1

MỞ ðẦU

Cây thuốc Việt Nam rất phong phú và ña dạng. Việc sử dụng nguồn tài
nguyên quý giá này ñể phòng ngừa chữa bệnh và nâng cao sức khỏe cho con
người ñã có một quá trình lịch sử hàng ngàn năm và ngày càng ñược chú ý
quan tâm hơn trong xã hội hiện ñại.
Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật ñang phát triển rất mạnh và dần
trở thành một ngành sản xuất mang hiệu quả kinh tế cao. Công nghệ này ñã
giúp tạo ra ñược một số lượng lớn cây trồng ñồng nhất trong một thời gian
ngắn, duy trì các tính trạng tốt từ thế hệ này sang thế hệ khác. Thực chất, nuôi
cấy mô tế bào thực vật là một bước tiến bộ vượt bậc về chất của các phương
pháp nhân giống vô tính cổ ñiển như giâm cành, chiết, ghép, tách dòng… Nói
cách khác, nuôi cấy mô ñã biến những phương pháp cổ ñiển ñó thành những
phương thức hoàn toàn mới về chất mà phương pháp cổ ñiển không thể vượt
qua [10].
Trong những năm gần ñây, nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô
ñã áp dụng thành công cho nhiều loại cây. ðối với những loại cây trồng có giá
trị thương mại lớn, kỹ thuật nuôi cấy mô ñã ñem lại những hiệu quả kinh tế
hết sức rõ rệt. Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một ngành khoa học có nhiều
triển vọng, ñược ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực kinh tế.
Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) thuộc họ Gừng
(Zinggiberaceae) chi Amomum, là một loại dược liệu rất quý, chuyên trị các
bệnh ñường ruột, kém tiêu hóa và dung làm gia vị, hương liệu. Sa nhân ñược
dùng nhiều trong nước và ñược xuất khẩu ra nhiều nước trên thế giới.
Sa nhân là loại thuốc quý ñược sử dụng nhiều trong y học phương
ðông, bao gồm cả Trung Quốc, Nhật Bản, Việt Nam, Triều tiên và một số
quốc gia khác. Hạt sa nhân còn ñược dùng làm gia vị, tinh dầu hạt sa nhân
2



Phần 1.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1. NHÂN GIỐNG INVITRO THỰC VẬT
1.1.1. Lược sử phát triển và tầm quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.1.1.1. Lược sử phát triển của nuôi cấy mô tế bào thực vật
Năm 1665, Robert Hooke quan sát thấy tế bào sống dưới kính hiển vi
và ñưa ra khái niệm "tế bào - Cell". Năm 1838, Matthias Schleiden và
Theodore Schwann ñề xướng học thuyết cơ bản của sinh học gọi là Học
thuyết tế bào:
+ Mọi cơ thể sống ñược cấu tạo bởi một hoặc nhiều tế bào.
+ Tế bào là ñơn vị cấu trúc và chức năng cơ bản của cơ thể sống, là hình
thức nhỏ
nhất của sự sống.
+ Tế bào chỉ ñược tạo ra từ tế bào tồn tại trước ñó [5].
Năm 1902, Haberlandt lần ñầu tiên thí nghiệm nuôi cấy mô cây một lá
mầm nhưng không thành công. Năm 1934, Kogl lần ñầu tiên xác ñịnh ñược
vai trò của IAA, hoocmon thực vật ñầu tiên thuộc nhóm auxin có khả năng
kích thích sự tăng trưởng và phân chia tế bào. Năm 1939, ba nhà khoa học
Gautheret, Nobecourt và White ñã ñồng thời nuôi cấy callus thành công trong
thời gian dài từ mô thượng tầng (cambium) ở cà rốt và thuốc lá, callus có
khả năng sinh trưởng liên tục. Năm 1941, Overbeek và cs ñã sử dụng nước
dừa trong nuôi cấy phôi non ở cây cà rốt Datura. Năm 1955, Miller và cs ñã
phát minh cấu trúc và sinh tổng hợp của kinetin - một cytokinin ñóng vai trò
quan trọng trong phân bào và phân hoá chồi ở mô nuôi cấy. ðến năm 1957,
Skoog và Miller ñã khám phá vai trò của tỷ lệ nồng ñộ các chất
auxin/cytokinin trong môi trường ñối với sự phát sinh cơ quan (rễ hoặc chồi).
Khi tỷ lệ auxin/ cytokinin (ví dụ: nồng ñộ IAA/ nồng ñộ kinetin) nhỏ hơn 1

