Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng
LỜI MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
2. Đặt vấn đề
Cây dâu tây còn có tên khoa học là Fragaria thuộc chi
Fragaria, trên thế giới có khoảng 20 loài. Tại nước ta cây dâu tây chủ
yếu được trồng tại Đà Lạt (Lâm Đồng).
Cây dâu tây được coi như là cây trồng tiềm năng tại Đà Lạt.
Dâu tây được trồng khá lâu ở Đà Lạt. Tuy nhiên những năm gần đây
diện tích dâu tây giảm dần do thoái hóa giống, đồng thời thiếu nguồn
cung cấp giống dâu tây ổn định và sạch bệnh. Do vậy cần phát triển
nhân giống cây dâu tây theo công nghệ là vấn đề bức thiết đặt ra.
Việc áp dụng nghành công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật
vào công nghệ nhân giống dâu tây, đã và đang được các nhà khoa học
áp dụng. Mang lại những kết quả khả quan cho việc cải thiện diện tích
dâu tây ở Đà Lạt.
3.Tình hình nghiên cứu
Cây dâu tây là cây có nhiều nguồn lợi kinh tế, chính vì nguồn
lợi kinh tế đó mà việc đầu tư cho những nghiên cứu tại các Cơ quan
nghiên cứu nhiều tiêu biểu trong đó có Phân viện sinh học Tây
nguyên, Trung tâm nghiên cứu Khoai tây rau và hoa, trung tâm nghiên
cứu và ứng dụng nông nghiệp Lâm Đồng…
Dự án “Hoàn thiện quy trình nhân giống và cung cấp cây
giống dâu tây sạch bệnh, số lượng lớn cho các vùng trồng dâu tây
trong tỉnh Lâm Đồng” do Viện Sinh học Tây Nguyên chủ trì đã đặt ra
-1-
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng
mục tiêu: Hoàn thiện công nghệ nhân giống và trồng dâu tây, tạo ra
cây giống dâu sạch bệnh có chất lượng tốt đồng thời, xây dựng một số
mô hình trong dân. Do PGS.TS Dương Tấn Nhựt - Phó Viện trưởng
Viện Sinh học Tây Nguyên chủ nhiệm. Qua dự án này dựa trên trên

Khảo sát điều kiện sinh trưởng của cây dâu tây trong qui trình
trong phòng thí nghiệm.
5. Nội dung nghiên cứu:
Tiến hành khảo sát các bước nhân giống in vitro cây dâu tây từ
bước nhập mẫu cho đến lúc ra vườn ươm xuất giống.
6. Phương pháp nghiên cứu:
Theo dõi tỷ lệ sống xót của cây ở nồng độ khử trùng và thời
gian khác nhau.
Khảo sát sự phát triển của chồi ở nồng độ BA khác nhau.
Khảo sát khả năng ra rễ cây khi bổ sung NAA ở nồng độ khác
nhau.
7. Kết quả đạt được:
Theo dõi nồng độ và thời gian thích hợp để phát triển cây dâu
tây.
Chọn môi trường bổ sung chấ thích hợp quá trình nhân chồi và
phát triển của cây.
-3-
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro
1.2.1.Giới thiệu
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật hay nhân giống in vitro
đều là thuật ngữ mô tả nuôi cấy mô các bộ phận thực vật (tế bào đơn,
mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường chất dinh dưỡng
thích hợp như muối khoáng, vitamin, đường và các chất điều hòa sinh
trưởng thực vật trong điều kiện vô trùng.
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật cho pháp tái sinh chồi
hoặc cơ quan từ các mô như lá, thân, hoa, rễ, củ hoặc đỉnh sinh trưởng.
Trước kia người ta dùng phương pháp này để nghiên cứu các đặc tính

