1
Báo cáo sơ bộ kết quả nghiên cứu biến dị di truyền microsatellite loci cá rô phi
TS. Phạm Anh Tuấn
CN. Nguyễn Thị Tần
KS Lê Quang Hưng
Tóm tắt
Để nghiên cứu biến dị di truyền của quần đàn cá rô phi (Oreochromis niloticus) lai tạo, 1065
mẫu cá rô phi trong 9 quần đàn lai tạo được đánh giá về kiểu gene thông qua 4 microsatellite
markers bao gồm IGF-MSO3, UNH 104, UNH 124 và UNH 216. Tỷ lệ dị hợp tử thực tế và lý
thuyết cùng tần số các alleles được tính toán để xác định biến dị di truyền trong mỗi quần đàn và
trong các quần
đàn với nhau. Cả 4 microsatellite loci đều thể hiện đa hình trong đó số alleles là 5, 4,
3 và 3 tương ứng với các locus IGF-MSO3, UNH216, UNH 124 và UNH 104. Tỷ lệ dị hợp tử lý
thuyết cao nhât ở locus IGF-MSO3 (0.77) và thấp nhất ở locus UNH124 (0.66), trong khi đó tỷ lệ dị
hợp tử thực tế cao nhất ở locus UNH 216 (0.98) và thấp nhất ở locus UNH 104 (0.57). Tỷ lệ dị hợp
tử lý thuyết trên các quần đàn dao động từ 0,63 đến 0,69 còn tỷ lệ dị
hợp tử thực tế dao động từ 0,56
đến 0,83 trên tất cả các loci. Có hai nhánh chính trong cây di truyền, nhánh thứ nhất gồm các quần
đàn 1, 7, 8, và 9 và nhánh thứ hai gồm quần đàn 2, 3, 4, 5, 6. Trong đó, quần đàn 3 và 4, 5 và 6, 8 và
9 là rất gần nhau về khoảng cách di truyền.
1. Đặt vấn đề
Mặc dù cá rô phi có nguồn gốc từ châu Phi và vung Trung Đông, nhưng chúng đã trở thành đối
tượng nuôi thủy sản quan trọng hầu khắp thế giới và được nuôi rộng rãi trên 100 quốc gia (Romana-
Eguia et al., 2004). Sản lượng lớn nhất của cá rô phi là từ châu á và vùng Đông Dương. Theo ước
tính, 80% sản lượng cá rô phi nuôi trên thế giới là từ châu á, trong đó Trung Quốc là nước cung cấp
cá rô phi lớn nhất. Loài O. niloticus đứng thứ 8 trong bảng sếp hạng sản lượng nuôi của thế giới
năm 2004 (sấp xỉ 1,5 triệu tấn với giá trị 1,6 tỷ USD). Sản lượng cá rô phi cũng tăng mạnh từ nă
m
1995 đến 2004 là khoảng 2,6 lần về sản lượng và 2,2 lần về giá trị. Theo ước tính, sản lượng và giá
trị kinh tế của cá rô phi năm 2004 là 1,82 triệu tấn và đạt 2,2 tỷ USD (FAO, 2005). Cá rô phi không

32. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1. Phương pháp thu mẫu
Thu mẫu trên 9 quần đàn cá rô phi lai tạo theo bảng 1. Ba muơi mẫu vây cá rô phi từ mỗi
quần đàn được thu ngẫu nhiên và cố định trong cồn ethanol 100% và đựng trong lọ effendof
1,7ml. Các mẫu được ghi số theo công thức (ct) hay quần đàn từ 1 đến 9. Các mẫu cá rô phi này
được thu từ Trung tâm quốc gia giống thủy sản nước ngọt Hải Dương và được
đưa về Phòng di
truyền, Viện nghiên cứu nuôi trồng Thủy sản I để xử lý và làm tiếp các bước tiếp sau.
Bảng 1. Các công thức lai của các quần đàn giữa các dòng GIFT, RIA#1, Taiwan
♂
♀
GIFT RIA#1 TAIWAN (DL)
GIFT

CT 1
♀ GIFT x ♂ GIFT

CT 4
♀ GIFT x ♂ RIA#1

CT 7
♀ GIFT x ♂ TAIWAN

RIA#1
Bảng 2. Microsatellite loci, trình tự nucleotide từ đầu 5’ tới 3’ và nhiệt độ gắn mồi

Primers
Trình tự (5’ -3’)
Nhiệt gắn mồi (
o
C)
(T
ann
)
UNH 104 F GCAGTTATTTGTGGTCACTA 54
UNH 104 R GGTATATGTCT¢CTGAATCC 54
UNH 124 F AATTTGGCAGCTTCTTTT 50
UNH 124 R CCCACAAGCATAGTAAACT 50
UNH 216 F GGGAAACTAAAGCTGAAATA 50
UNH 216 R TGCAAGGAATATCAGCA 50
IGF-MSO3 F ATGCTAGCAAACATCAAAGGTC 58
IGF-MSO3 R GATATGCTGATGATGCACAGAGTC 58

