CÔNG NGHỆ PROTEIN-ENZYM
THU NHẬN ENZYME PEPSIN TỪ NỘI TẠNG
THU NHẬN ENZYME PEPSIN TỪ NỘI TẠNGĐỘNG VẬT
ĐỘNG VẬT
–A2T –
I ) TỔNG QUAN
1) Nguyên liệu: Dạ dày heo
a) Cấu trúc và chức năng của dạ dày
Cấu trúc: dạ dày là một đoạn phình ra của ống tiêu hoá có tác dụng: chứa thức ăn,
nhào trộn thức ăn để thấm dịch vị. Thức ăn sẽ chịu sự tiêu hoá của các enzyme tiêu hóa
chứa trong dịch vị, chuẩn bị cho giai đoạn chính tiêu hoá ở ruột non.
Các tuyến chính của dạ dày:
- Tế bào niêm dịch bài tiết chất nhày
- Tế bào chính bài tiết pepsinogen, rennin, gelatinase
- Tế bào viền bài tiết HCl
- Tế bào bài tiết gastrin.
Dạ dày sản xuất pepsin , một enzyme chuyên phân huỷ protein. Sự phân huỷ cơ
chất làm giảm độ acid trong dạ dày: làm thay đổi mạnh pH trong dạ dày, và nhờ hoạt
động phân huỷ protein của pepsin, khối lượng thức ăn giảm và khả năng tiêu hoá protein
tăng lên.
Pepsin phân bố trên những phần khác nhau của dạ dày và ở dạng tiền pepsin
(pepsinogen). Pepsinogen tập trung chủ yếu ở phần đáy mỏng của dạ dày, chiếm đến
75%.
b) Niêm mạc dạ dày – dịch vị dạ dày
LỚP 06SH1D 1
CÔNG NGHỆ PROTEIN-ENZYM
Niêm mạc dạ dày: là lớp màng nhầy bên trong cùng của dạ dày. Trong niêm mạc
có những ống bài tiết những chất khác nhau, người ta chia dạ dày ra thành từng vùng:

mạch nhánh không phân cực là lớn, làm cho enzyme dễ tan trong rượu etylic nồng độ cao
và trong các hỗn hợp chứa nhiều dung môi phân cực.
Tên amino acid A B Tên aminoacid A B
Cystin
Cystein
Methionin
Arginin
Histidin
Lysin
Acid Aspartic
Acid glutamic
Serin
Threonin
1,64
0,50
0,70
1,00
0,90
0,90
16,00
11,90
12,20
9,60
4
2
4
2
2
2
41

A-số gram amino acid trong 100g pepsin.
B-số gốc amino acid trong một phân tử pepsin.
d)Thành phần và cấu tạo:
Do đặc điểm về thành phần amino acid, pepsin tinh khiết mang điện tích âm ngay
cả trong môi trường HCL 0,1 N( theo Herriot, 1940).
Pepsin đựơc tạo thành từ màng nhầy và ở các phần khác của dạ dày thì tạo các
dạng pepsin khác nhau: pepsin A,B, C, D và các pepsinogen tương ứng. Trọng lượng
phân tử của pepsin là 34,500 Dalton. Pepsin của heo lớn hơn một chút khoảng 35000
Dalton.
3) Đặc tính enzyme pepsin:
Chế phẩm enzyme tồn tại ở dạng bột vô định hình, trắng hay vàng nhạt hay mảnh
nhỏ, trong hay hơi đặc, mùi đặc biệt giống mùi nước thịt, vị hơi chua, nếu thêm lactose,
glucose hay saccharose thì có vị ngọt ( dược điển Việt Nam).
Pepsin dễ hút ẩm, tan trong nước cho một dung dịch đục lờ, không tan trong cồn
95
0
, ester, chloroform. Pepsin ở cả 2 dạng: kết tinh và thô. Điểm đẳng đĩện của pepsin ở
gần pH=1.
LỚP 06SH1D 3
CÔNG NGHỆ PROTEIN-ENZYM
Pepsin thuỷ phân protein trong vùng acid khá rộng từ 1-4. pH hoạt động tối ưu
của pepin thay đổi tuỳ theo bản chất và trạng thái của cơ chất thường pH trong khoảng từ
1,8-2,2. Pepsin bền nhất ở pH trong khoảng từ 4-5, nhưng trong vùng pH này hoạt lực
của enzyme có phần thay đổi giảm đi. Từ pH =5,5 trở lên, pepsin không hoạt động. Khả
năng hoà tan của pepsin tuỳ thuộc vào độ tinh khiết.
Quá trình dự trữ pepsin:
- Pepsinogen ổn định 12-18 tháng ở 2-8
0
C
-Pepsin ổn định 1-2 năm ở 2-8

