Page 1

Đại Học Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh
Trường Đại Học Bách Khoa

Đề tài:
CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
PROTEIN SỬ DỤNG HPCL VÀ LC-MS GV: TS. Huỳnh Khánh Duy
HV: Nguyễn Thị Kim Liên
MSHV: 130505189

TP. HỒ CHÍ MINH, 01/2014
Page 2


I. Khỏi nim v k thut sc kớ

Sắc ký là những kỹ thuật tách và phân tích ( xác định ) các chất trong một hỗn
hợp mẫu dựa theo những tính chất hoá học,vật lý và hoá lý của các chất trong những
điều kiện nhất định. Các tính chất đó có thể là:
Tính chất hấp phụ của chất rắn,
Tính chất trao đổi ion, tạo cặp ion,
Sự rây phân tử theo kích thớc của chúng
Sự tạo phức và sự liên hợp phân tử,
Sự phân bố của các chất giữa hai pha không tan vào nhau,
Kỹ thuật sắc ký có hai loại dựa theo trạng thái của chất mẫu và pha động khi tiến
hành tách sắc ký. Đó là
Kỹ thuật phân tích sắc ký khí và
2. Kỹ thuật phân tích sắc ký lỏng.
Trong kỹ thuật sắc ký lỏng lại đợc chia thành hai nhóm, đó là:
+ Sắc ký lỏng áp suất thờng ( sắc ký cổ điển), và
+ Sắc ký lỏng hiệu suất cao ( áp suất cao: (HPLC). Page 4

Và hiện nay ( sau năm 2000 ) đã có sắc ký lỏng siêu áp, loại này làm việc với áp
suất cao từ 900-1500 bar ( UHPLC: 900-1500 bar ).
Trong sắc ký cột ( có dạng rắn-lỏng hay lỏng-lỏng ), kỹ thuật sắc ký lỏng áp suất
thờng đã ra đời và đợc ứng dụng từ lâu ( đã trên 60 năm ). Nhng hiệu suất tách
không cao, độ nhạy thấp và tốn nhiều thời gian cũng nh dung môi để chạy sắc ký.
Ngợc lại kỹ thuật HPLC tuy mới ra đời và phát triển khoảng trên chục năm lại đây,
nhng hiện nay đang đợc phát triển rất nhanh và đã ứng dụng rất rộng rãi trong
nhiều lĩnh vực khác nhau của nghiên cứu khoa học, sản xuất và công nghệ. Vì kỹ
thuật tách sắc ký HPLC này có độ nhạy cao, hiệu suất tách cao và tốn ít thời gian

Sắc ký là một họ các kĩ thuật hoá học phân tích dùng để tách các chất trong
một hỗn hợp. Nó bao gồm việc cho mẫu chứa chất cần phân tích trong "pha động",
thường là dòng chảy của dung môi, di chuyển qua "pha tĩnh." Pha tĩnh trì hoãn sự di
chuyển của các thành phần trong mẫu. Khi các thành phần này di chuyển qua hệ
thống với tốc độ khác nhau, chúng sẽ được tách khỏi nhau theo thời gian.
Page 6

HPLC là chữ viết tắt của 04 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc
ký lỏng hiệu năng cao ( High Performance Liquid Chromatography) ,trước kia gọi
là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography).
Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ
phương pháp sắc ký cột cổ điển. Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển
và hiện đại hoá cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích
.Hiện nay nó áp dụng rất lớn trong nhiều nghành kiểm nghiệm đặc biệt là ứng dụng
cho nghành kiểm nghiệm Thực phẩm . Và nó hiện là công cụ đắc lực trong phân
tích các thực phẩm cho phép kiểm định tính và định lượng.
Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC): HPLC là một sắc ký cột (column
chromatograph ) đi kèm với một detector nhạy để có thể phát hiện được các chất
tách ra trong quá trình chạy sắc ký. Với những tiến bộ kỹ thuật về cột, detector đã
chuyển sắc ký cột thành phương pháp phân tích có tốc độ nhanh và hiệu suất cao.
Loại này cần phải có hệ thống bơm cao áp để đẩy pha động với áp suất cao
đến khoảng 30Mpa (300 atm) nhằm tạo dòng chảy với lưu lương vài ml/ phút.
Số lượng mẩu phân tích bằng HPLC chỉ cần khoảng 20microlit.
Page 7