cây nuôi cấy mô đầu tiên thương mại hóa.Từ đó dến nay, công nghệ
nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được phát triển với tốc độ nhanh trên
nhiều và được ứng dụng thương mại hóa.
-5-
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng
Hình 1.1. Cây lan mô trong phòng thí nghiệm
1.1.3. Tầm quan trọng của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào
Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật có ý nghĩa vô
cùng to lớn với việc nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời
đóng góp trực tiếp thực tiễn sản xuất và đời sống.
1.1.3.1. Về mặt lý luận sinh học cơ bản.
Nuôi cấy mô đã mở ra khả năng to lớn cho việc tìm hiểu sâu
sắc bản chất của sự sống. Thông qua nuôi cấy mô và tế bào, ta có thể
so sánh đặc tính cơ thể với các hợp phần của chúng khi tách rời khỏi
cơ thể, từ đó rút ra những tương quan giữa các bộ phận trong cây.
Thực tế đã cho pháp tách và nuôi cấy trước hết là mô phân sinh chồi từ
đó cho ra nhóm tế bào không chuyên hóa là mô sẹo, từu mô sẹo có thể
kích thích để tái sinh cây hoàn chỉnh. Đây là ưu thế mà các nhà khoa
học sinh lý, hóa sinh và di truyền học dễ dàng sử dụng trong công việc
của mình.
-6-
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng
Trong một cơ thể rất khó phân biệt được từng giai đoạn một
cách cụ thể và chính xác theo chu kỳ phát triển của cá thể. Phương
pháp nuôi cấy mô có thể khắc phục được khó khăn trên và dễ dàng tạo
ra các bước phát sinh hình thái được phân biệt một cách rõ rệt. Điều
này tạo thuận lợi cho công tác nghiên cứu về các qui luật sinh trưởng,
phát triển cùng mối quan hệ giữa chúng với bên ngoài. Từ đó có thể
tìm ra các mấu chốt thúc đẩy sự phát triển của cây trồng theo hướng
mong muốn. Bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào, có thể nghiên

- Máy đo pH.
- Tủ lạnh.
-8-
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng
- Lò vi sóng.
1.2.4. Phòng thí nghiệm và nuôi cấy
- Tủ cấy vô trùng.
- Quạt thông gió.
- Đèn tử ngọai treo trên tường.
Hình 1.3. Phòng nuôi cấy mô
(Phòng này để phân tích sinh hoá, phân tử và di truyền).
- Kính hiển vi hai mắt (độ phóng đại 1000 lần).
- Kính lúp hai mắt (độ phóng đại 75 lần).
- Hệ thống đèn chiếu.
- Máy phổ kế…
1.2.5. Phòng chứa mẫu
- Kệ chất mẫu.
- Bóng đèn, ổn áp…
-9-
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng
Hình 1.4. Phòng chất cây
1.3. Nuôi cấy mô tạo cây hoàn chỉnh
1.3.1. Nuôi cấy nốt đơn thân
1.3.1.1. Phương pháp
Sử dụng chồi ngọn hoặc chồi mang một đoạn thân ngắn. Chồi
này sẽ được kích thích tăng trưởng thành cây nguyên vẹn.
Chồi được thu từ chồi ngọn hoặc ở các nách lá, sau đó cấy lên
môi trường dinh dưỡng với các điều kiện thích hợp để tăng trưởng.
Chồi mới tăng trưởng mang nhiều lá và tiếp tụ nhân nhanh để đạt đến
số lượng cần thiết. Chồi sẽ được cảm ứng cho ra rễ để thành cây hoàn

chỉnh.
-11-
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng
Thực tế, cả hai phương pháp này thường được áp dụng chung:
Đầu tiên chồi tăng trưởng bình thường, sau đó bổ sung cytokinin vào
môi trường nuôi cấy kích thích chồi bên.
Phương pháp nhân giống chồi bên được tiến hành đầu tiên trên cẩm
chướng, dâu tây, cúc đồng tiền Hiện nay, phương pháp này được áp
dụng nhiều loài thực vật phổ biến là cây ăn trái.
1.3.3. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
Nhiễm virus là một trong những nguyên nhân gây ảnh hưởng
lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của thực vật. Đặc biệt, virus
chuyển sang cac thế hệ kế tiếp trong quá trình thực vật sinh sản hữu
tính và ngay cả vô tính in vitro.
Trong đỉnh sinh trưởng của mô thực vật có dự cạnh tranh giữa
sự sinh sản của virus và sự phân chia tế bào của mô phân sinh để tạo tế
bào con. Ở vùng mô phân sinh trong suốt quá trình phân chia tế bào,
khả năng sinh tổng hợp nucletic acid được tận dụng để phân chia tế
bào sẽ gây bất lợi cho quá trình tăng sinh của virus.
Để có được nhiều đỉnh sinh trưởng sạch virus làm nguồn mẫu
cho nuôi cấy in vitro, trước tiên phải tiến hành tạo chồi bất định, sau
đó thu đỉnh sinh trưởng từ các chồi bất định này. Nếu đỉnh sinh trưởng
cô lập đang ở trạng thái hoạt động thì cơ hội loại trừ virus sẽ lớn hơn.
Nếu như đỉnh sinh trưởng được cô lập có kích thước lớn thì cơ hội thu
được cây sạch bệnh thấp.
Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng được áp dụng những
cây trồng cây trồng quan trọng như: khoai tây, thuốc lá, lily Một số
-12-
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng
cây thân gỗ như anh đào, mâm xôi, nho cũng được nuôi cấy đỉnh

