BỘ CÔNG THƯƠNG
TỔNG CÔNG TY GIẤY VIỆT NAM
VIỆN NGHIÊN CỨU CÂY NGUYÊN LIỆU GIẤY
……………………*……………………

BÁO CÁO KẾT QUẢ ĐỀ TÀI
CẤP BỘ NĂM 2008

TÊN ĐỀ TÀI:

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VƯỜN GIỐNG VÔ TÍNH BẠCH
ĐÀN VÀ QUY TRÌNH NHÂN NHANH INVITRO MỘT SỐ
DÒNG BẠCH ĐÀN ƯU TRỘI CỦA VƯỜN GIỐNG FORTIP
VẠN XUÂN PHỤC VỤ SẢN XUẤT

CƠ QUAN CHỦ QUẢN: BỘ CÔNG THƯƠNG
CƠ QUAN CHỦ TRÌ: VIỆN NGHIÊN CỨU CÂY NGUYÊN LIỆU GIẤY
CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: ThS. PHẠM ĐỨC HUY

7116
17/02/2009


1.2.1. Tính cấp thiết của đề tài
2
1.2.2. Mục tiêu của đề tài
3
1.3. Địa điểm, đối tượng và nội dung nghiên cứu
4
1.3.1. Địa điểm nghiên cứu
4
1.3.2. Đối tượng nghiên cứu
4
1.3.3. Nội dung nghiên cứu
4
1.4. Tổng quan tình hình nghiên cứu
5
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
5
1.4.2. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài
7
II. THỰC NGHIỆM
9
2.1. Phương pháp nghiên cứu
9
2.1.1. Trồng vườn giống
9
2.1.2. Trồng và chăm sóc vườn vật liệu
10
2.1.3. Thử nghiệm nhân giống invitro
10
2.1.3.1. Phương pháp cắt, rửa và khử trùng mẫu 11
2.1.3.2. Thử nghiệm và chọn môi trường cơ bản 11

chồi hữu hiệu
26
2.3.3.4.
Ảnh hưởng của BAP và IBA đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi
hữu hiệu
30
2.3.2.5. So sánh HSNC và TLCHH giữa 5 dòng 31
III KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
33
3.1. Kết luận
33
3.2. Kiến nghị
33
IV. TÀI LIỆU THAM KHẢO
35
PHẦN PHỤ BIỂU

1
TÓM TẮT
Đề tài: “Nghiên cứu xây dựng vườn giống vô tính Bạch đàn và quy trình
nhân nhan in vitro một số dòng Bạch đàn ưu trội của vườn giống FORTIP Vạn
Xuân phục vụ sản xuất” được thực hiện trong 2 năm (2007 và 2008). Năm 2007,
đề tài đã chọn lọc được 20 cây trội của vườn giống FORTIP Vạn Xuân, thử
nghiệm các phương pháp ghép và tạo được 400 cây ghép với cành ghép được lấy
từ 20 cây trội
đã chọn lọc
Năm 2008, đề tài đã thực hiện 2 mục tiêu chính là xây dựng vườn giống

Ở nước ta hiện nay, cây Bạch đàn (Eucalyptus) là một trong những loài cây
trồ
ng rừng chủ lực trên hầu hết các vùng sinh thái nhằm đáp ứng các nhu cầu
nguyên liệu giấy, gỗ trụ mỏ, gỗ xây dựng, gỗ xẻ và củi. Trong khoảng 10 năm
trở lại đây, năng suất rừng trồng bạch đàn đã được cải thiện rõ rệt nhờ kết quả
của các chương trình cải thiện giống.
Giai đoạn từ năm 1996-1999, dự án FORTIP (Regional Project on Forest
Tree Improvement) về cải thiện giống cây rừng đã xây dựng 46 ha rừng giống và
vườn giống cho các loài cây Bạch đàn, Keo lá tràm và Keo tai tượng với nguồn
hạt được lấy từ các giống, xuất xứ triển vọng trong và ngoài nước. Dự án cũng
đã xây dựng được nhiều vườn giống, rừng giống thế hệ 1 và thế hệ 1.5 đáp ứng
nhu cầu giống cho nghiên cứu và sản xuất [3].
Vườ
n giống Bạch đàn tại Vạn Xuân, Phú Thọ gồm 144 gia đình được thiết
lập năm 1996 là một trong những vườn giống có nhiều gia đình và cá thể có
năng suất rất cao trong dự án FORTIP nói trên. Đây là nguồn vật liệu quý cần để
chọn lọc những dòng có năng suất cao từ đó nhân giống phục vụ trồng rừng và