Theo cơ chế tách sắc ký người ta phân loại như sau :
Quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh ,yếu khác nhau của pha tĩnh đối với các
chất tan và sự rửa giải ( phản hấp phụ ) của pha động để kéo chất tan ra khỏi cột .Sự
tách một hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động học của chất hấp phụ . Trong trường
loại này có 02 loại hấp phụ : Page 9

- Sắc ký hấp phụ pha thuận ( NP - HPLC) : Pha tĩnh phân cực ,pha động không phân
cực
- Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP - HPLC) : Pha tĩnh không phân cực ,pha động phân
cực
Loại sắc ký này được áp dụng rất thành công để tách các hỗn hợp các chất có
tính chất gần tương tự nhau và thuộc loại không phân cực,phân cực yếu hay trung
bình như các Vitamin,thuốc hạ nhiệt giảm đau Hiện nay chúng ta đang sử dụng
chỉ có loại sắc ký này mà thôi.
Chủ yếu hiện nay chúng ta sử dụng lọai sắc ký hấp phụ pha đảo ( RP )
Trong dược điển USP khi chúng ta tra cứu cột có giá trị tương ứng như sau :
- L1 : RP 18 Kích thước hạt tương ứng từ 5 - 10 µm
- L7 : RP 8 Kích thước hạt tương ứng từ 5 - 10 µm
- L3 : Si 60 Kích thước hạt tương ứng từ 5 - 10 µm
Và còn một số loại cột khác như cột Diol , Cột NH
2
, CN . . vv
4. Ưu – nhược điểm của HPLC
4.1 Ưu điểm của HPLC
- Tốc độ nhanh (nhiều phân tích <30 phút)
- Độ phân giải cao (nhiều loại pha tĩnh)
- Độ nhạy cao (kết hợp nhiều loại Detector)

Phương pháp này cho phép phân tách các loại Protein trên cơ sở đặc điểm khác
Phương pháp sắc ký lọc gel : nhau của các loại Protein về hình dạng và kích
thước. Khác với trong phương pháp sắc ký trao đổi ion của các hạt được sử dụng để
nhồi cột trong phương pháp này không mang các nhóm tích đi ện mà thay vào đó là
mang các lỗ có kích thước khác nhau. Các phân tử Protein càng nhỏ càng có nhiều
khả năng thâm nhập vào tất cả các lỗ, vì vậy thời gian chạy qua cột dài hơn và thời
gian hồi lưu muộn hơn. Ngược lại các phân tử Protein kích thước càng lớn càng có
thời gian hồi lưu sớm hơn.
Đối với loại cột, các phân đoạn sắc ký được thu các nồng độ muối khác nhau hoặc ở
các thời gian hồi lưu khác nhau thu được từng loại Protein được quan tâm nghiên
cứu. Các phân đoạn hoạt tính Protein được quan tâm cao nhất sẽ tích lũy và tiến
hành tinh sạch bổ sung. Page 12

Độ tinh sạch của Protein tăng lên khi các phân đoạn Protein được chạy qua nhiều
cột sắc ký khác nhau thông thường một cột sắc ký đơn lẻ không đủ để tinh sạch
được một loại phân tử Protein mong muốn nào đó dù quá trình sắc ký được lặp
đi lặp lại nhiều lần thay vào đó người ta thường phải áp dụng một chuỗi các bước kỹ
thuật để có thể thu được phân đoạn chứa một lượng lớn loại phân tử Protein được
hồi lưu trong dung dịch muối đậm đặc từ cột tích điện dương (đối với Protein tích
điện âm) hoặc được hồi lưu sắc ký lọc gel (đối với Protein kích thước nhỏ), các kích
thước này đơn lẻ thường không đủ để thu được 1 sản phẩm Protein được tinh sạch
hoàn toàn.
6. Phân tích AMINO ACID bằng phương pháp HPLC
Sắc ký lỏng là phương pháp phân tích amino acid phổ biến nhất hiện nay. Sau hơn
50 năm kể từ khi công trình phân tích amino acid tự động đầu tiên được công bố,
nhiều công trình phân tích amino acid dựa trên phương pháp s ắc ký lỏng đã được
công bố và đưa phương pháp sắc ký lỏng trở thành phương pháp tiêu chuẩn cho

benzaldehyde và sodium nitrite [1]
7. Ứng dụng của phương pháp HPLC trong công nghệ thực phẩm Page 14

Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp được ứng dụng rất rộng rãi trong nhiều ngành,
nhiều lĩnh vực như: Trong nông sản, thực phẩm chế biến, thức ăn gia súc, thuỷ hải
sản.
Ví dụ:
·Kiểm tra dư lượng kháng sinh (nitrofuran, tetracycline…) trong thuỷ sản
· Kiểm tra dư lượng hóc môn (clenbuterol, salbutamol…) kích thích tăng trưởng,
tạo nạt cho gia súc
· Kiểm tra dư lượng màu đã bị cấm có trong thực phẩm và mỹ phẩm như: Sudan có
trong trứng gia cầm và trong son môi, 3 MCPD (3 Monoclo propan 1,2 diol) có
trong nước tương, formon có trong bánh phở…
+ Trong công nghiệp dược phẩm, sơn: Kiểm tra hàm lượng hoạt chất chính trong
dược phẩm, dư luợng chất có thể gây độc hại…
+ Ngoài ra còn ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác như quan trắc, môi trường…
- Trong ngành y tế nói chung và trong công tác phòng chống sốt rét nói riêng kỹ
thuật sắc ký lỏng cao áp vẫn có vai trò lớn. Hiện nay, thuốc giả và thuốc kém chất
lượng là một vấn nạn không những ở Việt Nam mà cả trên toàn thế giới, đã có hàng
ngàn ngươi chết vì thuốc giả và thuốc kém chất lượng. Để góp phần vào chiến dịch
này, Labo kiểm định hoá chất và thuốc của Viện đã ứng dụng kỹ thuật sắc ký lỏng
cao áp (HPLC) để kiểm tra hoạt chất chính có trong 2 loại thuốc sot rét là
Artesunate và Chloroquine. Page 15



hữu cơ chủ yếu trong lá, vỏ quả bứa khô được tìm thấy là axit (-) hyđroxy xitric
hàm lượng lần lượt là 2,863 và 15,221 %. Phần axit còn lại trong lá, vỏ quả bứa là
lượng nhỏ axit xitric. Đây là kết quả đầu tiên xác định thành phần các axit hữu cơ
từ bứa (Garcinia oblongifolia Champ. ex Benth.). Phương pháp sắc ký lỏng cao
áp (HPLC) đã được ứng dụng để xác định một số carotenoid quan trọng
trong rau quả như lutein, zeaxanthin, lycopene, α-carotene và β-carotene. Hai
phương pháp chính được khảo sát là phương pháp của Hart và Scott (1995) và
phương pháp theo AOAC (1984).
Các carotenoid được định tính và định lượng trên sắc ký lỏng với các detector UV-
VIS và PDA. Hàm lượng các carotenoid chính trong một số loại rau, quả đã được
xác định như sau: Lutein có nhiều nhất trong rau ngót và rau muống (5419,3 µg%
và 867,9 µg% tương ứng), lycopene có nhiều nhất trong cà chua và dưa hấu
(2750,0 µg% và 2000,5 µg% tương ứng), α-carotene có nhiều nhất trong ớt
vàng và carốt (3270,6 µg% và 3036,0 µg% tương ứng), và µ-carotene có hàm
lượng cao nhất trong rau ngót (6810,1µg%), carốt (6597,1µg%) và ớt vàng
(3606,7 µg%). Các kết quả thu được có thể áp dụng để phân tích các carotenoid
nhằm bổ sung cho bảng thành phần dinh dưỡng thực phẩm Việt Nam. Xác định dư
lượng thuốc trừ sâu họ Carbamate trong mẫu rau và gừng bằng phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao
III. PHƯƠNG PHÁP LC-MS
1. Khái niệm LC-MS
Phương pháp khối phổ (tiếng Anh: Mass spectrometry - MS) là một kĩ thuật dùng
để đo đạc tỉ lệ khối lượng trên điện tích của ion; dùng thiết bị chuyên dụng là khối
phổ kế. Kĩ thuật này có nhiều ứng dụng, bao gồm: Page 17




Page 18

máy khối phổ. Tùy theo loại điện tích của ion nghiên cứu mà người ta chọn kiểu
quét ion dương (+) hoặc âm (-). Kiểu quét ion dương thường cho nhiều thông tin
hơn về ion nghiên cứu nên được dùng phổ biến hơn.

Tuy nhiên, sự phát triển của kỹ thuật hiện nay cũng đã cho phép tích hợp hai kiểu
quét này thành một nhằm tạo điều kiện thuận lợi nhất cho các nhà nghiên cứu, tuy
nhiên thường độ nhạy không cao bằng từng kiểu quét riêng lẻ.

