NGUYỄN THỊ THOA – Kết quả tạo phôi lợn trong ống nghiệm

1

KẾT QUẢ TẠO PHÔI LỢN TRONG ỐNG NGHIỆM SỬ DỤNG
MÔI TRƯỜNG NCSU-37 10%PFF.
Nguyễn Thị Thoa,
*
Lưu Ngọc Anh, Vũ Thị Hương, Trần Sơn Hà,
Đỗ Văn Hương và Nguyễn Thị Hương
Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào động vật - Viện Chăn nuôi

*Tác giả liên hệ: Nguyễn Thị Thoa - Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ tế bào động vật
Viện Chăn nuôi - Thụy phương - Từ Liêm - Hà Nội
Tel: (04) 22.166.165 ; Fax: (04) 38.389.775; Email: [email protected]
ABSTRACT
Porcine embryo production by in vitri fertilization of oocytes matured in vitro using NCSU – 37
supplemented with 10% porcine follicular fluid (PFF)
Porcine embryo in vitro production (IVP) systems included in vitro maturation (IVM) of oocytes and in vitro
fertilization (IVF) and their subsequent in vitro culture (IVC), have been carried out by the researchers in
National Institute of Animal Husbanry (NIAH). The study had been applied IVP procedures of Dr. Kazuhiro
Kikuchi et al. (National Institute of Agrobiological Resources, Department of Genetic Resources II, Japan). We
collected cumulus-oocyte complexes (COCs) of porcine ovaries from the slaughterhouses. Porcine COCs were
matured in IVM1 at 38.5
0
C in humidified condition of 5% CO
2
in air for 20-22h and then cultured in IVM2 for
24h. Only the oocytes with expanded cumulus cells were used for in vitro fertilization. The boar frozen semen
was used for porcine IVF procedure. The co-incubation for fertilization was carried out for 3 hours at 38.5

phận để chuyển vào người nhận. Kỹ thuật tạo phôi lợn kết hợp với CTP là cơ sở cho những
nghiên cứu này. Vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu tạo phôi lợn trong ống
nghiệm TTON sử dụng dịch nang trứng (PFF)’’ nhằm nghiên cứu ứng dụng thành công tạo
phôi lợn trong ống nghiệm sử dụng môi trường NCSU-37 10% PFF tại Việt Nam.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 19-Tháng 8-2009 2

Vật liệu nghiên cứu
Buồng trứng lợn thu ở lò mổ, tinh lợn dạng cọng rạ đông lạnh, các loại môi trường, tủ nuôi
cấy, máy ly tâm, kính hiển vi soi nổi, bình ổn nhiệt, tủ vô trùng và các dụng cụ vô trùng khác
dùng một lần.
Phương pháp nghiên cứu
(Theo phương pháp của Kazuhiro KIKUCHI-and Yasuhiro Kawai. Viện KHNN, Nhật Bản)
Chuẩn bị các môi trường cho TTON
Môi trường Dulbecco Phosphate Buffered saline (Nagai và cs, 1988)
Môi trường khai thác trứng M-199 Air, (Nagai và cs, 1988)
Môi trường cơ bản NCSU (Petters và Wells, 1993)
Môi trường nuôi trứng chín NCSU -37 cho IVM (Funahashi và cs, 1996, Kikuchi và cs, 1999)
Môi trường hoạt hoá tinh trùng 199/PH 7,8 (Nagai và cs, 1988)
Môi trường Pig - FM cho TTON (Suzuki và cs, 2000)
Môi trường IVC1, IVC2 (Kikuchi và cs, 1999)
Thu buồng trứng từ lò mổ
Lợn sau khi giết thịt, ngay lập tức cắt buồng trứng rửa sạch và cho vào túi ni lông có chứa
dung dịch đệm Dulbecco Phosphate Buffered không có Ca và Mg (PBS-) bổ sung kháng
sinh, buộc chặt túi và cho vào phích nước 35˚C -38˚C, đưa về phòng thí nghiệm.
Thu tế bào trứng từ buồng trứng


