CÔNG NGHỆ TẾ BÀO

GVHD: TS LÊ THỊ THUỶ TIÊN Trang 1

Trường Đại Học Bách Khoa Tp. HCM
KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO TIỂU LUẬN
CÔNG NGHỆ TẾ BÀO

Đề tài: Cải tạo giống cây trồng bằng phương pháp nuôi
cấy và dung hợp tế bào trần.

GVHD: TS LÊ THỊ THUỶ TIÊN
SVTH: MSSV
1. NGUYỄN HOÀNG ANH 60800048
2. NGUYỄN THIÊN ANH DŨNG 60800353

Tp. HCM Ngày 8 Tháng 6 Năm 2011
CÔNG NGHỆ TẾ BÀO

GVHD: TS LÊ THỊ THUỶ TIÊN Trang 2
1.1. Đặt vấn đề:
Màng nguyên sinh chất cho phép các tế bào trần có thể hấp thu các tế bào đại
phân tử (nucleic acid, protein), thậm chí cả các cơ quan tử như lục lạp, ty thể, nhân
bào…theo cơ chế của amip.
Nếu để các tế bào trần cạnh nhau, chúng có thể dễ dàng hòa làm một. Đây là
hiện tượng dung hợp (protoplast fusion) hay còn gọi là lai vô tính tế bào (cell
somatic hybridization). Khi 2 hoặc nhiều tế bào trần dung hợp ngẫu nhiên sẽ tạo
một khối tế bào trần, trong đó nhân của chúng có thể kết hợp hoặc tồn tại riêng rẽ.
Nếu hai nhân khác nhau sẽ tạo ra thể lai dị nhân ngược lại có thể lai đồng nhân. Sự
kết hợp nhân trong thể dị nhân hình thành tế bào trần lai thực sự gọi là thể dị nhân.
Nếu 1 trong 2 nhân bị đào thải, nguyên sinh chất của 2 tế bào trần sẽ dung hợp
tạo ra thể lai tế bào chất cybrid (Cytoplasmid hybrid). Sự liên kết và dung hợp tế
bào trần để tạo thành các tế bào lai heterocaryon giữa các mô cùng một loài hoặc
thuộc các loài khác nhau tùy thuộc vào nồng độ các ion như natri, kali, canxi, cũng
như độ pH của môi trương nuôi cấy. Đồng thời phụ thuộc vào một số chất có tác
dụng tăng cường liên kết tế bào như lysozym, và đặc biệt là polyethylen glycol do
cấu trúc phân tử của chúng có thể tạo nên các liên kết ion với các chất có mặt ở
màng sinh chất của tế bào. Sử dụng polyethylen glycol (với nồng độ từ 0,2- 0,3M)
có thể tạo ra các tế bào lai đạt từ 25- 50% và các tế bào lai có thể tồn tại qua nhiều
thế hệ. Sự tạo thành mô sẹo (callus) và tái sinh cây từ tế bào lai syncaryon không
phụ thuộc vào phương pháp tạo tế bào lai.
Kỹ thuật này cho phép mở rộng nguồn gene của các loài thực vật, tạo ra các
dòng tế bào sản xuất mới mang các đặc tính di truyền ưu việt của cả bố và mẹ.[1]
Bằng phương pháp dung hợp tế bào trần, ta có thể chuyển những gene hữu ích
như đề kháng sâu bệnh, cố định đảm, giúp tốc độ sinh trưởng nhanh hơn, tốc độ
hình thành sản phầm cao hơn (chấ lượng Protein), chống chịu được sương giá,
chịu hạn, kháng thuốc diệt cỏ, … Dung hợp tế bào trần là một công cụ quan trọng
giúp cho sự cải tiến giống để đem đến thay đổi đặc tính di truyền và phát triển
trong chủng nấm sợi lai. Dung hợp tế bào trần thường được dùng để kết hợp các
gene của các loài sinh vật khác nhau để tạo ra các chủng với đặc tính mong muốn.

Các nghiên cứu về tế bào trần trong thời kỳ 1960 và 1970
- Cooking 1960: Quy trình sử dụng enzyme để cô lập tế bào trần thực vật.
- Ruesink 1973: Nghiên cứu những tính chất vật lý của màng sinh chất .
- Willison et al. 1971: Nghiên cứu nhập bào và hấp thu các phần tử, các bào
quan (Potrykus 1975) và vi sinh vật (Davey và Power 1975).
- Howland et al. 1975: Phương pháp phá vỡ tế bào để nhanh chóng thâu nhận
các bào quan và các đại phân tử mà không gặp phải sự biến dạng hư hỏng như các
phương pháp ly trích thông thường.
- Nickell và Torey 1969: Tạo ra tế bào lai sinh dưỡng liên quan đến sự cải
thiện năng suất thu hoạch mùa vụ.
- Takebe 1975: Do mỗi một tế bào cách ly với tế bào khác trong quần thể tế
bào trần và là một hệ thống đơn bào nên có thể thao tác tương tự như quần thể vi
sinh vật. Tính chất này được khai thác thành công trong thí nghiệm cho nhiễm
CÔNG NGHỆ TẾ BÀO