3
xây dựng vườn giống cho phục phụ các chương trình nghiên cứu cải tạo giống
tiếp theo.
Đồng thời, để đạt được kết quả tốt thì một chương trình cải thiện giống
không chỉ dừng lại ở chỗ có được những giống được cải thiện mà giống đó phải
được nhân rộng phục vụ sản xuất và cung cấp vật liệu cho các chương trình c
ải
thiện giống khác. Do đó, yêu cầu cần thiết là xây dựng vườn giống từ các dòng
đã chọn lọc và tiến hành nhân giống vô tính phục vụ cho trồng rừng thử nghiệm
từ đó từng bước đưa cây giống chất lượng cao vào trồng rừng sản xuất.
Trong xây dựng rừng giống, vườn giống, để tăng phẩm chất di truyền của
hạt giống, người ta thiế

Thạch với diện tích 1,0 ha. Vườn vật liệu và thử nghiệm nhân giống in vitro tại
Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy.
1.3.2. Đối tượng nghiên cứu
• Cây trồng vườn giống:
Vườn giống đượ
c trồng từ cây ghép với cành ghép lấy từ 20 cây trội được
chọn lọc của vườn giống Vạn Xuân (20 cây trội đã được chọn năm 2007 của đề
tài này chi tiết xem phụ biểu 1).
Cây ghép đem trồng là cây có vết ghép đã ổn định. Sinh trưởng phát triển
tốt, không sâu bệnh, tán lá phát triển cân đối, chiều cao > 50cm.
• Cây thử nghiệm nuôi cấy in vitro:
Từ 20 cây trội đã chọn lọc, đề
tài lựa chọn 5 cây có thể tích thân cây cao
nhất làm đối tượng để tiến hành nghiên cứu nhân giống in vitro, cụ thể là các cây
trội sau: Cây trội số 154, 141, 122, 136 và 126 (đặc điểm cụ thể của 5 cây trội
thử nghiệm nhân giống in vitro xem phụ biểu 1).
1.3.3. Nội dung nghiên cứu.
Để đạt được mục tiêu đề ra, đề tài thực hiện các nội dung nghiên cứu sau:
1. Điều tra chọn địa đi
ểm thiết lập vườn giống.
2. Thu thập điều kiện tự nhiên, đất đai của địa điểm thiết lập vườn giống.
3. Thiết kế và trồng vườn giống.
4. Trồng và chăm sóc vườn vật liệu phục vụ cho nuôi cấy in vitro.
5. Nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy in vitro.
6. Thu thập các chỉ tiêu nghiên cứu, xử lý s
ố liệu và viết báo cáo khoa học.

5
1.4. Tổng quan tình hình nghiên cứu.
1.4.1. Trong nước.

Trung ương, …vv. Đồng thời, mộ
t số tỉnh và địa phương đã thành lập phòng
nuôi cấy in vitro để phục vụ cho công tác giống cây trồng và đã có những thành
công bước đầu.

