1
MỤC LỤC
Trang phụ bìa
1
2
CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu, chữ Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt
bp Base paire Cặp Bazơ
DNA Deoxyribonucleic acid Axit Deoxyribonucleic
dNTP Deoxynucleoside triphosphate Deoxynucleosit triphosphát
EDTA Ethylene diamine tetracetic acid Axít êthylen điamin têtraceetic
EtBt Ethidium bromid Ethidium brômit
PRLR Prolactin receptor Thụ thể Prolactin
kb Kilobase Kilô bazơ
µg Microgram Micrô gram
µl Microlitre Micrô lít
TBE Tris boric acid - EDTA Đệm TBE
TE Tris - EDTA Đệm TE
RNase Ribonuclease Ribônucleaza
RFLP
Restriction Fragment Length
Polymorphism
Đa hình độ dài các đoạn cắt
giới hạn
RADP
Random Amplified polymorphic
DNA
Đa hình DNA được khuếch đại
ngẫu nhiên
QTL Quantitative trait loci Vị trí tính trạng số lượng
PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi Polymerase

chậm, tỷ lệ mỡ và tiêu tốn thức ăn cao, nhưng thịt mỡ thơm ngon rất được người
dân ưa chuộng.
Lợn địa phương Pác Nặm được nuôi phổ biến ở trong các nông hộ theo hình
thức bán hoang dã quanh nhà và vườn rừng, nguồn thức ăn chủ yếu là ngô, sắn, cám
gạo và rau cỏ tự nhiên. Cũng như các giống lợn địa phương khác, lợn địa phương
Pác Nặm có đặc điểm nổi trội như khả năng thích nghi cao, thịt thơm và ngon. Đặc
biệt nhóm lợn đen tuyền, thường được coi là đặc sản bởi nuôi tự nhiên, không có
tồn dư thuốc tăng trọng cũng như kháng sinh và bị săn mua ráo riết dẫn đến nguy cơ
tuyệt chủng cao. Trong những năm qua, các nhà khoa học trường Đại học Nông
Lâm Thái Nguyên đã phối hợp với Phòng Nông nghiệp và PTNT huyện Pác Nặm
tiến hành chọn lọc, lai tạo giống lợn địa phương Pác Nặm với lợn rừng Thái Lan tạo
ra nhóm lợn lai mang các đặc điểm có giá trị của cả hai giống lợn bố và mẹ. Tuy
nhiên, một hạn chế đặt ra là khả năng sinh sản của cả hai nhóm lợn rừng và lợn địa
5
6
phương Pác Nặm đều không cao, làm ảnh hưởng đến tốc độ tăng đàn. Số lợn con
đẻ/lứa là một chỉ tiêu kinh tế kỹ thuật rất quan trọng, những nghiên cứu cải tiến vấn
đề này luôn là mối quan tâm của các nhà khoa học. Ngoài việc chọn lọc theo kỹ thuật
truyền thống, việc áp dụng các kỹ thuật di truyền học phân tử để xác định các locus
gen và các vùng nhiễm sắc thể chứa các locus gen có ảnh hưởng đến các tính trạng
này đang mở ra một hướng nghiên cứu đầy triển vọng. Trong đó, một số chỉ thị di
truyền liên quan đến tính trạng này như ESR (Oestrogen receptor gene) [52], PRLR
(Prolactin recptor gene) [57], FSH (Follicle Stimulating Hormone β suybinit Gene)
[47], Properdine đã được nghiên cứu ở một số giống lợn.
Với mục đích ứng dụng các kỹ thuật di truyền phân tử để xác định sự tương
quan giữa đa hình gen và số con/lứa đẻ ở lợn lai và khảo sát khả năng sinh sản của
chúng nhằm phục vụ công tác chọn lọc và lai tạo đàn lợn giống phù hợp với điều
kiện tự nhiên và chăn nuôi của người dân, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
“Nghiên cứu khả năng sinh sản và mối tương quan với các đa hình gen
thụ thể prolactin và properdine của lợn nái lai F1 (đực rừng Thái Lan x nái địa

là con lai giữa hai dòng, giống khởi đầu là bố mẹ của chúng. Ví dụ: cho lợn đực
Yorkshire phối giống với lợn cái Móng Cái, đời con là Yorkshire x Móng Cái.