cho vào ống Falcol (1), lấy 200 l môi trường trong ống Falcol (1) cho vào ống Falcol (2),
ủ ấm cả 2 ống trong nước 37˚C. Lấy cọng rạ tinh đông lạnh ra khỏi bình nitơ cho vào nước
ấm 37˚C trong 30giây, cắt đầu cọng rạ cho tinh trùng vào ống Falcol (1) ly tâm 2000 v/phút
trong 2 phút, hút bỏ phần trên lấy phần cặn. Bổ sung 60µl 199- PH 7,6-7,7 ở ống Falcol (2)
cho vào ống Falcol (1) trộn đều, lấy 60µl cho vào đĩa 0.35mm phủ dầu khoáng cho vào tủ
incubator ủ trong 15 phút. Tính nồng độ tinh trùng cần cho thụ tinh, đếm số lượng tinh trùng
bằng buồng đếm Thoma pha loãng tinh trùng bằng môi trường Pig-FM điều chỉnh số lượng
tinh trùng (100.000 tinh trùng/1ml )
Thụ tinh ống nghiệm
Môi trường TTON Pig-FM có bổ sung caffeine anhydrous và BSA (fattyacid free - Sigma).
Tế bào trứng sau khi nuôi chín trong môi trường IVM2, chọn những trứng có tế bào Cumulus
phát triển rửa 3 lần trong môi trường Pig-FM, sau đó chuyển sang giọt (Pig-FM) và cho vào
tủ nuôi 38,5˚C có 5% CO
2
ẩm độ tối đa, lấy 10µl dung dịch tinh trùng đã hoạt hoá cho vào
mỗi giọt thụ tinh (Pig-FM đã có tế bào trứng). Tiến hành ủ tinh trùng và trứng trong 3 giờ ở
38,5˚C có 5% CO
2
ẩm độ tối đa.
Sau thụ tinh 3 giờ, rửa hợp tử giả định 3 lần trong môi trường IVC1 (IVC-Pyruvat lactac) để
loại bỏ những tế bào cumulus và tinh trùng bám vào màng trong suốt. Sau đó, hợp tử giả định
được truyền vào môi trường nuôi IVC-PyrLac nuôi ngày 0 đến ngày 2 và môi trường ICV2-
Gluco ngày 2 đến ngày 6 trong tủ nuôi cấy ở 38,5˚C có 5% CO
2
, ẩm độ 99%. Chúng tôi đánh
giá sự phát triển của trứng qua quan sát sự giãn nở của tế bào Cumulus, khả năng thụ tinh qua
sự hình thành 2 thể cực và phát triển đến 2-4 tế bào từ ngày 0-2, tỷ lệ phôi dâu và phôi nang
qua sự phát triển của phôi từ ngày thứ 2 đến ngày 6.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

6 215
152
70,7 35 16,27 28 13,02
7 212
166
78,30 32 15,09 12 5,66
Tổng số 1392
915
65,73 232 16,66 159 11,42
Có 3 loại tế bào Cumulus
Loại 1: trên 80% tế bào Cumulus giãn nở đều, màu sáng
Loại 2: 65-80% tế bào Cumulus giãn nở đều, màu sáng

VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 19-Tháng 8-2009 4

Loại 3: dưới 65% tế bào Cumulus giãn nở đều, màu sáng
Bảng 2. Kết quả tạo phôi ống nghiệm
Đợt
TN
Trøng cho
TTON
Phôi 2- 4 tế bào
(Ngày 0-2)
Phôi ngày 6
sau thụ tinh
(n) (n) (n) % Phôi dâu (n) % Phôi nang (n) %
1