6
Một số loài cây trồng rừng quan trọng, một số loài cây quý hiếm đã được
nghiên cứu và sản xuất. Cây Bạch đàn (Eucalyptus), cây Tếch (Techtona
grandis), cây Hông (Paulownia fortunei) đã được Viện nghiên cứu cây nguyên
liệu giấy Phù Ninh sản xuất ở quy mô công nghiệp; cây Keo lai (A. mangium x
A. auriculiformis) cây Trầm gió (Aquilaria crassna Pierri), cây tre Tàu
(sinocalamus latiflus), tre Mạnh tông (Dendrocalamus asper) và nhiều loài cây
khác đã nghiên cứu thành công. Các kết quả này cho thấy bước đầu có nhiều
triển vọ
ng cho sản xuất cây con giống chất lượng cao.
Mai Đình Hồng, 1995 đã đưa ra môi trường nuôi cấy in vitro cây bạch đàn
urô dòng U6 như sau: môi trường nhân chồi là MS + 3% đường + 4.5 g/l agar +
0.5 mg/l BAP + 0.25 mg/l NAA. Môi trường tạo rễ và cây con hoàn chỉnh là MS
1/4 nồng độ + 1.5 % đường + 5 g/l agar + 1 mg/l IBA [2].
Nhóm tác giả của Viện Sinh học nhiệt đới, Sở NN&PTNT Kiên Giang và
Trường Đại học Nông lâm Tp.HCM đã nghiên cứu và đưa ra môi trường nuôi
cấy cây Trầm hương (Aquilaria crassna) là WPM + 0.1 mg/l BA + CW (10%)
cho phát sinh chồi. Môi trường thuận l
ợi cho tạo chồi và nhân nhanh chồi là
WPM + BA (0.1 mg/l) + NAA (0.1 mg/l) [7].
Cũng với cây trầm, Đoàn Thị Mai và cộng sự đã đưa ra môi trường nhân
chồi thích hợp là MS cải tiến bổ sung 1.0 mg/l BAP + 0.5 mg/l kinetin. Môi
trường ra rễ thích hợp nhất là 1/2 MS cải tiến bổ sung 2.0 mg/l IBA [5].
Nhân giống in vitro cây Tre tàu (Sinocalamus latiflorus) và tre Mạnh tông
(Dendrocalamus asper) với mẫu vật được lấy từ hạt và được khử trùng bằng

cây thân gỗ rất đa dạng, tuy nhiên người ta thường sử dụng 5 loại môi trường
sau[14]:
 Môi trường khoáng MS (Murashige & Skoog, 1962) là môi trường cơ bản,
giàu dinh dưỡng thích hợp cho các loài thực vật nói chung. Môi trường
này không chỉ đơn thuần sử dụng trong nuôi cấy mô mà nó còn được sử
dụng trong nuôi cấy tế bào, nuôi cấy phôi vô tính, nuôi cấy hạt phấn, bao
phấn…vv.
 Môi trường MS cải tiế
n (Murashige & Skoog medium including Nitsch
vitamins, 1969). Đây là môi trường MS (1962) được bổ sung thêm một số
loại vitamin. Thành phần môi trường được nghiên cứu và công bố bởi
Nitsch năm 1969, môi trường này được sử dụng để nuôi cấy nhiều loài cây
khác nhau trong đó có cây mận (Prunus spp), cây ôliu (Olea
europaea)…vv.
 Môi trường WPM (Woody Plant Medium) được Mccown đưa ra vào năm
1980 là môi trường thường được dùng để nuôi cấy các loài cây gỗ. Đã có
nhiều công trình nuôi cấy in vitro sử dụng môi trường này như nhân giống
thông (Loblolly pine, Pinus taeda
) ở Mỹ.

8
 Môi trường Litvay là môi trường mà tên môi trường được lấy từ tên tác
giả nghiên cứu ra (Litvay J.D, 1985). Đây cũng là môi trường được tác giả
sử dụng để nuôi cấy cây thông nói chung (Pinus).
 Môi trường WV3 (Westvaco3 Medium, 1997) là môi trường đã được sử
dụng để nuôi cấy cây thông, cây dương.
lai (P. caribaea x P. elliottii) ở Ôxtrâylia,…vv.
Công trình của M.E.cortezzi Graca và S.Mendes thuộc Trung tâm nghiên
cứu lâm nghiệp Curitiba, Brazil đã nuôi cấy in vitro cây Bạch đàn (Eucalyptus
dunnii Maid) tốt nhất trên môi trường MS có bổ sung 0,1 mg/l BAP + 0,01 mg/l

đất màu xung quanh gốc với đường kính từ 0,5 – 0,6m. Tiếp tục trồng dặm cây
chết, thời gian chăm sóc từ 1-1,5 tháng, thời gian chăm sóc vào tháng 5-6.
Lần 2: Phát thực bì cạnh tranh, cắt dây leo trên toàn diện tích, rẫy cỏ và xới vun
đất màu xung quanh gốc với đường kính từ 0,6 – 0,8m. Thời gian chăm sóc vào
tháng 8-10. Bón thúc 500gam phân NPK
Lần 3: Phát thực bì cạnh tranh, cắt dây leo trên toàn di
ện tích.