- Vai trò tác dụng của lai giống:
Lai giống có hai tác dụng chủ yếu. Một là tạo được ưu thế lai ở đời con về một
số tính trạng nhất định. Các tác động cộng gộp là nguyên nhân của hiện tượng sinh
học này. Hai là làm phong phú thêm bản chất di truyền ở thế hệ lai bởi vì con lai có
được những đặc điểm di truyền của giống khởi đầu, người ta gọi đó là tác dụng phối
hợp. Điều này có nghĩa là lai giống sử dụng được tác động cộng gộp các nguồn gen
ở thế hệ bố mẹ.
+ Ưu thế lai
Khái niệm ưu thế lai được đề xuất bởi Shull (1914). [40]
Ưu thế lai là hiện tượng con lai có sức sống, sức chống đỡ bệnh tật và năng
suất cao hơn mức trung bình của thế hệ bố mẹ.
Mức độ ưu thế lai của một tính trạng được tính bằng công thức sau:
H (%)=
)(2/1
)(2/1)(2/1
BA
BABAAB
+
+−+
x 100
Trong đó:
H: ưu thế lai
AB : giá trị kiểu hình trung bình của con lai bố A, mẹ B
BA: giá trị kiêu hình trung bình của con lai bố B, mẹ A
A: giá trị trung bình của dòng (giống) A
B: giá trị trung bình của dòng (giống) B
8
9

Theo Xignort thời gian động dục lần đầu thường ngắn hơn những lần sau, đồng thời
thường không có trứng rụng hoặc trứng rụng rất ít, kích thước tế bào trứng nhỏ hơn
những lần sau.
- Ảnh hưởng của dinh dưỡng: Nếu dinh dưỡng tốt thì chu kỳ tính ổn định và
ngược lại.
- Trong thời gian động dục lợn nái có sự rụng trứng, từ đó liên quan đến sự thụ
thai, chửa và đẻ.
Trong quá trình động dục, hàm lượng hormone có sự thay đổi qua các ngày
trong chu kì động dục của lợn nái. Oestrogen tăng mạnh từ ngày thứ 10 và cao nhất
ở ngày 20-21 (29 - 30pg/ml trong huyết thanh), sau đó giảm dần xuống 7-8 ở ngày
thứ 8 sau động dục. Hàm lượng prostaglandin trong tĩnh mạch tử cung thay đổi và
đột nhiên tăng cao ở ngày 15 (6ng/ml), trong khi bình thường tỷ lệ này 0,3-0,5
ng/ml. Hormone progesterone tăng tiết từ ngày 1 đến 13 (32 ng/ml) trong huyết
thanh và giảm dần và xuống tỷ lệ thấp nhất ở ngày thứ 20, chỉ còn 0,8-1ng/ml. Hàm
lượng prolactin huyết thanh thay đổi liên tục từ ngày 13 đến ngày thứ 5 sau chu kì
động dục biến động lên đến 15 ng/ml và sau 1 ngày xuống lại 1,5-1,8ng/ml, cứ thay
đổi lên xuống theo chu kì 2-3 ngày nhưng ở ngày đầu chu kì từ 2-13 có hàm lượng
thấp 1,8ng/ml. FSH và LH thay đổi và khi động dục tỷ lệ FSH/LH = 1/3.
Số lượng tế bào trứng rụng trong 1 chu kỳ động dục phụ thuộc vào giống, tuổi,
và chế độ nuôi dưỡng, chăm sóc. Qua một số nghiên cứu cho biết, lợn nái Móng Cái
15 - 30 tế bào. Số lượng tế bào trứng rụng phụ thuộc vào chế độ nuôi dưỡng. Vì vậy
người ta thường tăng cường nuôi dưỡng lợn nái trước khi phối giống để tăng số tế
bào trứng rụng nhưng đến lúc gần động dục cho giảm tiêu chuẩn ăn, (Kiều Minh Lực
và CTV, 2002) [16]
1.1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát dục của lợn cái
Sự thành thục về tính của lợn phụ thuộc nhiều yếu tố.
