4/01/2013
1
BÀI 4
CÁC QUI TRÌNH KIỂM TRA VI
SINH VẬT TRUYỀN THỐNG VÀ
PHI TRUYỀN THỐNG
Lớp phân tích vi sinh
GV: ThS. Nguyễn Thành Luân
[email protected]

Phƣơng pháp định lƣợng vi sinh vật
(Nhắc lại)
Sự hiện diện của vi sinh vật có thể được
định lượng bằng nhiều phương pháp
 Trực tiếp như đếm trên kính hiển vi
 Gián tiếp thông qua:
 Phương pháp đo độ đục
 Đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường xác
định
 Định lượng một cách thống kê bằng phương
pháp pha loãng tới hạn (MPN).
4/01/2013
2
Phƣơng pháp đếm trực tiếp
• Ƣu điểm: Quy trình này cho phép xác định nhanh
chóng mật độ vi sinh vật chứa trong mẫu.
• Nhƣợc điểm:
- Không phân biệt được tế bào sống và tế
bào chết
- Dễ nhầm lẫn tế bào vi sinh vật với các vật
thể khác trong mẫu

 Là phương pháp định lượng vi sinh vật theo xác
suất lớn nhất hiện diện trong 1 đơn vị thể tích
mẫu
 Là phương pháp định lượng dựa trên kết quả
định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại
Thông thường là lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng
bậc 10 liên tiếp.
 Số lượng ống nghiệm lặp lại càng cao thì độ
chính xác của phương pháp này càng lớn.
Phƣơng pháp đo độ đục
• Là phương pháp gián tiếp xác định mật độ vi sinh
vật.

• Định lượng mật độ tế bào thông qua đo độ đục
bằng máy so màu ở các bước sóng từ 550 – 610
nm.

• Phương pháp xác định mật độ tế bào theo độ đục
có thể được dùng để so sánh mức độ tăng
trưởng của hai hay nhiều chủng vi sinh vật trong
môi trường lỏng
4/01/2013
5

CÁC THỬ NGHIỆM SINH HÓA
• Phân lập khuẩn lạc thuần khiết là cần thiết
cho định danh VSV
• Việc định danh dựa chủ yếu vào đặc điểm
kiểu hình đặc biệt là các phản ứng sinh hóa.
• Có 3 cách sử dụng các thử nghiệm sinh hóa


Cao
thịt
1g

Phenol red

(7,2ml của dung dịch phenol red 0,25%)

0,018g

Carbohydrate
*

1
g
Hấp ở 115
o
C trong 15 phút
Thử nghiệm khả năng lên men
• Môi trường: Phenolred broth
base bổ sung 0,5-1% đường
cần thử nghiệm
• VSV sử dụng được nguồn
đường trong môi trường sẽ
làm giảm pH  thay đổi màu
chất chỉ thị phenolred
• Phản ứng (+): môi trường
chuyển vàng
• Phản ứng (-): môi trường có

• Chú ý
- Cấy lượng sinh khối vừa đủ
- Có đối chứng trắng (BLANK) đi kèm

Đối chứng trắng
Pứ âm tính Pứ dương tính
Thử nghiệm Urease
• Mục đích: phát hiện VSV có mang enzym urease
• Cơ sở sinh hoá:
(NH
2
)
2
CO + H
2
O  2 NH
3
+ CO
2

 tăng pH môi trường  đỏ phenol (vàng – đỏ)
• Môi trường sử dụng:
• Urea Broth (Rustigian – Stuart)
• Christensen Urea (môi trường thạch nghiêng)
4/01/2013
10
Môi trƣờng Urea Broth
Urea

20g

trường
• ủ 37
o
C/24 giờ
• Quan sát
Thử nghiệm Urease
4/01/2013
11
Thử nghiệm khả năng sinh H
2
S
• Mục đích: phát hiện khả năng sinh H
2
S

• Cơ sở sinh hóa:

Acid amin chứa S H
2
S

Thiosulfate H
2
S

 H
2
S sinh ra được nhận biết bởi ion sắt, chì tạo kết tủa màu đen
(FeS, PbS)
desulfohydrase