10
 Theo dõi, thu thập số liệu của vườn giống.
Theo dõi thu thập các chỉ tiêu Hvn; Hg; Dt; sâu bệnh và phẩm chất cây: tốt,
xấu, trung bình.
- Cây tốt: là cây sinh trưởng tốt, tán lá xanh đẹp, phát triển cân đối, không sâu
bệnh.
- Cây trung bình: là cây sinh trưởng phát triển ở mức độ trung bình, không sâu
bệnh.
- Cây xấu: là cây sinh trưởng kém, còi cọc, sâu bệnh.
2.1.2. Trồng và chăm sóc vườn vật liệu
Vườn vật liệu được trồng từ cây ghép của 5 cây trội chọn lọc. Cây được
trồng ra đất theo luống, giữa các luống cách nhau 0,5m. Cây được trồng theo
hàng trên luống với cự ly 25 x 25cm, mỗi giống trồng 20 cây.
Trước khi trồng làm đất toàn diện và nhặt sạch cỏ, khi trồng bón lót 100g
phân NPK cho mỗi hố. Vườn vật liệu
được tưới chăm sóc và rẫy nhổ cỏ và cắt
tỉa tạo chồi thường xuyên nhằm cung cấp nguồn vật liệu tốt nhất cho nhân giống
in vitro.
2.1.3. Thử nghiệm nhân giống in vitro.
Sơ đồ chung của phương pháp nhân giống in vitro
Cây trội (đối tượng cần nhân giống).
Xử lý cho nảy chồi và cắt mẫu.

trùng. Cuối cùng, khử trùng mẫu bằng HgCl
2
0,1% trong thời gian 11 phút.
2.1.3.2. Thử nghiệm và chọn môi trường cơ bản.
Đề tài tiến hành cấy mẫu đã được khử trùng vào ống nghiệm chứa 5 loại
môi trường sau có bổ sung sucrose 30g/l; 4.5g/l agar, 2.0mg/l vitamin B2, pH=6
và không bổ sung chất điều hoà sinh trưởng (thành phần 5 loại môi trường xem
phụ biểu 2)[14].
1. Công thức 1: Môi trường Litvay.
2. Công thức 2: Môi trường MS.
3. Công thức 3: Môi trường MS cải tiến.
4. Công thức 4: Môi trường WPM.
5.
Công thức 5: Môi trường WV3.
6. Công thức 6: Đối chứng (môi trường nuôi cấy dòng PN14 không bổ
sung chất điều hòa sinh trưởng)[8].
2.1.3.3. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến HSNC và TLCHH.
Các chất điều hoà sinh trưởng tuy chiếm hàm lượng rất nhỏ trong môi
trường nuôi cấy nhưng có vai trò quan trọng quyết định sự thành công của quá
trình nhân giống. Trong môi trường nhân giống in vitro người ta thường sử dụng

12
các chất kích thích sinh trưởng trong nhóm auxin như NAA và IBA. Các chất
trongvà cytokinin . Auxin được sử dụng để điều chỉnh sự phát sinh rễ. Cytokinin
sử dụng để điều chỉnh sự phát sinh chồi. Tỷ lệ cân đối giữa auxin/cytokinin tạo
cây hoàn chỉnh [1]. Trong nhân giống in vitro, người ta thường sử dụng auxin là
IAA, NAA và IBA, cytokinin là BAP, BA và kinetin.
• Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến HSNC và TLCHH của 5 dòng
nghiên cứu.
Từ môi trường cho HSNC tốt nhất ở các thí nghiệm về ảnh hưởng của môi