- Giống: Theo Trần Thế Thông lợn nái Móng Cái thành thục về tính lúc 4
tháng 12 ngày, trọng lượng đạt 12 kg. Trong cùng một giống nhưng khi phối đồng
huyết thì thành thục về tính muộn hơn.
10

12
- Bình quân số lợn con đẻ ra còn sống/lứa: là tỷ lệ giữa tổng số lợn con đẻ ra
còn sống trong 24 giờ kể từ khi lợn nái đẻ xong của tất cả các lứa đẻ trên tổng số
lứa đẻ. Số con đẻ ra để lại nuôi: số lợn con đẻ ra còn sống để lại nuôi, đối với lợn
ngoại khối lượng lớn hơn 0,8 kg, đối với lợn nội khối lượng lớn hơn 0,3 kg.
- Tỷ lệ sống: tỷ lệ sống của lợn con sau 24 giờ là tỷ lệ số lợn con còn sống đến
24 giờ so với số con đẻ ra còn sống.
- Số con cai sữa/ lứa: đây là chỉ tiêu kinh tế kỹ thuật rất quan trọng, quyết định
năng suất trong chăn nuôi lợn nái, nó phụ thuộc vào kỹ thuật chăn nuôi lợn con bú
sữa, khả năng tiết sữa khả năng nuôi con của lợn mẹ và khả năng hạn chế các yếu tố
gây bệnh cho lợn con. Đó là số lợn con còn sống cho đến khi cai sữa, thời gian cai
sữa dài hay ngắn phụ thuộc vào trình độ chế biến thức ăn và kỹ thuật nuôi. Trong
chăn nuôi đại trà thường cai sữa vào 35 hoặc 42 ngày tuổi.
- Số con cai sữa /nái/năm: là chỉ tiêu tổng quát nhất để đánh giá năng suất
chăn nuôi lợn nái. Chỉ tiêu này phụ thuộc vào thời gian cai sữa lợn con và số lợn
con cai sữa trong mỗi lứa đe. Nếu cai sữa sớm sẽ tăng số lứa đẻ/nái/năm, và tăng số
lượng lợn con cai sữa trong mỗi lứa thì số lượng lợn con cai sữa/nái/năm cao và
ngược lại. Số lượng lợn con cai sữa/nái/năm là tỷ lệ giữa tổng số lợn con cai sữa
trong năm so với tổng số lợn nái sinh sản trong năm.
- Khối lượng sơ sinh:
Là khối lượng lợn con được cân ngay sau khi đẻ, đã được cắt rốn, lau khô và
bấm số tai và trước khi cho bú ngày đầu tiên.
Khối lượng sơ sinh toàn ổ là chỉ tiêu nói lên khả năng nuôi dưỡng thai của lợn
mẹ, đặc điểm giống, kỹ thuật quản lý chăm sóc và phòng bệnh cho lợn nái chửa. Do đó
thành tích này phụ thuộc cả vào phần của lợn nái và phần nuôi dưỡng của con người.
Khối lượng sơ sinh toàn ổ là khối lượng của tất cả lợn con sinh ra còn sống và
được phát dục hoàn toàn. Nếu những lợn sinh ra khỏe mạnh mà bị lợn mẹ đè chết thì
đó thuộc về trách nhiệm của con người chứ không phụ thuộc vào năng suất của lợn nái.
Khối lợn sơ sinh phụ thuộc vào giống, khối lượng sơ sinh của lợn nội (Ỉ, Móng Cái)
thường từ 0,4 - 0,6 kg/con, khối lượng sơ sinh của lợn ngoại trung bình 1,1 - 1,2 kg/con.

Việt Nam nuôi phổ biến là các giống lợn Mẹo, lợn Mường Khương, lợn Táp Ná, lợn
địa phương Pác Nặm, Trải qua quá trình chọn lọc, các giống lợn ở nước ta đã thích
13
14
nghi với điều kiện tự nhiên và kinh tế xã hội của địa phương. Chúng có đặc điểm di
truyền quý giá đó là khả năng sử dụng các loại thức ăn thô xanh, nghèo dinh dưỡng và
tính chống chịu các bệnh tật nhiệt đới rất tốt, nhất là bệnh ký sinh trùng. Các giống lợn
này thường đẻ nhiều con và có phẩm chất thịt thơm ngon, một số giống có khả năng
thích nghi với vùng núi cao, nhiệt độ thấp và một số lại quen với môi trường ẩm ướt
(Lê Viết Ly, 1994) [20].
