy phôi đợc thể hiện qua tỷ lệ thụ thai. Quá trình
làm tổ chỉ xảy ra trong khoảng thời gian giới hạn. Trong trờng hợp sinh sản bình
thờng, sự phối hợp nhịp nhàng giữa phôi và cơ thể mẹ đợc thực hiện nhờ các
Steroid (Maurer và Echternkamp, 1982). Protein nội mạc tử cung Uretroglobin và
các tín hiệu trao đổi thông tin do phôi tổng hợp nh Triphoblaxin, PSPB
(Pregnancy Specific Protein).
Cấy phôi là sự chuyển phôi từ cơ thể mẹ này (mẹ cho) sang một cơ thể mẹ

đông lạnh hay giải đông. Tốc độ lạnh ở dới tốc độ giới hạn thì sự sống của tế
bào gắn liền với sự biến đổi các tính chất của dung dịch, trong đó nồng độ chất
hoà tan cũng đồng thời tăng lên ở bên ngoài tế bào. Trong môi trờng huyền phù
(vừa thể lỏng vừa tinh thể) nớc tạo thành băng đá một cách từ từ và bên trong tế
bào sẽ mất nớc để duy trì sự cân bằng áp suất thẩm thấu với bên ngoài tế bào,
mi trao i cht ca t bo ngng hot ng, t bo sng tim sinh. Nh vậy,
sự hiện diện của tinh thể nớc đá nội bào và những hiệu ứng của dung dịch là hai
yếu tố chủ yếu chuyển biến theo tốc độ đông lạnh để quyết định khả năng sống
sót của tế bào.
Theo Mazur (1977), cho bit những hiện tợng vật lý chính xẩy ra trong
quá trình đông lạnh tế bào. khi nhiệt độ hạ xuống -5
0
C, tế bào và môi trờng
xung quanh cha đóng băng bởi vì nhiệt độ lạnh cha tạo đá (supercooling) và vì
sự giảm điểm đông do sự có mặt của chất bảo vệ lạnh. Tinh thể nớc sẽ hình
thành bên ngoài tế bào ở nhiệt độ -5
0
C đến -15
0
C (do ngẫu nhiên hay do tạo mầm
nớc - seeding), nhng các chất bên trong tế bào vẫn cha đông lạnh và nhiệt độ
lạnh cha tạo đá, có thể do màng tinh thanh ngăn cản sự lan rộng tinh thể nớc
vào trong tế bào chất. Theo định nghĩa, nớc ở nhiệt độ lạnh cha tạo đá bên

21
trong tế bào có nồng độ hoá học cao hơn so với nớc trong dung dịch đợc đông
lạnh một phần bên ngoài tế bào, và đáp lại sự chênh lệch này, nớc sẽ đi ra ngoài
tế bào và đông lạnh bên ngoài tế bào.
Tốc độ làm lạnh nh hng n cỏc hiện tợng vật lý xẩy ra tiếp theo bên
trong tế bào. Nếu nhiệt độ giảm chậm, tế bào có khả năng mất nớc nhanh do

thực hiện quá trình rút nớc nội bào và thay thế bằng glycerol.
Ethylene glycol có phân tử lợng thấp hơn (62,07) so với của glycerol
(92,10), chất này có tác dụng tơng tự glycerol và có thể dùng thay thế cho
glycerol trong đông lạnh phôi bò. Ưu điểm của việc dùng ethylene glycol trong
đông lạnh phôi bò là khi giải đông không cần rút chất này ra khỏi phôi bò theo
các bớc mà chất này tự thẩm xuất ra ngoài (Docchi và cs. 1995, Voelkel và Hu,
1992).
Nguyen và cs. (2000) đã báo cáo rằng khi sử dụng 60% ethylene glycol
trong dung dịch PBS để đông lạnh, tỷ lệ phôi sống và tỷ phôi thoát màng sau giải
đông tơng ứng là 78% và 55%. Tuy nhiên, khi các tác giả này kết hợp làm mất
nớc một phần và sử dụng 39% ethylene glycol, 0,7M sucrose và 8,6% filcoll, tỷ
lệ phôi sống và tỷ phôi thoát màng sau giải đông tơng ứng là 77% và 85%.
Hasler và cs. (1997) đã đông lạnh phôi bò tạo ra trong ống nghiệm trong
dung dịch PBS có nồng độ 1,4M glycerol hay 1,5M ethylene glycol. Sau khi giải
đông và nuôi 72 giờ, tỷ lệ phôi thoát màng tơng ứng là 69,2% và 62,4%.
Dimethylsulfoxide (DMSO) cũng là chất bảo vệ lạnh có phân tử lợng thấp
(78,13). Chất này lần đầu tiên đợc Wilmut và Rowson (1973) sử dụng để đông
lạnh phôi bò. Tuy nhiên, nhiều tác giả đã nhận thấy rằng, có sự khác nhau về khả
năng thẩm thấu của chất bảo vệ lạnh giữa phôi của các loài và đối với phôi bò thì
glycerol có khả năng thẩm thấu tốt hơn DMSO. Vì thế, đến cuối những năm
1970, glycerol đợc dùng nhiều hơn DMSO trong việc đông lạnh phôi bò.
Đờng (sucrose, lactose) và protein (bovine serum albumin, hyaluronic
acid) cũng đợc dùng nh những chất bảo vệ lạnh nhng chúng thờng đợc
dùng với các chất bảo vệ lạnh khác.
Kasai (1996) đã tổng kết rằng, các phòng thí nghiệm trên thế giới có thể sử
dụng một chất bảo vệ lạnh duy nhất hoặc sự dụng kết hợp nhiều chất bảo vệ lạnh

23
nh dimethyl sulphoside, acetamide, propylene glycol, glycerol, ethylene glycol,
polyethylene glycol, BSA, sucrose, trehalose và glucose với các nồng độ khác