2
S
(+)
(+)
(-)
Pancreatic digest of
casein (casitone)

20.0 g
Peptic digest of animal
tissue (beef extract)

6.1 g
Ferrous ammonium
sulfate

0.2 g
Sodium thiosulfate

0.2 g
Agar

3.5 g
4/01/2013
13
Thử nghiệm khả năng sinh Indol
• Mục đích
Phát hiện các VSV có khả năng sinh indol  các VSV có hệ emzym
tryptophanase
Chủng VSV MT canh trypton


rettgeri
(-)
Serratia

marcescens
4/01/2013
14
Thử nghiệm KIA/TSI
• KIA: Kligler iron agar (trang 99)
Pepton 20g
Lactose 20g
Glucose 1g
NaCl 5g
Feric ammonium citrate 0,5g
Sodium thiosulphate 0,5g
Agar 15g
Phenol red 0,025g
Nước cất 1 lít
pH 7,4±0,2
Thử nghiệm KIA/TSI
• TSI: Triple sugar iron agar (trang 106)
Pepton 20g
Lactose 10g
Sucrose 10g
Glucose 1g
NaCl 5g
Feric ammonium sulphate o,2g
Sodium thiosulphate 0,2g
Agar 13g
• MR (+) – càng kéo dài thời gian nuôi cấy – môi trường
càng acid
• MR (-) – càng kéo dài thời gian nuôi cấy – các chất có
tính acid bị chuyển hóa – môi trường dần trung tính
 Thời gian ủ 2 – 5 ngày ở 37
o
C

dưới 4,4 5,0 – 5,8 trên 6,0
Thử nghiệm MR (Methyl red)
 Môi trường: Glucose Phosphate (MR-VP broth)
Chủng VSV
ủ 2 – 5 ngày
37
o
C
Pứ âm tính
Pứ dương tính
ĐC
MR-VP broth
4/01/2013
17
Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer)
• Mục đích: Phát hiện vsv tạo sản phẩm trung tính (acetoin)
trong quá trình lên men glucose
• Cở sở sinh hóa: Acetoin được tạo ra trong điều kiện yếm
khí hoàn toàn.
2 pyruvate acetoin + 2 CO

với Fe
2+
tạo thành phức hợp màu đen
Môi trường Bile Esculine Agar
Beef extract 3g
Pepton 5g
Esculin 1g
Mật bò (Oxgall) 40g
Ferric citrate 0,5g
Agar 15g
Nước cất 1 lít
4/01/2013
20
Glucose
Esculetine
Phân tử Esculine
Sự phân giải Esculine thành Glucose và Esculetine
Thử nghiệm Bile Esculin
4/01/2013
21
Khuẩn lạc Enterococcus faecalis cho kết quả BEA (+)
Thử nghiệm Malonate
• Mục đích
Phát hiện các VSV có khả năng sử dụng
malonate như nguồn carbon duy nhất
• Cơ sở sinh hoá
Malonate là chất cạnh tranh với succinate
Khi VSV phân hủy được malonate thì cũng
phân huỷ được các nguồn đạm vô cơ khác 
tạo thành sp kiềm  làm tăng pH môi trường

4/01/2013
23
Thử nghiệm catalase
• Thực hiện
• VSV lấy từ môi trường nuôi cấy (lỏng, rắn)
• Đặt VSV lên lam kính sạch
• Nhỏ H
2
O
2
30%
• Quan sát sau 1-2 giây
• Phản ứng (+): có bọt khí xuất hiện
• Phản ứng (-): không có bọt khí xuất hiện
Thử nghiệm catalase
4/01/2013
24
Thử nghiệm catalase
Thử nghiệm catalase trên đĩa petri: sử dụng H
2
O
2
30%
Thử nghiệm decarboxylase
• Mục đích: xác định khả năng tạo enzyme decarboxylase xúc tác
phân cắt nhóm carboxyl ở một số acid amin
Cấu trúc của phân tử
Amino acid
4/01/2013
25