Giống lợn địa phương có tầm quan trọng đặc biệt trong đời sống các dân tộc
thiểu số vùng núi phía Bắc. Là con vật thân thuộc được nuôi nhiều nhằm cung cấp
thịt mỡ cho nhu cầu của con người. Giống lợn địa phương có những ưu điểm nổi bật
như rất phù hợp với điều kiện tự nhiên miền núi phía Bắc, điều kiện canh tác của
nhân dân miền núi, khả năng chịu đựng kham khổ cao, thích hợp với phương thức
chăn nuôi chăn thả. Thịt và mỡ lợn thơm ngon, được người dân ưa chuộng (Đặc biệt
nhóm lợn đen tuyền đang được coi là hàng đặc sản). Tuy nhiên, lợn cũng có nhiều
nhược điểm như kết cấu ngoại hình xấu, lưng võng, bụng xệ, tầm vóc nhỏ, đẻ ít con,
sinh trưởng chậm. Mặc dù có một số nhược điểm như vậy, nhưng đây vẫn là con vật
được người dân địa phương ưa chuộng và nuôi nhiều. Do một số quan niệm chưa
khoa học của người dân trong công tác chọn giống và chăm sóc nuôi dưỡng, cùng
với xu thế phát triển hiện nay, với trào lưu phát triển của các giống lợn nhập nội có
năng xuất cao đã tạo ra các giống lợn lai với ưu thế hơn hẳn thì các giống lợn bản
địa có xu hướng bị thu hẹp dần . Đặc biệt với nhóm lợn đen tuyền của giống lợn bản
địa nuôi tại Pác Nặm, do những đặc điểm ưu việt về chất lượng thịt được người tiêu
dùng ưa chuộng cho nên có nguy cơ tuyệt chủng đang dần hiện hữu. Vì vậy chúng
ta cần tìm ra các biện pháp bảo tồn và phát triển các giống lợn địa phương.
Đặc điểm của giống lợn địa phương Pác Nặm: Dựa vào màu sắc lông, da có thể
chia làm 3 nhóm như sau: [21]
* Nhóm đen tuyền:

các liên kết hydrogen hình thành giữa các base bổ sung nằm trên hai chuỗi: A bổ sung
cho T và C bổ sung cho G. Mỗi chuỗi đơn có một trình tự định hướng với một đầu
15
16
5’phosphate tự do, đầu kia là 3’ hydroxyl tự do (quy ước là 5’ → 3’. Hướng của hai chuỗi
đơn trong chuỗi xoắn kép ngược nhau, nên được gọi là hai chuỗi đối song [10].
Một đặc điểm của phân tử DNA có ý nghĩa rất quan trọng được sử dụng vào
phương pháp lai phân tử. Đó là khả năng biến tính và hồi tính. Biến tính là hiện
tượng hai sợi đơn của phân tử DNA tách rời nhau khi các liên kết hydrogen giữa các
base bổ sung nằm trên hai sợi bị đứt do các tác nhân hóa học (dung dịch kiềm,
formamide, urea) hay do tác nhân vật lý (nhiệt). Sau đó, nếu điều chỉnh nhiệt độ và
nồng độ muối thích hợp, các sợi đơn có thể bắt cặp trở lại theo nguyên tắc bổ sung,
để hình thành phân tử DNA ban đầu, đó là sự hồi tính [3].