ñược nhiều tác giả phát triển và ứng dụng rộng rãi trong tạo dòng ñơn bội, dòng
thuần nhị bội kép, cố ñịnh ưu thế lai (nuôi cấy bao phấn hoặc hạt phấn của dòng
lai F1 ñể tạo giống thuần mang tính trạng ưu thế lai) [18], [19].
Năm 1959, Tulecke và Nickell ñã thử nghiệm sản xuất sinh khối mô
5

thực vật quy mô lớn (134 lít) bằng nuôi cấy chìm. Năm 1977, Noguchi và cs
ñã nuôi cấy tế bào thuốc lá trong bioreactor dung tích lớn 20.000 lít. Năm
1978, Tabata và cs ñã nuôi tế bào cây thuốc ở quy mô công nghiệp phục vụ
sản xuất shikonin. Họ ñã chọn lọc ñược dòng tế bào cho sản lượng các sản
phẩm thứ cấp (shikonin) cao hơn. Năm 1985, Flores và Filner lần ñầu tiên
sản xuất chất trao ñổi thứ cấp từ nhân nuôi rễ tơ ở Hyoscyamus muticus.
Những rễ này sản xuất nhiều hoạt chất hyoscyamine hơn cây tự nhiên. Hiện
nay, công nghệ nuôi cấy tế bào và mô (ví dụ, mô rễ của nhân sâm) trong các
bioreactor dung tích lớn ñã ñược thương mại hoá ở mức công nghiệp ñể sản
xuất sinh dược [18], [19].
Năm 1981, trên cơ sở quan sát các biến dị xảy ra rất phổ biến trong
nuôi cấy mô và tế bào với phổ biến dị và tần số biến dị cao, Larkin và
Scowcroft ñã ñưa ra thuật ngữ "biến dị dòng soma" (somaclonal variation)
ñể chỉ các thay ñổi di truyền tính trạng xảy ra do nuôi cấy mô và tế bào in
vitro. Từ các dòng tế bào hoặc cây biến dị di truyền ổn ñịnh có thể nhân
nhanh, tạo ra các dòng và giống ñột biến có năng suất, hàm lượng hoạt chất
hữu ích cao, kháng một số các ñiều kiện bất lợi như bệnh, mặn, hạn,… [18].
ðến nay các nhà khoa học ñã khẳng ñịnh rằng mức ñộ thành công của
chuyển gen vào cây trồng phụ thuộc rất nhiều vào hệ thống nuôi cấy và tái
sinh tế bào thành cây in vitro sau chuyển gen. Năm 1974, Zaenen và cs ñã
phát hiện plasmid Ti ñóng vai trò là yếu tố gây u (crown gall) ở cây trồng.
Năm 1977, Chilton và cs ñã chuyển thành công T- DNA vào thực vật. Năm
1979, Marton và cs ñã xây dựng quy trình chuyển gen vào tế bào trần bằng
ñồng nuôi cấy tế bào trần và Agrobacterium. Năm 1982, Krens ñã chyển

Ưu ñiểm của nuôi cấy mô tế bào thực vật trong ñiều kiện in vitro ñể
sản xuất các hợp chất thứ cấp:
+ Các tế bào thực vật có thể ñược nuôi cấy trong ñiều kiện nhân tạo
mà không phụ thuộc vào thời tiết và ñịa lý. Không cần thiết ñể vận chuyển và
bảo quản một số lượng lớn các nguyên liệu thô.
+ Có thể kiểm soát chất lượng và hiệu suất sản phẩm bằng cách loại bỏ
những trở ngại trong quá trình sản xuất thực vật, như là chất lượng của
7

nguyên liệu thô, sự ñồng nhất giữa các lô sản xuất và sự hư hỏng trong quá
trình vận chuyển và bảo quản.
+ Một số sản phẩm trao ñổi chất ñược sản xuất từ nuôi cấy dịch huyền
phù có chất lượng cao hơn trong cây hoàn chỉnh [11].
Một ý nghĩa không kém phần quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực
vật là mở ra những hướng mới trong nghiên cứu sinh lý và di truyền thực vật
như: cơ chế tổng hợp các chất, sinh lý phân tử, di truyền – ñột biến, sinh lý
dinh dưỡng ở các tế bà thực vật và nhiều vấn ñề sinh học khác…[19].