đến HSNC và TLCHH của 5 dòng nghiên cứu. Đề tài tiến hành nghiên cứu ảnh
hưởng của BAB và IBA đến hiệu quả của quá trình nhân nhanh chồi. Môi trường
WPM + 30 g/l sucrose + 4.5g/l agar + 2.0 mg/l vitamin B2 + 2.0 mg/l BAP,
pH=6 được bổ sung IBA ở mức các nồng độ (mg/l) thay đổi như sau:
Công thức 19: Nồng độ 0,05 mg/l IBA
Công thức 20: Nồng độ 0,10mg/l IBA
Công thức 21: Nồng
độ 0,15 mg/l IBA
Công thức 22: Nồng độ 0,20 mg/l IBA
Công thức 23: Nồng độ 0,25 mg/l IBA
Công thức 24: Đối chứng (môi trường sản xuất dòng PN14).
2.1.3.4. Điều kiện thí nghiệm
 Sau khi cấy mẫu được duy trì trong tủ lạnh (ngăn mát 12
0
C±1) 48 giờ.
 Quá trình nuôi cấy (nhân chồi và tạo rễ) được tiến hành trong điều kiện ánh
sáng, nhiệt độ và độ ẩm được duy trì như sau:
- Ánh sáng: mẫu được nuôi cấy dưới ánh đèn nêon với cường độ ánh từ
1000 – 3000 lux, thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày.
- Nhiệt độ: duy trì nhiệt độ trong phòng từ 23 – 27
0
C.
- Độ ẩm: thường xuyên xấp xỉ 60%.
 Các thí nghiệm chọn loại môi trường cơ bản, mỗi công thức theo dõi 60
mẫu sống (ống nghiệm). Vì giai đoạn này tỷ lệ chồi hữu hiệu chưa thể hiện
rõ nên đề tài chỉ đánh giá kết quả qua HSNC sau 4 tuần nuôi cấy.
 Các thí nghiệm nghiên cứu môi trường nhân chồi, mỗi công thức theo dõi
10 bình, mỗi bình 6 chồi nuôi cấy. Môi trường chứa trong bình tam giác.
Đánh giá k
ết quả qua HSNC và TLCHH sau 4 tuần nuôi cấy.

Để tiến hành phân tích phương sai, trước hết cần kiểm tra các mẫu có nằm
trong một tổng thể hay không nói cách khác phương sai tổng thể bằng nhau là
điều kiện cần và đủ để tiến hành phân tích phương sai một nhân tố. Khi giá trị
Sig trong bảng Test of Homogeneity of Variances >0,05 điều này có nghĩa
phương sai tổng thể
bằng nhau và ngược lại.
Nếu phương sai tổng thể không bằng nhau, chúng tôi sẽ tiến hành kiểm tra
sự sai khác về tỷ lệ sống của cành ghép qua tiêu chuẩn LSD. Các công thức có
sự sai khác được đánh dấu (*), còn lại là không sai khác.

15
- Phân tích phương sai một nhân tố (Anova)
Giả thuyết Ho: Không có sự sai khác giữa các chỉ tiêu so sánh (chỉ tiêu so sánh
đồng đều ở các nhân tố kiểm tra)
Giả thuyết H
1
: Có sự sai khác giữa các chỉ tiêu so sánh (chỉ tiêu so sánh có sự
khác nhau rõ rệt về mặt thống kê)
+ Trong bảng ANOVA, Nếu giá trị Sig của F thu được >0,05 thì chấp nhận
H
0
(Không có sự sai khác)
+ Trong bảng ANOVA, nếu giá trị Sig của F <0,05 thì chấp nhận H
1
(Sai
khác rõ rệt về mặt thống kê)
.
- Phân nhóm bằng tiêu chuẩn Duncan
Sử dụng tiêu chuẩn Duncan để phân nhóm ảnh hưởng của các nhân tố đến
kết quả nghiên cứu. Trong bảng phân nhóm Duncan, chỉ tiêu so sánh được chia