1.2.2. Tổng hợp DNA in vitro
Phần lớn những hiểu biết về các quá trình hóa sinh tham gia vào việc tổng hợp
DNA là bắt nguồn từ công trình của A. Kornberg và đồng nghiệp năm 1950. Theo
Kornberg những chất cần thiết cho quá trình tổng hợp DNA trong ống nghiệm
(invitro) là:
1. Hỗn hợp của tất cả bốn deoxyribonucleotit 5' - triphosphat
2. Các ion Mg
2+
3. Enzym DNA - polymerase tinh sạch chiết xuất từ E.coli
4. DNA có trọng lượng phân tử cao
Trong những thí nghiệm đầu tiên Kornberg đã nhận ra được số lượng DNA
lớn gấp khoảng 20 lần số lượng DNA đưa vào. Phản ứng tiếp diễn cho đến khi
hết một trong các tiền chất 5' - triphosphat, mặc dù chất quan trọng đối với
phản ứng là Enzym DNA - polymerase có tác dụng hình thành mối liên kết
phosphodiester. Lúc đầu người cho rằng DNA phân tử lượng cao có thể thực
hiện 2 chức năng trong phản ứng: một là làm chất mồi (primer) nghĩa là đóng
vai trò như đỉnh sinh trưởng để bổ sung các nucleotit mới, hai là đóng vai trò

nhiễm sắc thể và xác định một tính trạng nhất định. Các gen là những đoạn vật
chất di truyền mã hóa cho những sản phẩm riêng lẻ như các RNA được sử dụng
trực tiếp hoặc cho tổng hợp các enzym, các protein cấu trúc hay các mạch
polypeptide để gắn lại tạo ra các protein có hoạt tính sinh học" [31].
1.2.4. Các chỉ thị di truyền (genetic marker)
17
18
Trong nhiều thập kỷ qua, ứng dụng các phương pháp chọn lọc dựa trên khoa học
về di truyền quần thể và khoa học thống kê đã cho phép tạo ra vật nuôi có hiệu suất tăng
trưởng cao. Các kết quả dựa trên chọn lọc kiều hình với một tính trạng kinh tế quan trọng
ở gia súc, gia cầm đã đạt được nhiều thành tựu đáng kể. Tuy nhiên, theo thời gian những
hạn chế của phương pháp này trong việc cải thiện tính di truyền vật nuôi đã trở nên rõ
ràng. Hiệu quả của chúng giảm khi các tính trạng mong muốn khó định lượng, khả năng
di truyền thấp (ví dụ như tính kháng bệnh). Thêm vào đó, việc chọn lọc nói chung chỉ
hạn chế các đặc tính có thể đo lường một cách phù hợp ở một số lượng lớn các mẫu. Một
vài đặc tính như: tỷ lệ sống sót, năng suất trứng… lại biểu hiện rất muộn trong quá trình
sống nên khó có thể dùng làm tiêu chí có ích trong chọn lọc. Ngoài ra hiệu quả chọn lọc
dựa trên kiểu hình thường không cao khi mục tiêu chọn lọc có tương quan di truyền
không phù hợp (ví dụ như năng suất sữa và hàm lượng protein của sữa), sự tương tác át
chế của gen) và giữa các gen với môi trường cũng rất phức tạp, do đó khó có thể xác
định một cách chính xác nếu chỉ dựa trên kiểu hình và phả hệ [41].
Sự phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử đã mở ra khả năng xác định và sử
dụng các biến dị hệ gen cho việc nâng cao tính di truyền của giống vật nuôi. Đặc
biệt sự ra đời của các chỉ thị di truyền (các trình tự đánh dấu trên bộ gen liên kết với
các tính trạng cần quan tâm) có thể giúp giải quyết những hạn chế của các phương
pháp trên.
Hệ thống các chỉ thị phân tử chính đang được sử dụng để nghiên cứu di truyền
ở động vật có thể kể đến: RELP, RAPD, AFLP, Microsatellites… Trong nghiên cứu,
các chỉ thị này được sử dụng vào nhiều mục đích:
* Dùng để đánh giá mức độ biến động di truyền trong một quần thể vật nuôi.

khả năng kháng bệnh…
Nghiên cứu đa hình gen (DNA) vật nuôi và xác định sự liên quan của nó với
các tính trạng có ý nghĩa kinh tế nhằm tìm các chỉ thị di truyền hỗ trợ cho công tác
chọn giống rất có ý cả trong khoa học lẫn thực tiễn.