Trong rất nhiều năm, các nhà nghiên cứu kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ phải
đối mặt với rất nhiều khó khăn trong việc tìm cách giải quyết được sự tương thích
giữa hệ thống sắc ký lỏng và đầu dò khối phổ. Nguyên nhân là do quá trình phân
tích với đầu dò MS đòi hỏi mức độ chân không cao, nhiệt độ cao, các chất khảo sát
phải ở trạng thái khí, vận tốc dòng chảy nhỏ; trong khi hệ thống LC lại hoạt động ở
áp suất cao với một lượng dung môi tương đối lớn, nhiệt độ tương đối thấp, các chất
phân tích ở thể lỏng.

Để khắc phục những khó khăn trên, cần phải có một kỹ thuật trung gian gọi là giao
diện. Rất nhiều kỹ thuật giao diện (interface technology) như chùm tia hạt (FB), bắn
phá nguyên tử nhanh dòng liên tục (CF-FAB),… đã được nghiên cứu và ứng dụng,
nhưng mãi cho đến cuối thập nhiên 80, mới có sự đột phá thật sự với kỹ thuật ion
hóa tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Ionization – API).

Ưu điểm nổi bật của API là khả năng hình thành ion tại áp suất khí quyển ngay
trong buồng ion hóa. Điều này khác biệt với các kiểu ion hóa sử dụng trước đó cho
LC/MS như bắn phá nguyên tử nhanh với dòng liên tục (continuous flow- fast atom
bombardment CF-FAB) hay như tia nhiệt (thermospray – TS) đều đòi hỏi áp suất
thấp. Một thuận lợi nữa của API là sự ion hóa mềm (soft ionization), không phá vỡ

Chúng rất khác nhau về thiết kế và thao tác, với những ưu và nhược điểm riêng.

Đối với loại bẫy ion, các ion trước hết được bắt hoặc “mắc bẫy” trong một khoảng
thời gian nhất định rồi được phân tích bằng MS hoặc MS/MS. Loại máy này được Page 20

sử dụng khá rộng rãi (xét theo những công bố khoa học). Tuy nhiên, chúng có độ
chính xác không cao do chỉ có một số lượng khá hạn chế các ion có thể tích lũy vào
tâm điểm trước khi được tích điện trong không gian, do vậy có thể phản ánh sai lệch
sự phân bố và phép đo. Người ta cũng đã tiến hành cải tiến kỹ thuật trên bằng sự
phát triển các bẫy ion “tuyến tính” hoặc “hai chiều” khi những ion được tập hợp
trong một thể tích hình ống lớn hơn bẫy ion ba chiều truyền thống, cho phép làm
tăng độ nhạy, độ phân giải và độ chính xác.

FT-MS bản chất cũng là một loại khối phổ bẫy ion, cho phép bắt những ion dưới độ
chân không sâu trong một từ trường cao. Do được cải tiến và kết hợp cả hai loại
máy nên FT-MS có độ nhạy, độ chính xác và phân giải cao. Tuy nhiên, do vận hành
phức tạp và giá thành quá cao nên chúng ít được sử dụng trong phân tích dư lượng.

Đối với đầu dò khối phổ thời gian bay, tất cả các ion đơn điện tích nào chịu một sai
biệt về thế năng V sẽ đạt một năng lượng chuyển hóa eV (electron volt) như nhau.
Vì vậy, những ion có khối lượng lớn hơn sẽ có vận tốc nhỏ hơn nên mất nhiều thời
gian hơn để bay qua cùng một quãng đường dài trong một ống không có từ trường
(field-free flight tube). Các ion, sau khi được tăng tốc, bay ngang qua vùng không
trường, nơi đây chúng sẽ được tách riêng nhau ra tùy theo giá trị m/z của chúng, và
được tập trung tại bộ phận thu nhận tín hiệu. Do thời gian đến đích của các ion chỉ
cách nhau rất ngắn, 10-7 giây, nên máy cần có hệ thống điện tử cực nhạy để có thể
phân biệt được các ion.
Page 22