1.1.2. Các yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình nuôi cấy
1.2.1.1. Vai trò của chất kích thích sinh trưởng thực vật
Trong môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật, thành phần phụ gia
quan trọng nhất quyết ñịnh kết quả nuôi cấy là chất kích thích sinh trưởng.
Chất kích thích sinh trưởng thực vật là những chất ở nồng ñộ sinh lý có tác
dụng kích thích các quá trình sinh trưởng của mô. Tuy vậy, yêu cầu ñối với
những chất này thay ñổi tuỳ theo loài thực vật, loại mô, hàm lượng chất ñiều
hòa sinh trưởng nội sinh của chúng.
* Auxin
Môi trường nuôi cấy ñược bổ sung các auxin khác nhau như: IAA,
NAA, IBA, 2,4-D, NOA. Trong ñó, IAA là auxin tự nhiên có trong mô thực
vật; còn lại NAA, IBA, 2,4-D và NOA là các auxin nhân tạo, thường thì các

benzylaminopurine (BAP) hoặc 6-benzyladenin (BA), 6-γ-γ-dimethyl-
aminopurine (2-iP), N-(2-furfurylamino)-1-H-purine-6-amine (kinetin), và 6-
(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butanylamino) purine (zeatin). Zeatin và 2-iP là
các cytokinin tự nhiên, còn BA và kinetin là các cytokinin nhân tạo. Nói
chung, chúng ñược hòa tan trong NaOH hoặc HCl loãng.
Cytokinin liên quan tới sự phân chia tế bào, phân hóa chồi v.v… Trong
môi trường nuôi cấy mô, cytokinin cần cho sự phân chia tế bào và phân hóa
9

chồi từ callus hoặc từ các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh
chồi phụ.
Kinetin ñược phân lập từ chế phẩm DNA cũ hoặc nucleic acid mới sau
khi khử trùng ở nhiệt ñộ cao hay ñun sôi. Kinetin không tồn tại trong cơ thể
sống, sản phẩm này kích thích sự phát sinh chồi của cây thuốc lá nuôi cấy,
nhưng nếu phối hợp xử lý cùng auxin ở tỷ lệ nồng ñộ thích hợp thì sẽ kích
thích quá trình phân chia tế bào ở các mô không phân hóa.
Hoạt lực của BAP cao hơn nhiều so với kinetin và bản thân BAP bền
vững hơn zeatin dưới tác ñộng của nhiệt ñộ cao. BAP có khả năng làm tăng
hình thành các sản phẩm thứ cấp và tăng kích thước của tế bào ở các lá mầm,
kích thích sự nảy mầm của hạt và quá trình trao ñổi chất.
Tỷ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng ñối với sự phát sinh hình thái
(morphogenesis) trong các hệ thống nuôi cấy. ðối với sự phát sinh phôi
(embryogenesis), ñể tạo callus và rễ cần có tỷ lệ auxin/cytokinin cao, trong
khi ở trường hợp ngược lại sẽ dẫn ñến sự sinh sản chồi và chồi nách. Vấn ñề
quan trọng không kém là nồng ñộ của hai nhóm chất ñiều khiển sinh trưởng
này. Chẳng hạn 2,4-D cùng với BA ở nồng ñộ 5,0 ppm kích thích sự tạo thành
callus ở Agrostis nhưng nếu dùng ở nồng ñộ 0,1 ppm chúng sẽ kích thích tạo
chồi mặc dù trong cả 2 trường hợp tỷ lệ auxin/cytokinin là bằng 1 [10], [13].

1.2.1.2. Ảnh hưởng của than hoạt tính

hơn, nhẵn, cuống lá dạng bẹ, dài 5 – 10 cm hoặc hơn. Lưỡi bẹ nhỏ, hình
mác nhọn dài 1,5 – 4,0 cm, màu nâu nhạt hoặc xám trắng, mỏng.
Cụm hoa bông, mọc từ thân rễ và từ gốc; cuống cụm hoa dài 3 – 6
cm, gồm nhiều ñốt, có vảy màu nâu. Có 5 – 8 hoa trên một cụm, màu trắng;
cuống hoa rất ngắn. Lá bắc ngoài hình bầu dục, màu nâu, dài 2,0 – 2,5 cm,
rộng 0,8 cm, mép nguyên; lá bắc trong dạng ống, màu nâu nhạt, dài
1,5cm, ñầu chia thành 2 thuỳ nông. ðài hoa dạng ống, dài 1,5 cm hoặc hơn,
màu trắng hồng, ñầu xẻ 3 thuỳ. Tràng hoa hình ống, dài 1,6 – 1,7 cm, mặt
11