19
20
Sử dụng các phương pháp phân tích đa hình có thể xác định các chỉ thị di
truyền ở mức độ sinh hoá (như: Sự đa hình nhóm máu, đa hình protein/enzyme
hoặc hệ thống kháng nguyên) hoặc ở mức độ DNA (lai ghép DNA-DNA, phân
tích đa hình bằng enzyme giới hạn (RFLP) với DNA nhân hoặc DNA ty thể,
khuếch đại ngẫu nhiên đa hình DNA (RAPD), khuếch đại đa hình chiều dài các
đoạn gen nhân có chọn lọc (AFLP), đa hình các trình tự lặp lại đơn giản:
minisatellites, microsatellie (MS), SNP - đa hình nucleotide đơn…).
Mỗi phương pháp đều có những ưu nhược điểm nhất định. Nhìn chung, chúng
đều dựa vào sự khác biệt về chiều dài các đoạn giới hạn (do đột biến làm mất hay
thêm một vị trí nhận biết của enzyme giới hạn) hoặc số lượng các trình tự lặp lại tại
một vùng trên bộ gen giữa các cá thể khác nhau.
* Phương pháp phân tích đa hình các đoạn cắt bằng enzyme giới hạn (Polymerase
Chain Reaction - Restriction Fragment Lenghth Polymorphism = PCR-RFLP).
- Nguyên lý của phương pháp này là nhờ PCR (Polymerase Chain Reaction) để
khuếch đại đoạn gen cần nghiên cứu bằng các đoạn mồi chuyên biệt, sau đó dùng
enzyme giới hạn để cắt đoạn gen đó tại các điểm đột biến nhất định để từ đó xác định
sự có mặt hay không của điểm đột biến đó tương ứng với sự có mặt hay không của các
allele tương ứng với các đột biến đó trong đoạn gen mà ta quan tâm nghiên cứu. Từ đó
xác định tần số tương đối của các allele cũng như gen đó có đa hình hay không…
* Phương pháp phân tích đa hình chiều dài các đoạn DNA được khuếch đại
(Amplified Fragment Lenghth Polymorphisms = AFLP).
AFLP cũng là một trong những kỹ thuật phân tích đa hình được sử dụng khá phổ
biến. Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc của PCR nhưng đoạn mồi được thiết kế theo trình
tự của những đoạn DNA đã biết, do đó sản phẩm nhân có độ đặc hiệu cao. Winimers và

Hiện nay, việc sử dụng các chỉ thị di truyền để phát hiện những vùng trong bộ
gen liên quan đến tính trạng số lượng được ứng dụng rộng rãi, đặc biệt chúng còn được
sử dụng vào việc xác định dấu vết di truyền, hình thành các bản đồ liên kết (linkage
map) hay bản đồ các locus tính trạng số lượng (QTL mapping) với vị trí các gen mã
hoá cho các tính trạng mong muốn, nhằm đáp ứng nhanh và hiệu quả việc chọn lọc
phục vụ cho các chiến lược lai tạo và chọn giống theo phương pháp cổ điển.
Việc phát triển các chỉ thị di truyền phân tử nói chung đều đòi hỏi trình độ kỹ
thuật cao song có nhiều những ưu điểm: Nó cho phép sử dụng nguồn gèn mà không
21
22
làm ảnh hưởng đến sự điều hoà và biểu hiện tự nhiên của gen; chỉ cần một lượng rất
nhỏ chứa rất ít vật liệu di truyền vẫn có thể cho kết quả nhanh và chính xác. Do vậy,
thời gian vừa qua số lượng gen và chỉ thị di truyền trên bản độ di truyền của lợn đã
không ngừng được gia tăng.
1.3. Cơ sở lý luận về phương pháp nghiên cứu
1.3.1. Phương pháp tách DNA
DNA là phân tử có kích thước lớn, do đó trong thao tác cần tránh mọi tác nhân
cơ học hay hóa học quá mạnh có thể làm đứt gãy phân tử này. Có nhiều phương
pháp tách chiết DNA tế bào [3]. Nói chung các phương pháp tách chiết cơ bản đó
đều được tiến hành theo ba bước:
Bước 1: Phá vỡ màng tế bào và màng nhân (tế bào Eukaryote).
Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các
protein.