Tối ưu phản ứng PCR
Trước hết tối ưu phản ứng PCR với nồng độ MgCl
2
và nồng độ dNTPs để có kết quả PCR
tốt nhất. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: Chế độ chạy tối ưu là 7 chu kỳ ở 94
o
C trong 1phút; 30
giây cho nhiệt gắn mồi tối ưu, 72
o

Máng và lược của máy điện di được rửa sạch với cồn 70% v/v. Các trang thiết bị Sequi-Gen
được lắp ráp theo hướng dẫn của nhà cung cấp máy (Bio-Rad).
Chuẩn bị bản Gel
Hỗn hợp ở bảng 3 được chuẩn bị bằng cách lắc tất cả hóa chất trong một ống đong có bịt kín
bằng giấy parafin. Dung dịch này được đổ vào khay đúc
ở đó thiết bị máy Sequi-Gen được đặt
thẳng đứn tới khi gel đông được lắp đặt.
Bảng 3. 6% v/v dung dịch gel gốc polyacrylamide, gel plug và hỗn hợp gel siêu mỏng.
Thành phần 6% dd gốc
1
Gel
2
Gel siêu mỏng
2
Dung dịch 40 % Acrylamide/bis (19:1) 150 mL
Urea (siêu tinh khiết) 480.5 g
5 x TBE 200 mL
sdH
2
O 650 mL
30 mL 60 mL
TEMED - 150 µL 60 µL
Ammonium persulphate (25% v/v) - 150 µL -
Ammonium persulphate (10% v/v)
3
- - 280 µL
1
Urea siêu tinh khiết được hòa trong 500 mL dH
2
O, cho thêm 150 mL dung dịch acrylamide/bis và 200 ml dung dịch 5 x

70
o
C trong 5 phút. Năm ỡL của mỗi mẫu được chấm vào giếng từ 2-23. Hai mẫu chuẩn được cho
vào giếng 1 và 24. Bản gel được chạy đầu tiên ở 30 W trong 5 phút để giúp mẫu di chuyển trong
bản gel, sau đó chạy ở 52 W khoản 1.5-2.5 giờ. Quá trình sản phẩm PCR chạy xuống trong bản gel
được theo dõi bằng tỷ lệ di chuyển của bromophenol blue và chất nhuộm cylene cyanol (có trong
FLB). Sau khi chạy xong, bỏ các cặp điện ra, tách nhẹ các miếng kính ra để nhuộm b
ản gel.
Nhuộn bạc ADN
Chất nhuộm bạc không gây đột biến dược mô tả theo Ludwig et al. (1989) và Caetano-
Anolles et al. (1991) được sử dụng để phân giải các mảnh PCR. Tất cả các bước được tiến hành
trong máy lắc (Edwards Instruments Company) trừ trường hợp đặc biệt.
Các bản Gel được rửa và cố định bằng dung dịch Fix 1 trong 30 phút (1 lần), sau đó đặt vào
dung dịch tươi Fix 2 khoảng 15 min (2 lần). Bản gel được oxy hóa với dung dịch acid nitric 1% v/v

7
đúng 5 phút. Rồi bản Gel được nhúng trong nước mới cất dH
2
O (2 lần) và đặt trong dung dịch Bạc
nitrate 0.012 M trong 30 phút. Bản gel được ngâm nước mới cất đúng 5 giây (2 lần). Sự xuất hiện
băng vạch phải nhờ vào 3 lần thay đổi dung dịch phát triển đã làm lạnh ở 10
o
C khoản 30 giây, 5
phút và cho tới khi băng đạt tiêu chuẩn xuất hiện. Phản ứng lên màu được ngưng bằng việc ngâm
bản gel vào dung dịch 10% acetic acid trong 5 phút. Bản gel được nhúng vào nước cất và làm khô
ở nhiệt độ phòng để giúp giữ bản gel lâu hơn.
2.4. Ghi và phân tích số liệu
Bản gel được chụp ảnh và ghi kết quả với những băng vạch được đối chiếu với các bản gel khác
nhau. Nếu cá thể xuất hiện một băng là allele đơn, hay ở trang thái đồng hợp tử. Cá thể là dị hợp tử
khi có hai allele hay hai băng với độ nét tương đương.

UNH 216 4 0.7305 0.9821 0.3274 0.1816 0.3117 0.1794 -
UNH 124 3 0.6310 0.5817 0.4495 0.3630 0.1875 - -
UNH 104 3 0.6655 0.5727 0.3062 0.3502 0.3436 - -