Được bắt nguồn từ hệ thống sắc ký lỏng, tại đầu ống dẫn mao quản, dưới ảnh hưởng
của điện thế cao và sự hỗ trợ của khí mang, mẫu được phun thành những hạt sương
nhỏ mang tích điện tại bề mặt. Khí ở xung quanh các giọt này tạo nhiệt năng làm
bay hơi dung môi ra khỏi giọt sương, khi đó, mật độ điện tích tại bề mặt hạt sương
gia tăng. Mật độ điện tích này tăng đến một điểm giới hạn (giới hạn ổn định
Rayleigh) để từ đó hạt sương phân chia thành những hạt nhỏ hơn vì lực đẩy lúc này
lớn hơn sức căng bề mặt. Quá trình này được lặp lại nhiều lần để hình thành những
hạt rất nhỏ. Từ những hạt rất nhỏ mang điện tích cao này, các ion phân tích được
chuyển thành thể khí bởi lực đẩy tĩnh điện rồi sau đó đi vào bộ phân tích khối.

Trong kỹ thuật ESI, phân tử nhất thiết phải được biến thành chất điện ly, tan trong
dung dịch dùng để phun sương. Điều này phụ thuộc vào: dung môi sử dụng, pKa
của chất điện ly và pH của dung dịch. Các dung môi phù hợp để phun sương là:
methanol, acetonitrile, ethanol,…
4.2 Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI)
APCI là kỹ thuật ion hóa thường được sử dụng để phân tích những hợp chất có độ
phân cực trung bình, có phân tử lượng nhỏ, dễ bay hơi.
Trong APCI, ion đươc hình thành như sau: mẫu hợp chất cần phân tích, hòa tan
trong pha động, sau khi ra khỏi cột sắc ký, được cho đi ngang qua ống mao quản đốt
nóng. Khi ra khỏi ống, nhờ khí N¬2, dung dịch được phun thành dạng sương từ đầu
ra của nguồn APCI. Các giọt sương nhỏ được một dòng khí dẫn đến một ống thạch
anh đun nóng, gọi là buồng dung môi hóa khí. Hợp chất đi theo luồng khí nóng ra
khỏi ống để đến một vùng có áp suất khí quyển, nơi đây sẽ xảy ra sự ion hóa hóa
học nhờ vào que phóng điện corona, tại đây có sự trao đổi proton để biến thành ion
dương (M + H)+ và trao đổi electron hoặc proton để biến thành ion âm (M – H)


trước đó, do vậy không thể dùng để nhận danh hay so sánh với các thư viện có sẵn.
Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SIM thường được lựa chọn để khảo sát
năng lượng phân mảnh khi đã biết ion mẹ.
5.3. SRM (Selected Reaction Monitoring) và MRM (Multiple Reaction
Monitoring)
Đối với khối phổ ba tứ cực, là máy đo khối phổ hai lần liên tiếp (MS-MS), 2 kỹ
thuật ghi phổ có độ nhạy cao thường được sử dụng là SRM và MRM.
- SRM: cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các mảnh ion
sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò để phát hiện.
- MRM: trên thực tế, do yêu cầu về mặt kỹ thuật đối với phân tích vi lượng nên các
ion con cần quan tâm thường từ 2 trở lên, do vậy kỹ thuật ghi phổ MRM thông dụng
hơn SRM. Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ nhất, phân mảnh ion
cô lập đó tại tứ cực thứ 2 (thực chất là buồng va chạm) thu được các ion con, cô lập
2 (hoặc nhiều) ion con cần quan tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa vào đầu dò để phát hiện.
6. Ứng dụng
6.1 Định lượng melanin trong sữa
Hiện nay, có rất nhiều phương pháp xác định melamin. Trong đó, sắc ký lỏng
ghép khối phổ (LC/MS) là một phương pháp có ñộnhạy, ñộchính xác cao và kết
quảphân tích mang tính khẳng định phù hợp với phát hiện melamin ở nồng độ ppb. Page 25

Melamin được chiết bằng acid tricloroacetic, sau ñó làm sạch và làm giàu
mẫu bằng chiết pha rắn (SPE). Chương trình sắc ký sửdụng cột C18 (150 x 4,6mm,
5µm); pha động là ACN và PFPA 0,5mM trong nước; tốc độ dòng 0,2ml/phút.
ðiều kiện khối phổ: ñặt chế ñộ SIM, chọn mảnh ion phân tử m/z=127amu.
Kết quảthẩm ñịnh cho thấy phương pháp có ñộtuyến tính tốt, ñáp ứng được yêu
cầu về độ lặp lại (RSD=1,94%). Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
là: LOD≈19ppb, LOQ≈62,5ppb. Phương pháp có độ đúng khá tốt, mức độtìm lại