ngoài có lông thưa, gồm 3 thuỳ, thuỳ giữa dài 1,6 cm, rộng 0,4 cm, lớn hơn
2 thuỳ bên. Cánh môi hình thìa, dài 1,7 - 1,8 cm, rộng 2,0 – 2,2 cm, ñầu
cánh môi thường cuộn ra phía sau; vệt giữa cánh môi màu vàng, kéo dài lên
ñến ñầu cánh môi, có 3 sọc tím hồng. Bộ nhị dạng bản, dài 0,6 – 0,7 cm,
rộng 0,3 cm, nhẵn; bao phấn 2 ô; trung ñới có mào, chia thành 3 thuỳ. Bầu
hình trứng thuôn, dài 0,4 – 0,5 cm; vòi nhuỵ mảnh (dạng chỉ) dài 2,0 – 2,5
cm; ñầu nhuỵ dạng phễu.
Quả dạng quả nang, hình trứng hay gần hình cầu, dài 1,3 – 1,6 cm,
ñường kính 1,2 – 1,3 cm; chia thành 3 múi nông; vỏ ngoài có gai ngắn, dày;
màu tím nâu; khi già gai ngắn bớt và chuyển sang màu tím ñen. Hạt nhiều gồm từ
13 – 28 hạt xếp thành 3 ô, có áo hạt màu trắng, vị hơi ngọt. Hạt hình ña cạnh,
màu nâu ñen, cắn vỡ có vị cay, mùi thơm của tinh dầu [3], [4].

1.1.1.2. Phân bố
Ở Việt Nam sa nhân chủ yếu mọc ở các tỉnh phía Nam: Quảng
Nam (huyện Trà My Tây); Quảng Ngãi (các huyện Sơn Hà, Sơn Tây, Ba Tơ);
Bình ðịnh (các huyện Vĩnh Thạnh, Tây Sơn); Phú Yên (các huyện Sơn Hoà,
Sông Hinh); Ninh Thuận (các huyện Ninh Sơn, Bắc Ái); Kon Tum (các
huyện Ngọc Hồi, Sa Thày); Gia Lai (các huyện K’Bang, An Khê); ðắk
Lắk (các huyện Krông Năng, Krông Ana, M' ðrắk, Krông Bông, Lắk). Ở

nằm trong khu vực nhiệt ñới gió mùa nóng và ẩm, với hai mùa mưa và khô
khá rõ rệt. Mùa mưa tập trung vào vụ hè hay vụ hè – thu, mùa khô ở các
ñiểm có sa nhân tím mọc tự nhiên ở các tỉnh phía Nam thường trùng
với các tháng là mùa ñông và xuân ngoài miền Bắc. Trong tổng số 4 –
5 tháng mùa khô ñó, có 2 – 3 tháng hoàn toàn không có mưa, nhưng do
sống trong môi trường rừng ẩm, Sa nhân tím vẫn sinh trưởng phát triển
tốt. ðặc biệt là vụ hoa cuối tháng 3 ñầu tháng 4, do không bị mưa, trời
luôn có nắng nên tỷ lệ ñậu quả của cây khá cao.
Từ năm 1992 ñến nay, sa nhân tím ñã ñược thu thập ñưa ra trồng ở
một số ñịa phương ở các tỉnh phía Bắc (Tân Lạc – Hoà Bình, Chân Mộng
- ðoan Hùng – Phú Thọ, huyện Bảo Thắng và thị xã Lào Cai – Lào Cai,
ðại Từ – Thái Nguyên). Mặc dù cây ñược trồng ở môi trường khí hậu –
13