khai thác bạch đàn.
Đề tài đã tiến hành đào và mô tả phẫu diện đất, kết quả mô tả phẫu diện
đất được thể hiện ở phụ biểu 4.
Ở khu vực này cây Bạch đàn nói chung cũng như Bạch đàn urophylla sinh
trưởng phát triển tốt. Địa điể
m trồng vườn giống có độ dốc nhỏ, và có cách ly
với rừng trồng Bạch đàn. Ở đây cũng chưa từng xảy ra sâu bệnh hại rừng trồng
Bạch đàn ở mức độ nguy hiểm. Đồng thời đất rừng thuộc sự quản lý của Công ty
lâm nghiệp Lập Thạch thuộc quy hoạch vùng nguyên liệu của Công ty giấy Bãi
Bằng nên thuận lợi cho việc quản lý, b
ảo vệ và duy trì vườn giống lâu dài. Do
vậy, đây là địa điểm tốt để thực hiện xây dựng vườn giống của đề tài.
2.3.1.2. Thiết kế và trồng vườn giống.
Kết hợp với Công ty thiết kế lâm nghiệp, đề tài đã xây dựng hồ sơ thiết kế
và trồng vườn giống theo đúng quy phạm kỹ thuật xây dựng rừng giống, vườn
giố
ng của Bộ NN&PTNT. Sơ đồ bố trí các dòng trồng tại vườn giống thể hiện tại
phụ biểu 3.
2.3.1.3. Sinh trưởng của các dòng.
Vườn giống được trồng giữa tháng 6/2008, đến đầu tháng 12/2008 đề tài
tiến hành đo đếm các chỉ tiêu sinh trưởng và phát triển. Kết quả sinh trưởng và
phát triển của các dòng cây ghép ở 6 tháng tuổi như sau:

17
a) Tỷ lệ sống.
Tỷ lệ sống phản ánh sự thích ứng của điều kiện lập địa và khí hậu đối với
cây trồng [9]. Lập Thạch là nơi thích hợp cho trồng rừng Bạch đàn đồng thời cây
ghép được trồng có bầu to (Φ14cm). Cây đem trồng đủ tiêu chuẩn, sinh trưởng và
phát triển tốt nên ở tất cả các dòng , khi đem trồng cây sinh trưởng, phát triển tốt
nên hầu hết cây trồng đều sống 100%. Tuy nhiên do vết ghép yếu nên một số cây

Sinh trưởng Dt thể hiện khả năng sử dụng không gian dinh dưỡng của cây
trồng (gồm cả phía trên mặt đất và hệ rễ dưới mặt đất). Đối với rừng giống và
vườn giống từ cây ghép thì đường kính tán ảnh hưởng rõ rệt đến sản lượng và
chất lượng hạt giống.
Dt của các dòng nói chung khá cao (1.1m) và giữa các dòng có sự biến
động mạnh. Cao nhất là dòng 13 và dòng 7 với Dt là 1.34m; thấ
p nhất là dòng 19
với Dt là 0.87m. Tuy nhiên sự khác nhau này cũng không có ý nghĩa về mặt
thống kê toán học.
Tóm lại: Sinh trưởng của các dòng cây ghép không có sự sai khác rõ rệt
về cả Hvn, Dg và Dt. Có thể tại thời điểm đo đếm vườn giống mới ở 6 tháng tuổi
nên các chỉ tiêu này chưa được thể hiện một các rõ ràng. Tại thời điểm này, vườn
giống chưa có hiện tượng sâu bệnh hại.

Bảng 02: So sánh phương sai của các chỉ tiêu sinh trưởng.
ANOVA

Sum of
Squares df Mean Square F Sig.
Between Groups 3.438 19 .181 1.007 .455
Within Groups 33.603 187 .180

Hvn (m)
Total 37.041 206

Between Groups 9.589 19 .505 .830 .670
Within Groups 113.739 187 .608

Dg (cm)
Total 123.329 206

N
7 7 7 7
Mean
1.8917 2.1083 1.15 100.0
5
N
12 12 12 12
Mean
1.5 1.9308 1.1692 92.3
6
N
13 13 13 13
Mean
1.6231 1.8077 1.3462 92.3
7
N
13 13 13 13
Mean
1.7615 2.1846 1.2615 100.0
8
N
13 13 13 13
Mean
1.88 2 1.18 90.0
9
N
10 10 10 10
Mean
1.525 1.725 0.975 87.5
10

16
N
8 8 8 8
Mean
1.7375 2 1.05 87.5
17
N
8 8 8 8
Mean
1.65 1.8333 1.1833 100.0
18
N
6 6 6 6
Mean
1.525 1.75 0.875 100.0
19
N
4 4 4 4
Mean
1.8 2.225 1.225 100.0
20
N
4 4 4 4
Mean
1.7208 1.9435 1.1435 95.5
Total
N
207 207 207 207

20