Ngày nay, hệ thống bioreactor với cấu trúc của các bình lên
men và các cánh khuấy bằng kim loại được thay bằng silicon sục khí,
có thể điều khiển được tốc độ dòng khí để hạn chế những tương tác bất
lợi của mẫu cấy, hạn chế sự tổn thương của mẫu. Vì thế, hệ thống
bioreactor được sử dụng rộng rãi với nhiều mục đích khác nhau như:
nuôi cấy chồi và phôi thực vật, chồi hoa thu hải đường, nhân củ khoai
tây in vitro, hoa lily, một số cây thân gỗ và đặc cấy thu nhận các hợp
chất có hoạt tính sinh học như nuôi cấy rễ nhân sâm.
1.4.2. Nuôi cấy quang tự dưỡng
Nuôi cấy quang tự dưỡng Đã được giáo sư Kozai và các cộng
sự đẩy mạnh nghiên cứu trong thập niên 90. Từ đó đến nay có rất
nhiều nghiên cứu thành công trong ứng dụng phương pháp vi nhân
giống quang tự dưỡng vào sản xuất cây trồng.
Phương pháp vi nhân quang tự dưỡng có nhiều ưu điểm hơn so
với phương pháp truyền thống. Nó thúc đẩy sự tăng trưởng cây in
vitro, rút ngắn thời gian nuôi cấy và đồng thời làm hạ giá thành cây in
vitro.
Phương pháp này chú trọng đến các tác nhân vật lý của môi
trường nuôi cấy (ion, sự khuyếch tán khí hòa tan) và các yếu tố ảnh
-14-
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng
hưởng đến sự phát triển của cây con trong bình cấy (cường độ ánh
sáng, thời gian chiếu sáng, thành phần không khí, độ ẩm, nhiệt độ và
tốc độ luân chuyển của không khí trong bình nuôi cấy, ) thay vì chỉ
nghiên cứu thành phần hóa học của môi trường cấy như độ đường,
muối khoáng, vitamin hay các chất điều hòa sinh trưởng thực vật mà
các nhà nuôi cấy quan tâm. Trong vi nhân giống quang tự dưỡng,
đường không sử dụng trong môi trường nuôi cấy. Nói đúng hơn sử
dụng chất hữu cơ bao gồm cả chất điều hòa sinh trưởng thực vật,
vitamin, amino acid, ngoại trừ các chất khoáng được cho vào môi

tăng khác biệt giữa nồng độ CO
2
bên trong và bên ngoài hộp cấy và sự
gia tăng của ánh sáng làm cho hiệu quả quang hợp tăng lên.
1.5. Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
Hệ số nhân giống cao: Từ một mẫu vật sạch bệnh ban đầu,
bằng con đường nuôi cấy mô có thể nhân nhanh và cung cấp một
lượng giống lớn trong thời gian ngắn trên một quy mô mặt bằng hạn
chế. Đối với khoai tây chẳng hạn, từ một cây sạch bệnh trong ống
nghiệm (in vitro) trong vòng một năm có thể nhân lên hàng ngàn cây
trong phòng thí nghiệm.
Chất lượng giống tốt: Mẫu cây ban đầu (có thể sạch hoặc
không sạch bệnh) được nhập in vitro và nhân nhanh. Khi đạt một số
lượng nhất định cần thiết, mẫu được kiểm tra bệnh virus bằng các
phương pháp huyết thanh (ELISA, ngưng kết antigene – antibody),
hoặc cây chỉ thị. Mẫu không nhiễm tiếp tục được nhân nhanh cho mục
đích sử dụng (sản xuất giống hoặc phục vụ các nghiên cứu lai tạo
giống). Mẫu đồng nhất về mặt di truyền, dòng cây mong muốn, có khả
năng ra hoa và tạo quả sớm.
Khả năng chủ động trong nhân giống: Trong điều kiện phòng
thí nghiệm có kiểm soát, kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép nhân giống
quanh năm. Vì vậy, hoàn toàn có thể chủ động trong việc lập kế hoạch
sản xuất, cung cấp giống
-16-
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng
1.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trinh nuôi cấy mô tế bào thực
vật
Các nhân tố trong nuôi cấy mô tế bào thực vật có 3 nhân tố chính:
- Đảm bảo điều kiện vô trùng
- Chọn đúng môi trường và chuẩn bị đúng cách