giải quyết vấn đề này, pepsin và nhiều enzyme phân cắt khác nhau được tạo ra ở dạng bất
hoạt “proenzyme” mà nó có thể được hoạt động an toàn bên ngoài tế bào.
Sơ đồ sự họat hóa pepsinogen thành pepsin
-Pepsin được tiết ra dưới dạng tiền pepsin, tức là pepsinogen bất hoạt. Khi tiếp
xúc với môi trường acid tự nhiên của bao tử hoặc chính pepsin. Quá trình hoạt hóa
pepsinogen là quá trình thuỷ phân liên kết peptide giữa acid glutamic 41 và izoleucin 42,
giải phóng peptide kìm hãm, thành phần amino acid của peptide kìm hãm này tương ứng
với 41 amino acid của pepsinogen và phản ứng bởi ion H
+
và cũng chính bởi pepsin.
-Pepsin được tạo thành lại tiếp tục xúc tác qúa trình giải phóng peptide kìm hãm,
chuyển pepsinogen thành pepsin hoạt động. Vì vậy quá trình này mang tính chất của một
quá trình tự xúc tác. Sự hoạt hóa pepsinogen chỉ xảy ra trong môi trường acid có pH<5,6,
Khi pH>5,6, peptide kìm hãm lại có thể kết hợp thuận nghịch với pepsin tạo thành phức
hợp không hoạt động.
Toàn bộ quá trình tạo thành pepsin từ pepsinogen có thể biểu diễn như sau:
pepsin
Pepsinogen phức hợp > pepsin- chất ức chế+ 5 peptide
pH=4,5
Phức hợp pepsin- chất ức chế < > pepsin + chất ức chế
pH=5,4
Chất ức chế > 4 peptide
5)Những yếu tố ảnh hưởng đến họat tính của pepsin:
LỚP 06SH1D 5
CÔNG NGHỆ PROTEIN-ENZYM
 Ảnh hưởng của pH:
-Pepsin là một protease acid điển hình, họat động ở vùng pH acid từ 1-4, pH thích
hợp của pepsin khỏang 1,5-2,4. Đối với mỗi cơ chất thì pH thích hợp có thể thay đổi.
-Pepsin bền vững ở vùng pH rất acid, nó có độ bền tối đa ở pH=4-5 nhưng trong
vùng pH này thì họat lực của enzyme rất thấp. Từ pH >5,5 pepsin không họat động vì

không ảnh hưởng đáng kể đến pepsin. Nhưng khi với liều cao, chúng sẽ làm giảm họat
tính của pepsin.
 Ảnh hưởng của các chất kìm hãm:
Tất cả các chất gây biến tính protein đều là những chất kìm hãm không đặc hiệu
của enzyme nói chung và pepsin nói riêng. Ngoài ra, có nhiều chất không làm biến tính
LỚP 06SH1D 6
CÔNG NGHỆ PROTEIN-ENZYM
protein enzyme nhưng vẫn làm giảm họat độ xúc tác do cơ chế kìm hãm cạnh tranh và
kìm hãm không cạnh tranh…
II ) CÁC PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN ENZYME PEPSIN:
Bản chất của quá trình chiết tách pepsin từ màng nhày dạ dày là sự phối hợp của
ba quá trình: phá vỡ tế bào, họat hóa và chiết tách enzyme.
Qui trình công nghệ sản xuất enzyme pepsin:
LỚP 06SH1D 7
CÔNG NGHỆ PROTEIN-ENZYM
LỚP 06SH1D 8
Dạ dày
Xử lý sơ bộ
Lọc
Ly tâm
10-15 phút
Tinh sạch
Bảo quản
Sấy khô
Pepsi
n
B
ã
Kết tủa
Trích ly

5) Kết tủa enzyme:
Có 2 phương pháp:
• Phương pháp tủa bằng muối (diêm tích):
Sử dụng NaCl có nồng độ bão hoà 25% để làm tủa pepsin. Cho muối từ từ, khuấy nhẹ
cho đến khi dung dịch bão hòa, để yên dịch thủy phân 30 phút.
• Phương pháp tủa bằng cồn hay dung môi hữu cơ:
Trong quá trình kết tủa bằng dung môi hữu cơ tạo ra một nhiệt lượng lớn, có thể
làm mất họat tính của enzym. Do đó dung dịch sau tự phân đã lọc cùng dung môi được
làm lạnh trước khi sử dụng và dung môi phải được cho từ từ và khuấy liên tục để tránh sự
tăng nhiệt độ cục bộ bên trong hỗn hợp. Thời gian 5-10 phút, trong lúc đó nhiệt độ không
quá 5
0
C.
LỚP 06SH1D 9
CÔNG NGHỆ PROTEIN-ENZYM
6) Ly tâm:
Hỗn hợp dung dịch sau khi để yên đem ly tâm 10-15 phút với tốc độ 5000-6000
vòng/phút.
7) Tinh sạch:
Phương pháp qua lọc gel sephadex: ta dùng gel sephadex G-100
Nguyên tắc:
Khi cho một dung dịch chứa nhiều chất có phân tử lượng khác nhau chạy qua cột
chứa các hạt gel sephadex đã trương nở thì xảy ra quá trình tách những phân tử có kích
thước và trọng lượng khác nhau. Những chất có phân tử lượng nhỏ sẽ lọt vào bên trong lỗ
gel do đó sẽ di chuyển chậm qua cột. Các chất có phân tử lượng lớn hơn sẽ di chuyển bên
ngoài hạt gel nên sẽ chuyển nhanh và giải phóng ra khỏi cột trước. Sau đó, chất có phân
tử lượng nhỏ sẽ lần lượt đi ra theo mức độ phân tử lượng của chúng. Kết quả là tách được
các chất có phân tử lượng khác nhau thành các phân đoạn theo trình tự: các phân đoạn có
trọng lượng phân tử lớn ra trước, các phân đoạn có trọng lượng phân tử nhỏ ra sau.
8) Sấy đông khô:

H
ngandaday
ayenzymesaus
H: hiệu suất thu hồi enzyme (%).
m
enzymesausấy
: khối lượng enzyme thu được sau khi sấy đông khô (g)
m
ngăndạdày
: khối lượng ngăn dạ dày chứa enzyme đang khảo sát (g)
III.ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG CHẾ PHẨM ENZYME
1. Khảo sát hàm lượng protein theo phương pháp Bradford:
• Nguyên tắc:
Phương pháp này dựa vào sự đổi màu khi cho Coomassie Brilliant Blue-G250
liên kết với protein trong môi trường acid. Thuốc nhuộm này sẽ tạo với protein, tương tác
với các nhóm kỵ nước và các nhóm mang điện dương trên phân tử protein thành một
phức chất màu xanh, có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 595nm. Cường độ màu này tỉ lệ
thuận với hàm lượng protein, nên bằng phương pháp so màu có thể xác định được lượng
protein.
Ưu điểm: đây là phương pháp có độ nhạy cao, chình xác vài μg, hoá chất đơn
giản, ít tốn kém.
Xác định hàm lượng protein có trong mẫu:
10
3
−
××
−∆
=
V
F

: khối lượng enzyme pha ra dạng dịch (mg)
m
enzyme
: khối lượng enzyme thu được sau khi sấy đông khô (g)
P
t
: hàm lượng protein tổng trong mẫu enzyme (mg protein)
2. Khảo sát hoạt lực đông tụ sữa của enzyme:
Protease ngoài khả năng thuỷ phân protein đều có khả năng đông tụ sữa tuỳ mức
độ khác nhau, mạnh nhất là rennin, sau đó là pepsin và các protease khác. Quá trình đông
tụ sữa được ứng dụng trong sản xuất phomai.
• Nguyên tắc:
Xác định hoạt độ đông tụ sữa dựa vào thời gian cần thiết để làm đông tụ một thể
tích dung dịch sữa có nồng độ xác định.
Hoạt lực đông tụ sữa của enzyme trong 1mL
FE
VT
V
E
S
×=
×
(UI/mL)
Tổng hoạt lực đông tụ sữa
10
3−
×××=
m
m
V

: thể tích mẫu dịch enzyme (mL)
m
mau
: khối lượng enzyme pha ra dạng dịch (mg)
m
enzyme
: khối lượng enzyme thu được sau khi sấy đông khô (g)
P
t
: hàm lượng protein tổng trong mẫu enzyme (mg protein)
3. Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Anson cải tiến
Mục đích: khảo sát hoạt lực proteolytic để biết được khả năng thủy phân liên kết peptide.
LỚP 06SH1D 12
CÔNG NGHỆ PROTEIN-ENZYM
Nguyên tắc: Cho protease tác dụng với cơ chất casein hoặc hemoglobin, sau đó kết tủa
protein dư thừa bằng TCA, xác định sản phẩm được tạo thành bằng phản ứng màu với
thuốc thử Folin-Ciocalteu. Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng tyrosin tương ứng với sản
phẩm thủy phân dưới tác dụng của enzyme.
Hoạt lực proteolytic của enzyme trong 1mL
t
Vmoltyro
PU
H
×
=
sin
µ
(UI/mL)
Tổng hoạt lực proteolytic của mẫu enzyme
10

: thể tích mẫu dịch enzyme (mL)
m
mau
: khối lượng enzyme pha ra dạng dịch (mg)
m
enzyme
: khối lượng enzyme thu được sau khi sấy đông khô (g)
H
R
: hoạt lực proteolytic riêng của enzyme (mg protein)
IV ) ỨNG DỤNG:
Enzyme pepsin được sản xuất nhiều ở hãng Anex R-Werner Đức và Orthana Đan Mạch.
* Ứng dụng của enzym pepsin trong thực phẩm:
- Trong chế biến sữa:Enzyme pepsin thường được sử dụng chung với rennet trong
sản xuất phô mai.
-Trong chế biến thịt: Enzyme pepsin được dùng để làm mềm thịt vì nó thủy phân
colagen một lọai protein có trong thịt.
* Ứng dụng của enzym pepsin trong y học:
- Enzym pepsin thường được sử dụng làm thuốc trợ tiêu hóa giúp chữa các bệnh kém
tiêu hóa ở người. Đây là một vài hình ảnh về một số lọai thuốc trợ tiêu hóa có mặt trên thị
trường hiện nay.
LỚP 06SH1D 13
CÔNG NGHỆ PROTEIN-ENZYM.

LỚP 06SH1D 14
CÔNG NGHỆ PROTEIN-ENZYM
LỚP 06SH1D 15