Những yếu tố sinh trưởng, (như yếu tố sinh trưởng biểu mô) kích thích sự giãn nở của tế bào
cumulus và sự thành thục của trứng. (Yokoo và Sato, 2004) cho rằng sự giãn nở của các tế
bào Cumulus giúp cho noãn bào ngăn ngừa stress oxy hoá, đẩy nhanh tốc độ trứng thành thục.
Sự đa dạng các nhân tố peptide, các hormone steroid ngoại bào và̀ các tế bào cumulus đã làm
tăng khả năng chín nhân, tế bào chất của trứng và khả năng phát triển tiếp theo sau khi thụ
tinh. Theo (Yokoo và Sato, 2004) cho rằng, khả năng nuôi trứng chín có mối quan hệ chặt
chẽ với khả năng giãn nở tế bào Cumulus, sự giãn nở của các tế bào Cumulus đẩy nhanh tốc
độ thành thục của trứng và sự phân chia bình thường của hợp tử sau khi IVF.
Theo (Yoshida và cs, 1993) vai trò của PFF trong môi trường nuôi làm gia tăng tỉ lệ chín
nhân. Từ các nhận định trên cho thấy PFF có tác dụng rất lớn để nâng cao khả năng phát triển
của trứng lợn in vitro. Những tế bào trứng nuôi chín invitro sau 44 giờ đươc đánh giá bằng
nhiều phương pháp. Có thể nhuộm tế bào sau khi nuôi để kiểm tra sợi nhiễm sắc và cấu trúc
nhân. Có thể quan sát sự giãn nở khối tế bào cumulus qua kính hiển vi soi nổi sau khi nuôi 42-
44 giờ. Loại bỏ tế bào cumulus sau khi nuôi để quan sát sự hình thành thể cực.
Trong nghiên cứu này chúng tôi đánh giá trứng chín qua quan sát sự giãn nở và màu sáng của
khối tế bào Cumulus và một số lớp tế bào vành phóng xạ bám vào vành trong suốt trên kính
hiển vi soi nổi có độ phóng đại 400 lần. Tổng số 1392 tế bào trứng đem nuôi, có 915 tế bào
trứng chín đạt tỷ lệ 65,73% thấp hơn so với kết quả của (Suzuki và cs, 2006); (Tatemoto và
cs, 2004); tương ứng 65,73% so với 70,0% và 73 - 74%). Tỷ lệ trứng chín trong nghiên cứu
của chúng tôi chưa ổn định, dao động từ 50 - 78,30%. Kết quả này có thể do ảnh hưởng của
nhiều yếu tố, trong đó ảnh hưởng của việc sử dụng các mẻ dịch nang khác nhau có vai trò

NGUYỄN THỊ THOA – Kết quả tạo phôi lợn trong ống nghiệm

5

quan trọng. Theo (Rui-Hua Liu và cs, 2004), dich nang trứng trứng thu được ở những nang
lớn có hàm lượng estradiol cao hơn đáng kể so với dịch các nang nhỏ. Nồng độ progesterone
tồn tại trong dịch nang của nang lớn cũng cao hơn so với dịch nang từ nang trung bình và
nang nhỏ. Những yếu tố này ảnh hưởng đến sự phát triển của tế bào trứng.

Kikuchi K, Kashiwasaki N, Noguchi J, Shimada A, Takahashi R, Hirabayashi M, Shino M, Ueda M, Kaneco H,
(1990). Developmental competence, after transfer to recipients of porcine oocytes matured, fertilized,
and cultured in vitro. Biology of Production 1999; 60: p. 336-340.
Nagai T,Takashi T, Masuda H, Shioya Y, Kuwayama M, Fukushima M, Iwasaki S and Hanada A, (1988).
In vitro fertilization of pig oocytes by frozen boar spermatozoa. J Reprod Fertil 1988; 84: p.585-591.
Peters RM, Wells .K.D, (1993). Culture of pig embryo. J Reprod Fertil Suppl 1993; 48: p.61-73.
Suzuki K, Erikson B. Shimizu H, Nagai T, Rodriguez-Martinez H, (2000). Effect of hyaluronan on monospermic
penetration of porcine oocytes fertilized in vitro. Int J Androl 2000; 23: p.13-21.

VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 19-Tháng 8-2009 6

Suzuki M, Misumi K, Manabu O, Noguchi, Kaneko H, Ohnuma K, Fuchimoto D, Onishi A, Iwamoto M, Saito
N, Nagai T, Kikuchi K, (2006). Successful piglet production by IVF of oocytes matured in vitro using
NSCU-37 supplemented with fetal bovine serum. Theriogenology 2006; 65: p.374 - 386.
Tatemoto H, Muto N, Sunagawa, Shinjo, Nagai N, (2004). Protection of porcine oocytes aganst cell Damage
caused by oxidative stress during in vitro maturation: Role of superoxide dismutase activity in porcine
follicular fluid. Biol Reprod 2004;71: p.1150-1157.
Yokoo M, Sato E, (2004).Cumulus-oocyte complex interactions during oocyte maturation. Int Rev Cytol 2004;
235: p.251-291.
Yoshida M, Mizoguchi Y, Ishiaki K, Kojima T, Nagai T, (1993). Birth of piglets derived from in vitro
fertilization of pigs oocytes matured in vitro. Theriogenology 1993; 39: p.1303-1311.

*Người phản biện: GS.TS. Nguyễn Mộng Hùng; Ths. Luu Công Khánh