thời tiết hơi khác với nơi mọc tự nhiên, nhưng sa nhân tím vẫn sinh
trưởng phát triển tốt và ra hoa kết quả nhiều.
ðặc trưng khí hậu ở những ñịa ñiểm trồng sa nhân tím kể trên là: Khí
hậu nhiệt ñới gió mùa nóng ẩm, có mùa ñông lạnh, mưa tập trung vào
mùa hè – thu và mỗi năm cũng có 1 – 2 tháng ñược coi là khô hạn. Tuy
nhiên mức ñộ khô hạn ở ñây không ñến mức cực ñoan như ở các tỉnh
phía Nam.
Tóm lại, ñặc ñiểm cơ bản về khí hậu ñối với sa nhân tím là nền khí
hậu nhiệt ñới gió mùa nóng và ẩm, nhiệt ñộ trung bình năm vào khoảng trên
23
o
C. Cây ñem trồng ở các tỉnh phía Bắc mặc dù có mùa ñông lạnh trương
ñối kéo dài, nhưng vẫn sinh trưởng phát triển tốt. ðiều ñó chứng tỏ, sa nhân
tím có khả năng thích nghi khá cao với ñiều kiện thời tiết ở các vùng tiểu khí
hậu nhiệt ñới gió mùa nóng và ẩm tại Việt Nam.
* Thổ nhưỡng ñất ñai: Sa nhân tím mọc tự nhiên ở các tỉnh phía

nhân tím. Nhờ có nước, rễ sa nhân tím mới hấp thụ ñược các chất hữu cơ và
chất khoáng hoà tan trong nước ñể thực hiện quá trình ñồng hoá. Trong
những tháng mùa khô ở các tỉnh phía Nam, cây sa nhân mọc tự nhiên ở
rừng vẫn thực hiện thoát hơi nước ñể mát lá và sinh trưởng phát triển tốt là
do nước ngầm và ñộ ẩm trong không khí từ quần xã rừng cung cấp.
Nhu cầu nước ñối với cây sa nhân khi mới trồng là rất quan trọng.
Nước tưới sẽ làm cho ñất ở gốc ñược lèn chặt hơn (so với không tưới). Mặt
khác, nước làm cho ñất ẩm, duy trì cho các nhánh Sa nhân tím luôn ñược
tươi, tạo ñiều kiện ra rễ và mọc chồi. Sau khi cây sa nhân tím ñã mọc và cho
ñến suốt quá trình sinh trưởng về sau, mặc dù không cần tưới, nhưng do có
hệ thống rễ chùm phát triển rất mạnh nên có khả năng hút ñược nhiều nước
ngầm trong ñất. ðặc biệt khi sa nhân tím ñã phát triển thành thảm dày ñặc
(sau 2 năm tuổi), chúng còn có khả năng giữ nước cho ñất.
Tuy nhiên, cây sa nhân tím không chịu ñược ngập úng lâu ngày. Vào
thời kỳ ra hoa, nếu gặp trời mưa sẽ ảnh hưởng tới khả năng thụ phấn và
tỷ lệ kết quả. ðiều ñó có thể giải thích một phần tại sao vụ hoa tháng 4 – 5
thu ñược nhiều quả gấp 4 lần so với vụ hoa tháng 7 – 8 có mưa nhiều (cây
trồng ở các tỉnh miền Bắc).
15

* Nhu cầu ánh sáng: Ánh sáng ñối với sa nhân tím cũng là một
nhân tố sinh thái cần và ñủ. Có ánh sáng cây mới thực hiện ñược quá
trình quang hợp và ñồng hoá. Trong môi trường tự nhiên, sa nhân tím
thường mọc xen dưới tán những cây bụi và cây gỗ, với ñộ tàn che từ 10 –
60%; thậm chí có chỗ tới 70%. Tuy nhiên, ở ñộ tàn che trên 40% cây
sinh trưởng mạnh về chiều cao.
Ánh sáng là nhân tố cần thiết của cây. Song với ñộ tán che từ 10 –
20% (hoặc 30%) có lẽ là thích hợp nhất cho sa nhân tím sinh trưởng phát
triển mạnh. Trong trường hợp có những ñám sa nhân tím mọc dày ñặc,
không có cây che bóng trực tiếp mà vẫn sinh trưởng phát triển tốt là do ở

- Hàm lượng tinh dầu trong hạt ñạt tỷ lệ trên 1,5%.
* Thành phần hoá học: Trong hạt sa nhân tím có thành phần
chủ yếu là tinh dầu, với hàm lượng trên 1,9%. Phân tích tinh dầu ñã
xác ñịnh ñược 13 hợp chất khác nhau. ðó là: camphor (37,4% trong tinh
dầu), bonyl acetat (36,1%), camphen

(7,4%), borneol (6,4%), limonen
(6,3%),
α
- pinen (2,3%),
β
- myrcen (1,6%), linalool (0,7%),
α
-phellandren
(0,3%), p-cymen (0,2%),
β
- pinen (0,1%),
α
-thujene (vết),
β
-
caryophylen (vết) [14].