Bước 3: Kết tủa DNA, mục đích của việc kết tủa là nhằm thu nhận DNA dưới
dạng cô đặc, một phần nhằm bảo vệ chúng ra khỏi sự phân hủy các enzym, mặt
khác có thể hòa tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn.
1.3.2. Phương pháp nhân đoạn DNA đặc hiệu (phản ứng PCR)
1.3.2.1. Phản ứng PCR cho phép nhân các đoạn DNA định trước
Kỹ thuật nhân đoạn DNA đặc hiệu, hay còn gọi là kỹ thuật PCR (Polymerase
Chain Reaction) được Kary Mullis hoàn thiện vào giữa những năm 80 và được xem là

o
C
trong vòng 30 giây - 1 phút để hai mạch ADN sợi kép tách nhau ra thành hai mạch
đơn, làm khuôn cho quá trình tổng hợp.
- Bước 2 (bắt cặp mồi) : nhiệt độ được hạ thấp cho phép các mồi bắt cặp với
khuôn; trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40-70
o
C và kéo dài
30 giây - 1 phút.
- Bước 3 (sinh tổng hợp) : nhiệt độ được nâng lên 72
o
C đây là nhiệt độ thích
hợp cho enzym DNA polymerase hoạt động tiếp tục lắp ghép các nucleotit bổ sung
với mạch khuôn kéo dài sợi DNA mới.
Một chu kỳ bao gồm ba bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, mỗi lần
lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước. Đây là sự khuyếch đại theo cấp số
nhân, theo tính toán sau 30 chu kỳ sự khuyếch đại sẽ là 10
6
so với số lượng bản
mẫu ban đầu [19].
23
24
1.3.3. Enzym giới hạn
Hiện tượng giới hạn và enzyme giới hạn do Hamilton Smith và cộng sự phát
hiện đầu tiên (1970) ở vi khuẩn Hemophilus influezae. Bình thường tế bào vi khuẩn
bị nhiễm phage thường bị phage phá hủy. Một số vi khuẩn khi bị nhiễm phage,
không bị phage phá hủy mà có khả năng phân hủy DNA phage, nhờ một số loại
enzym đặc hiệu có trong tế bào vi khuẩn. Các loại enzym trong tế bào vi khuẩn có
thể cắt DNA phage ở những vị trí nhất định thành những đoạn ngắn, những enzym
này được gọi là enzym giới hạn [42].

3’ TCGA 5’
5’ AG CT 3’
3 TC GA 5’
Properdine/SmaI
Vi khuẩn
Serratia
marcescens
5’ CCCGGG 3’
3’ GGGCCC 5’
5’ CCC GGG 3’
3’ GGG CCC 5’
1.3.5. Điện di trên gel agarose
Điện di là một phương pháp được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu cấu trúc và
đặc điểm sinh học của phân tử mang điện tích (DNA, Protein v.v ). Nguyên lý chung
của phương pháp điện di là dựa vào điện tích âm của DNA trong môi trường có điện
trường. Sở dĩ DNA mang điện tích âm là nhờ các nhóm photphat nằm trên khung
phosphodiester của chúng. Các phân tử DNA có kích thước khác nhau sẽ di chuyển từ
cực âm sang cực dương với tốc độ khác nhau [19].
Kiểu gel dùng trong điện di có tác dụng rất quan trọng đối với mức độ phân
tách các phân tử. Có hai loại gel được dùng phổ biến là Agarose và Polyacrylamid
và trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng gel Agarose.
Agarose là phân tử polymer được tách chiết từ rong biển, cấu tạo bởi 2 monome là
D-galactoza và 3,6 - anhydroL-galacoza nên sau khi đun sôi sẽ tạo thành mạng lưới cho
phép các phân tử khác nhau đi qua tùy theo kích thước và trọng lượng của phân tử.
Agarose nóng chảy ở nhiệt độ 90-100
0
C và ở nhiệt độ bình thường trong phòng thí
nghiệm thì Agarose bị đông đặc lại. Dựa vào tính chất này của gel agarose mà ta có thể
lựa chọn nhiệt độ thích hợp với từng nồng độ của gel để có thể điện di được các phân tử
có khối lượng phân tử khác nhau.