3.2. Biến dị di truyền của các quần đàn thông qua 4 microsatellite loci
Biến dị di truyền của các quần đàn Ct1 đến Ct9 được trình bày ở bảng 5. Tỷ lệ dị hợp tử thực
tế và lý thuyết cũng thay đổi theo mỗi locus và các quần đàn khác nhau. Tỷ lệ dị hợp tử thực tế trên
locus UNH216 là hầu hết bằng 1, trừ quần đàn 1 (Ct1). Tỷ lệ dị hợp tử lý thuyế
t (H
e
) trung bình trên
các quần đàn dao động từ 0,63 đến 0,69, cao nhất là ở ba quần đàn Ct4, Ct5, Ct6 (0,69) còn và thấp
nhất ở hai quần đàn Ct1 và Ct2 (0,63). Tuy nhiên, tỷ lệ dị hợp tử thực tế lại dao động nhiều hơn, từ
0,56 tới 0,83, thấp nhất là ở công thức 8 (Ct8) và cao nhất là ở công thức 5 (Ct5).
Bảng 5. Tần số dị hợp tử lý thuyết (H
e
) và thực tế (H
o
) của các quần đàn
IFG-MSO3 UNH216 UNH124 UNH104 Trung bình
Loci
Ct
H
e
H
o
H
e
H
o

0,73 0,57 0,73 1 0,66 0,75 0,63 0,70
0,69 0,75
Ct7
0,68 0,55 0,73 1 0,57 0,77 0,62 0,33
0,65 0,66
Ct8
0,75 0,47 0,69 1 0,65 0,50 0,62 0,27
0,68 0,56
Ct9
0,70 0,28 0,73 1 0,54 0,50 0,59 0,52
0,64 0,58

3.3. Khoảng cách di truyền
Bảng 6. Khoảng cách di truyền của các quần đàn tính theo Nei (1972)
Quần đàn 1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 *****
2 0.2498 *****
3 0.1913 0.0755 *****
4 0.1872 0.0660 0.0290 *****
5 0.0720 0.1266 0.0922 0.0562 *****
6 0.1444 0.1616 0.0893 0.0597 0.0466 *****
7 0.1628 0.2116 0.0823 0.1225 0.1658 0.1153 *****
8 0.1192 0.1509 0.1079 0.0676 0.0915 0.0778 0.0809 *****
9 0.0791 0.2720 0.1751 0.1974 0.1773 0.1855 0.0790 0.0783 *****

Khoảng cách di truyền được trình bày ở bảng 6 và được minh họa bằng cây di truyền ở hình
1. Khoảng cách di truyền càng lớn thì các quần đàn càng xa nhau hơn trong cây di truyền. Ơ bảng
này cho thấy, quần đàn 1 và 2 có giá trị là 0,2498 còn quần đàn 9 và 2 cũng có giá trị rất cao
0,2720, tương tự quần đàn 2 vớ
i quần đàn 7 cũng lớn (0,2116), đây là những quần đàn không gần

các locus, còn trong mỗi quần đàn là từ 0,63 đến 0,69. So sánh locus IGF-MSO3 và locus UNH216
với cùng locus này ở các nghiên cứu trước cho thấy chúng không dao động nhiều, ở nghiên cứu này
là 0,77 và 0,73 tương ứng, còn locus IFG-MSO3 là 0,89 trong báo cáo của Yue & Orban (2002) và
UNH126 là 0,56 – 0,76 ở nghiên cứu của Romana-Eguia và ctv (2005). Tần số dị hợp tử của 9 quần
đàn nghiên cứu này không khác nhiều so với các nghiên cứu trước đây trên cùng các locus.
Dựa vào khoả
ng cách di truyền và cây di truyền, có thể phân biệt được là quần đàn cá rô phi nào
mang vật liệu di truyền gần nhau. Việc này có thể rất hữu ích cho công tác lai tạo trong các quần
đàn và giữa các quần đàn.
5. Tài liệu tham khảo
Agnese, J. F., AdepoGourene, B., Abban, E. K., & Fermon, Y. (1997). Genetic differentiation
among natural populations of the nile tilapia Oreochromis niloticus (Teleostei, Cichlidae).
Heredity, 79, 88-96.
Agnese, J. F., Adepo-Gourene, B., Owino, J., Pouyaud, L., & Aman, R. (1999). Genetic
characterization of a pure relict population of Oreochromis esculentus, an endangered
tilapia. Journal of Fish Biology, 54(5), 1119-1123.
FAO. (2005). Food and Agriculture Organisation Yearbook of fishery statistics summary tables,
from
ftp://ftp.fao.org/fi/STAT/summary/default.htm#aqua
Hassanien, H. A., & Gilbey, J. (2005). Genetic diversity and differentiation of Nile tilapia
(Oreochromis niloticus) revealed by DNA microsatellites. Aquaculture Research, 36(14),
1450-1457.
Miller, M. P. (1997). Tools for population genetic analyses {TFPGA} 1.3. A window program for
the analysis of allozyme and molecular population genetic data. Computer software
distributed by author.
O'Connell, M., & Wright, J. M. (1997). Microsatellite DNA in fishes. Reviews in Fish Biology and
Fisheries, V7(3), 331-363.
Palti, Y., Shirak, A., Cnaani, A., Hulata, G., Avtalion, R. R., & Ron, M. (2002). Detection of genes
with deleterious alleles in an inbred line of tilapia (Oreochromis aureus). Aquaculture,
206(3-4), 151-164.