1.2.3.2. Giá trị
* Giá trị kinh tế: Sa nhân là loại dược liệu có giá trị sử dụng trong
nước và xuất khẩu cao. Hàng năm, từ nguồn sa nhân mọc tự nhiên ở Việt
Nam ñã khai thác thu mua ñược khoảng 100-300 tấn (quả khô) sử dụng
trong nước và vài trăm tấn xuất khẩu.
Giá thu mua sa nhân tại chỗ trung bình từ 30.000 ñ ñến 40.000
ñ/kg quả khô (cả vỏ). Giá xuất khẩu 90.000 ñ ñến 120.000 ñ/ kg khô (

thể ñể khắc phục những vấn ñề của tình trạng thiếu nguyên liệu trồng.
Chồi nách ñã ñược Wondyifraw Tefera và Surawit Wannakrairoj (2004
) sử dụng trong vi nhân giống Amomum krervanh Pierre ex Gagnep. Chồi
nách ñược tách ra và khử trùng bề mặt sau ñó cấy trên môi trường MS cơ bản
không có chất ñiều hòa sinh trưởng trước khi cấy trên MS, 1/2 MS, MS với
1/2 nitrogen. Từ kết quả nghiên cứu của mình, Wondyifraw Tefera và Surawit
Wannakrairoj kết luận rằng: hệ số nhân chồi cao nhất ñã thu ñược trên môi
trường MS. Khi bổ sung 0, 5, 10, 15 và 20% v/v dừa nước (CW), nhận thấy
rằng 5% CW là tốt nhất cho sự tăng trưởng và phát triển chồi, về số lượng
chồi, cũng như trọng lượng tươi và khô. Tác ñộng của 0, 2 và 4 mg / l imazalil
(IMA) ñã ñược nghiên cứu ñồng thời kết trong hợp với 0,0.1, và 0.5 mg l / 6-
benzyladenine (BA) hoặc thidiazuron (TDZ). Môi trường tốt nhất ñể chồi sinh
trưởng và phát triển là với 2 mg/l IMA và 0,5 mg/l TDZ. Rễ ñược hình thành
18

tương ñối dễ khi sử dụng môi trường MS không có chất ñiều hòa sinh trưởng.
Cây con in vitro có ñầy ñủ rễ ñược huấn luyện thích nghi trên ñất với tỷ lệ
thành công hơn 90% [26].
1.3.2 Chi Alpinia
Khi nghiên cứu về cây riềng (Alpinia galanga Willd) M. Borthakur, J.
Hazarika & R.S. Singh (1999) nhận thấy chồi mới nảy của thân rễ tạo ra các
chồi và rễ ñồng thời khi nuôi cấy trong môi trường MS bổ sung kinetin 3,0
mg / l. Mỗi chồi thí nghiệm tạo ra trung bình 8 chồi và rễ ñồng thời trong
vòng 8 tuần. Cây con tái sinh chuyển ra ñất thành công, chúng phát triển tốt
trong vòng 10-12 tuần với tỷ lệ sống sót 80% [21].
Chinnasamy Selvakkumar và cs (2007) ñã nghiên cứu sự nhân chồi
chồi in vitro cây riềng tía (Alpinia purpurata). Những chồi có nguồn gốc từ
thân rễ khi ñược cấy trên Murashige và Skoog bổ sung riêng lẽ hay kết hợp
chất kích thích sinh trưởng. Cụm chồi lớn nhất ñã ñược quan sát thấy trên môi
trường MS có chứa 3% (w/v) sucrose và 3,0 mg/l kinetin và 1,0 mg/l NAA.