GVHD: TS LÊ THỊ THUỶ TIÊN Trang 5

đồng loạt bởi virus, nuôi cấy nhân giống vô tính tế bào và phân lập các tế bào đột
biến.
- Pojnar et al. 1967: Tế bào trần phân lập từ mô quả cà chua được khảo sát
chi tiết đầu tiên quá trình cung cấp enzym để phục hồi trở lại vách tế bào
- Nagata và Takebe 1970: Nghiên cứu sự phân chia tế bào đầu tiên từ tế bào
trần.
- Grout and Coutts 1974 : Nghiên cứu bằng điện di có thể xác định bề mặt tế
bào có tích điện và có thể trong một số điều kiện thông thường nào đó điện tích
này là âm.
- Power et al. 1970: Tìm ra hợp chất gây ra sự tan rã là nitrate sodium chúng
làm giảm điện tích âm xuống làm cho màng tế bào sát lại gần nhau.
- Kao và Michayluk 1974, Wallin et al. 1974: tìm ra chất Polyethylene glycol
(PEG) được chấp nhận rộng rãi như một tác nhân gây ra sự tan rã

trần thực vật.
- Guerche et al. 1987: Chuyển nạp gen hữu thụ cho Brassica napus được
chuyển gen bởi pABD1 vào trong tế bào trần thịt lá bằng phương pháp xung điện .
- Kưhler et al. 1987: Chuyển gen trực tiếp cũng chứng minh khả năng tạo hạt
rau Vigna aconitifolia kháng kanamycin mô sẹo tái tạo từ tế bào trần sốc nhiệt xử
lý bởi PEG và pLGV NEO 2103.
- Các nghiên cứu chuyển gen trực tiếp vào tế bào trần thực vật cũng cung
cấp một hệ thống để quan sát sự biểu hiện gen trong khoảng thời gian vài giờ xử lý
chuyển nạp. Các nghiên cứu biểu hiện gen tạm thời (ngắn ngủi) như vậy có ích
trong việc đánh giá cấu trúc và gen khởi động khi gen reporter sẵn sàng có thể thử
nghiệm ví dụ như CAT và b-glucurionidase.
- Allshire et al. 1987: chứng chứng tỏ rằng các mẫu DNA lớn có thể đưa vào
và biểu hiện ở tế bào động vật.
Viễn cảnh hiện nay
- Davey et al. 1974: chứng minh rằng tế bào trần có thể cô lập bằng enzyme
từ một số nhóm tế bào ví dụ như từ tế bào biểu bì lá của thuốc lá rồi có thể tái tạo
lại thành cây nguyên vẹn.
- Cooking 1985: chứng minh rằng lông hút của rễ là sản phẩm tự nhiên của
tế bào biểu bì rễ, và nó đã được chứng minh xử lý bằng enzyme có thể làm tiêu
hủy đỉnh sinh trưởng của lông hút và phóng thích tế bào trần
- Ahuja et al. 1983: Tế bào trần cô lập từ rễ cây con, thân lá mầm, và lá mầm
của Lotus corniculatus (sen) sẵn sàng phân chia trong môi trường nuôi cấy để tạo
ra mô sẹo và từ đó có thể sinh ra tế bào trần
- Abdullah et al. 1986: phát hiện sự phát sinh phôi dưỡng trong các tế bào
trần cô lập từ dịch nuôi cấy để tái tạo cây nguyên vẹn
- Chand et al. (1988): quan sát thấy sự sự bóc trần tế bào cây dược liệu thân
gỗ Solanum dulcamara ở điện áp 250 đến 1250 vol/cm
2
trong ba xung điện kế tiếp
nhau mỗi xung kéo dài 10 – 50 ms đã kích thích sự tăng trưởng của mô dẫn suất từ

- Ưu điểm: Dụng cụ đơn giản
- Nhược điểm: Khá phức tạp, hiệu quả thấp.
 Phương pháp tách bằng enzyme:
Dùng enzym pectinase, hemicelolase, cellulase. Để phá vỡ thành tế bào có thể
dùng riêng lẻ hoặc kết hợp tuỳ vào từng loại tế bào. Enzym sử dụng phải tinh
khiết, nếu còn chứa ít nhiều protease hoặc peroxidase sẽ làm hỏng tế bào trần.
Hiệu quả của việc tạo tế bào trần còn phụ thuộc vào loại mô và cây được sử dụng.
- Ưu điểm: Thu được lượng lớn các tế bào trần
- Các bước tiến hành như sau:
 Thu mẫu và vô trùng bề mặt lá.
 Ngâm trong dung dịch có áp suất thẩm thấu cao -> hiện tượng co
nguyên sinh chất, tế bào bị mất nước, nội dung tế bào nhỏ lại, màng
nguyên sinh chất tách khỏi tế bào.
 Loại bỏ biểu bì mặt dưới hoặc cắt mẫu lá thành các lát mỏng, tạo thuận
lợi cho sự xâm nhập của các enzym.
 Xử lý hỗn hợp enzym.
 Tinh sạch và thu nhận các tế bào trần.