giấy nhôm hoặc cất trong hộp kim loại để tránh bị nhiễm trơ lại sau khi
khử trùng.
Bảng 1.1 Thời gian khử trùng dụng cụ thủy tinh bằng nhiệt độ và nhiệt
độ khử trùng.
Nút đậy: thường là nút đậy không thấm nước. Nút đậy phải chặt để
bụi đi qua được đồng thời nước ở môi trường cũng không bốc hơi dễ
dàng trong quá trình nuôi cấy. Bông thấm nước là một loại chất đơn
giản nhất nhưng có những nhược điểm sau:
- Nếu khi nút bông bị ướt hoạc dính môi trường thì sẽ bị nấm
nhất là đối với những thí nghiệm lâu dài.
- Thao tác nút bông chậm không thể sản xuất trên qui mô lớn.
-18-
Nhiệt độ khử trùng
(
o
C)
Thời gian khử trùng
(Phút)
160 45
170 20
180 10
190 7,5
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng
- Chỉ dùng vài lần rồi bỏ.
Môi trường : Môi trường nuôi vấy thường được hấp khử trùng trong
nồi autoclave, khử trùng bằng áp suất hơi bão hòa. Thời gian thường
15 -30 phút ở áp suất 1atm nhiệt độ 121
o
C.
Bảng 1.2: bảng thể tích và thời gian hấp khử trùng( Autoclave)

ngoại trong box cần có 4 đèn tử ngoại 40W trên trần. Chỉ cho các đèn
tử ngoại làm việc khi không có người làm việc trong box cấy. Nên bật
đèn tử ngoại 30 phút và tắt trước 30 phút trước khi làm việc hoặc bật
sau khi đã ngưng làm việc. Cần hạn chế chuyển động không khí trong
phòng cấy đến mức tối thiểu. Các dụng cụ làm việc phải chuẩn bị đầy
đủ, bố trí hợp lý, thuận tiện để làm việc và hạn chế đi lại khi cấy, ra
vào buồng cấy, đóng cửa cẩn thận.
Phòng nuôi cũng phải được khử trùng trước là bằng xà bông
bột, sau đó lau bằng dung dịch calcium hypochlorite loãng hoặc cồn
70%. Tất cả trần, sàn đều phải được lau như vậy mỗi tuần. Không
được khuấy động những nơi bị nhiễm để tránh phát tán bào tử.
Khử trùng các dụng cụ kim loại và môi trường khoáng:
Các dụng cụ kim loại được khử trùng bằng không khí nóng
(130
o
– 170
o
C). Các dụng cụ này phải được gói kín trước khi khử
trùng, nên gói trong giấy nhôm là tốt nhất. Không nên hấp khử trùng
-20-
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng
dụng cụ kim loại vì điều kiện nóng ẩm sẽ làm kim loại bị rỉ sét và bị ăn
mòn.
Autoclave là phương pháp khử trùng bằng hơi nước dưới một
áp suất nhất định nút gòn, khăn vải, các vật dụng phòng thí nghiệm
bằng thủy tinh, các bình nuôi cấy bằng plastic, nút cao su, các bộ lọc,
nước, môi trường khoáng đều có thể khử trùng bằng nồi hấp. Gần như
tất cả vi sinh vật đều bị tiêu diệt bởi hơi nước trong nồi hấp thời gian
từ 10 - 30 phút ở nhiệt độ 121
o