Thân rễ lớndễ dàng phát triển chồi , khi ñược chuyển trực tiếp từ trong ống
nghiệm trồng vào ñất mà không qua huấn luyện thích nghi khí hậu. Thân rễ
tạo ra trong ñiều kiện in vitro có thể ñược cất và dễ dàng vận chuyển, thuận
lợi cho nhân chồi in vitro [24].
Khi nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật Piyamat Srirat kết luận, chồi từ
thân rễ của Curcuma longa L. ñã ñược sử dụng và cấy trên môi trường MS có
chứa 30 và 60 g/l sucrose, bổ sung riêng lẻ hoặc kết hợp 5 mg/l thidiazuron
(TDZ) và 5 mg/l của 6-benzyl-amino-purine (BA). Các thí nghiệm nghiên
cứu ở ñiều kiện nhiệt ñộ 25 ± 1
0
C, 16 chiếu sáng. Kết quả cho thấy các ñiều
kiện thích hợp cho nuôi cấy in vitro là môi trường MS có chứa 60 g/l sucrose
và 5 mg/l của TDZ. Trong ñiều kiện này, số chồi trung bình là 6,65 ± 1,98
sau 8 tuần nuôi cấy. Hơn nữa, sự phát sinh rễ ñã ñạt ñược sau 6 nuôi cấy với
tất cả các nghiệm thức sử dụng môi trường MS có chứa 60 g/l sucrose [29].
S K Shukla (2007) nghiên cứu sự tái sinh in vitro của cây nghệ
Curcuma angustifolia Roxb từ nuôi cấy mô phân sinh chồi. Các chồi từ thân
rễ (2 - 3 cm) ñược cấy trên môi truờng MS có bổ sung 3,0 mg/l BAP ñể thăm
dò sự nảy chồi và kéo dài chồi. Kết quả thu ñược 1,87 ± 0,28 chồi/mẫu. Chồi
20

in vitro ñược chuyển lên môi trường MS có bổ sung 3,0 mg/l BAP và 25 mg/l
adenine sulfate ñể nhân chồi. Khoảng 6,9 ± 0,69 vi chồi/mẫu ñược tạo ra
trong 6 tuần. Chồi tạo rễ ngay trên môi trường nhân chồi. Cây in vitro hoàn
chỉnh có rễ ñược chuyển ra chậu cho thấy 83% sống sót trong ñiều kiện bình
thường [28].

1.3.4 Chi Zingiber
Azra Sultana và cs (2009) ñã nghiên cứu sự cảm ứng của lá và rễ in vitro
của cây gừng. Môi trường MS có bổ sung các chất kích thích sinh trưởng riêng

quan và tăng trưởng chồi. Vỏ và rễ ñược cấy trên môi trường vw có chứa
5mg/l 2,4-D và 0,5 mg/l BA, 3% sucrose và 200ml/l nước dừa, cảm ứng
callus. Tuy nhiên, chỉ có rễ phát sinh từ mô sẹo có thể sản xuất nhiều phôi
soma từ bề mặt [25].
M. Chithra và cs nghiên cứu năm 2005 về việc nhân giống và bước ñầu
chuyển cây con ra môi trường ngoài của Kaempferia galanga L Nguyên liệu
ban ñầu là protocol. Môi trường MS với sự kết hợp của 8.87 mM N6-
benzyladenine (BA) và 2.46 mM indole-3-butyric acid (IBA) tạo ra số chồi
trung bình mỗi mẫu là 6,2. Bổ sung 11.7 mM nitrat bạc vào 8.87 mM BA và
2.46 mM IBA cho môi trường tạo ñiều kiện phát triển số lượng chồi cũng như
rễ cao nhất trong vòng 60 ngày (8,3 chồi). Những chồi riêng lẽ ñược cấy trên
môi trường với tổ hợp BA, IBA và nitrat bạc làm tăng số lượng chồi là 12,1.
Nitrat bạc làm giàu sự phát triển của thân rễ tại mỗi gốc chồi. Tăng nồng ñộ
ñường (6-8%) trong môi trường có BA, IBA và nitrat bạc làm thân rễ phát
triển tốt nhất. Kết quả cho thấy 95% chồi sống sót trong ñiều kiện ñó [22].
Christin (2007) ñã nghiên cứu nhân giống in vitro Curcuma zedoaria và
Zingiber zerumbet, các chồi ñược khử trùng bề mặt với 100 mg/L thủy ngân
Clorua (HgCl
2
) trong năm phút, tiếp theo là 20% (v/v) Clorox với vài giọt
Tween 20 trong 10 phút ở giai ñoạn ñầu tiên và 10% (v/v) Clorox 10 phút ở giai
ñoạn thứ hai. Thí nghiệm này cho phép khử trùng tạo 87% chồi vô trùng và sống
sót ở C. zedoaria và 80% cho Z. zerumbet. Môi trường tối ưu cho sự phát triển
của chồi ở cả hai loài là MS (Murashige và Skoog, 1962) vừa bổ sung 0,5 mg/L
và BA 0,5 mg/L IBA. Chồi ñược cấy của cả hai loài nuôi trong môi trường lỏng
tăng nhanh hơn gấp hai lần số lượng so với môi trường ñặc [23].
22

Phần 2.
ðỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

15 phút, sau ñó lắc khoảng 15 phút rồi rửa sạch dưới vòi nước chảy, lặp lại 3
lần. Tiếp ñến ngâm trong nước javen 50% trong khoảng 10-15 phút, lắc mẫu
khoảng 10-15 phút rồi rửa sạch javen dưới vòi nước chảy. Tiếp ñến, ngâm
trong thuốc diệt nấm VIBEN-C 50BTN theo tỉ lệ 1,25g/500ml nước máy
trong khoảng 30 phút rồi rửa sạch dưới vòi nước chảy. Mẫu ñược rửa lại bằng
nước cất và chuyển vào tủ cấy. Sau khi khử trùng bằng cồn 70% trong 1 phút,
khử trùng trong HgCl
2
0,1% từ 10 ñến 20 phút liên tục hoặc gián ñoạn, rửa lại
bằng nước cất tiệt trùng 5-7 lần. Mẫu cấy lên môi trường nuôi cấy ban ñầu.
Khả năng khử trùng mẫu ñược ñánh giá thông qua theo dõi tỷ lệ mẫu chết,
mẫu nhiễm và mẫu sống không nhiễm sau 4 tuần theo dõi.

2.3.2. Môi trường nuôi cấy
Môi trường cơ bản dùng ñể nuôi cấy là môi trường MS (Murashige-
Skoog 1962) có bổ sung các chất ñiều hòa sinh trưởng khác nhau tuỳ theo
mục ñích của từng thí nghiệm. Nguồn carbon là ñường saccharose. Môi
trường ñược làm ñặc bằng agar, pH của môi trường ñược ñiều chỉnh ñến 5,8
trước khi ñược khử trùng ở 121
o
C trong 15 phút.

2.3.3. Nuôi cấy ban ñầu
Mẫu sau khi khử trùng ñược ñặt lên giấy thấm vô trùng. Dùng dụng cụ
cấy vô trùng cắt mẫu thành các mẫu nhỏ có kích thước khoảng 2 -3 cm. Mẫu
ñược cấy lên môi trường dinh dưỡng cơ bản MS có 3,0% ñường, 0,8% agar,1,0
g/l than hoạt tính và bổ sung riêng lẻ BAP; Kin ; tổ hợp BAP và Kin; tổ hợp Kin
và NAA với nồng ñộ khác nhau ñể thăm dò khả năng tái sinh của mẫu.

2.3.4. Nhân nhanh

25

Phần 3.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN3.1. NUÔI CẤY BAN ðẦU
3.1.1. Khử trùng mẫu
ðiều kiện vô trùng quyết ñịnh sự thành bại của quá trình nuôi cấy in
vitro. Do ñó mẫu trước khi ñưa vào nuôi cấy, ngoài việc chọn lọc cây sạch
bệnh và bộ phận sạch bệnh, cần phải ñược khử trùng. Việc khử trùng ñảm
bảo sạch nấm, vi khuẩn nhưng không làm chết mẫu.
Trong nghiên cứu này chúng tôi chọn các nhánh con mọc ra từ cây sa
nhân mẹ và hạt làm nguyên liệu ban ñầu. Mẫu ñược khử trùng sạch bên ngoài
phòng cấy, rồi ñược rửa lại bằng nước cất và chuyển vào tủ cấy. Sau ñó mẫu
ñược khử trùng sơ bộ bằng cồn 70% trong 1 phút. ðối với mẫu hạt, chúng tôi
khử trùng HgCl
2
0,1% 3 phút và 2 : 1 phút. ðối với mẫu cấy là nhánh con,
chúng tôi khử trùng HgCl
2
0,1% từ 10 ñến 20 phút liên tục hoặc gián ñoạn.
Cuối cùng, mẫu ñược rửa lại bằng nước cất tiệt trùng 5 -7 lần. Sau ñó dùng
dụng cụ cấy vô trùng ñể cắt mẫu thành từng ñoạn kích thước 2 – 3 cm, chia