phận nuôi cấy. Đối với cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí
nghiệm mà thành phần môi trường cũng thay đổi. Tuy nhiên tất cả các
môi trường nuôi cấy thành phần dinh dưỡng bao gồm 5 phần: khoáng
đa lượng, khoáng vi lượng, vitamin, đường (nguồn carbon) và các chất
điều hòa sinh trưởng thực vật.
Có một số công thức môi trường thường được sử dụng chủ yếu
trong nuôi cấy mô tế bào thực vậtnhư môi trường MS (Murashige và
skoog), B5 (Ganborg và cộng sự), SH (Schenk và Hilderbrandt) có
hàm lượng cao và một số môi trường khác mô tả bởi White, Gautheret,
Nitach Loyd và Mc Cown có hàm lượng khoáng đa lượng thấp.
1.6.3.1.Khoáng đa lượng
Nhu cầu khoáng của mô, tế bào tách rời không khác nhiều so
với cây trồng trong tự nhiên. Các nguyên tố đa lượng cần phải cung
cấp N, P, K, Ca, Mg và Fe.
1.6.3.2. Khoáng vi lượng
Nhu cầu khoáng vi lượng trong nuôi cấy mô thực vật in vitro là
lĩnh vực còn ít được nghiên cứu. Trước đây, khi kỹ thuật nuôi cấy mô
mới ra đời, người ta không nghĩ đến việc bổ sung khoáng vi lượng vào
môi trường nuôi cấy. Các thí nghiệm thành công do argar và hóa chất
-22-
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng
dùng để pha môi trường không tinh khiết mà có lẫn một số nguyên tố
vi lượng cung cấp phần nào cho môi trường nuôi cấy cung cấp phần
nào cho môi trường nuôi cấy. Các nguyên tố vi lượng cần cung cấp
cho tế bào là: Zn, Cu, B, Mn, Co, Mo
1.6.3.3.Carbon và nguồn năng lượng
Trong nuôi cấy in vitro, nguồn carbon giúp mô và tế bào thực
vật tổng hợp nên các chất hữu cơ để tế bào phân chia, tăng sinh khối
không phải từ quá trình quang hợp mà chính là nguồn carbon bổ sung
vào môi trường dưới dạng đường. Hai dạng đường thường hay gặp

trạng thái tiềm sinh), auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khỏi rễ
(phát thể non của rễ) nhưng cũng cản trở sự tăng trưởng của các sơ
khởi này. Trong sự tạo rễ auxin cần phối hợp với các vitamine (như
thiamine mà rễ không tạo được), amino acid (như arginin), và nhất là
các hợp chất othordiphenollic (như cafeic acid, chlorogenic acid)
Cytokinin: là một loại chất sinh trưởng thực vật thực vật kích
thích tế bào phân chia. Các hợp chất này xuất phát từ purine adenin,
một trong cac base của DNA và hợp chất cytokinin đầu tiên được
khám phá ra là kinetine, tiếp theo là zeatin một chất có trong phần lớn
thực vật và một vài vi khuẩn cấu trúc gần giống kinetine nhưng hoạt
tính cao hơn gấp 10 lần. Sau zeatin hơn 30 cytokinin khác nhau được
cô lập. Ngày nay, cytokinin để chỉ một hợp chất tự nhiên hay nhân tạo,
-24-
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng
có đặc tính sinh lí giống kinetin. Nhiều hợp chất có hoạt tính
cytokinin, chúng đều là apminopurin được thay thế ở vị trí thứ 6, ví dụ
như BA. Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào với điều kiện có
auxin và cytokinin tác động trên cả 2 bước của sự phân chia tế bào:
phân nhân và phân bào. Trong nuôi cấy mô nghèo cytokinin (mô lõi
thuốc lá, vỏ rễ đậu) auxin kích thích sự phân đôi nhiễm sắc thể, thậm
chí là tạo tế bào hai nhân, nhưng không có sự phân vách: sự phân vách
chỉ xảy ra khi cytokinin ngoại sinh. Cytokinin giúp đỡ sự gia tăng kích
thước tế bào và sinh tổng hợp protein. Trong thân và rễ, cytokinin cản
trở sự kéo dài nhưng kích thích sự tăng rộng lá tế bào lá trưởng thành.
Trong các nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật, tỷ lệ auxin/cytokinin
(A/C) là một yếu tố rất quan trọng: A/C cao sự tao rễ, A/C thấp sự tạo
chồi, vậy cytokinin hỗ trợ auxin trong tăng trưởng nhưng đồng thời
nhưng đồng thời cũng có sự đối kháng giữa auxin( giúp tạo rễ) và
cytokinin giúp tạo chồi. Sự cân bằng giữa 2 phytohormone này là một
trong những yếu tố kiểm soát phát triển.