72
Chương 7
PHẢN ỨNG KẾT HỢP
KHÁNG NGUYÊN - KHÁNG THỂ
I. Cơ chế kết hợp kháng nguyên - kháng thể
Sự kết hợp kháng nguyên-kháng thể dịch thể đặc hiệu nhờ vào các
lực liên kết lý hóa sau:
* Lực liên kết các phân tử với nhau hay còn gọi là lực liên kết
Wander-Wals.
* Lực hút tĩnh điện giữa các nhóm chức khác nhau. Ví dụ giữa nhóm
amin và nhóm carboxyl.
* Lực liên kết giữa các cầu nối hydro với nhau
* Lực kỵ nước
Phản ứng kết hợp giữa kháng nguyên kháng thể không phải là một
phản ứng hóa học hoàn toàn, nên người ta có thể tách trở lại các thành phần
kháng nguyên và kháng thể.
II. Phản ứng ngưng kết - Agglutination test
1. Nguyên lý
Đây là phản ứng với các kháng nguyên hữu hình (ví dụ như xác vi
khuẩn). Khi găp kháng thể đặc hiệu, các kháng nguyên sẽ kết lại với nhau
thành đám lớn mà mắt thường có thể quan sát được. Đó là hiện tượng ngưng
kết trực tiếp,
Khi cơ thể được miễn dịch, trong huyết thanh có chứa nhiều kháng
thể đặc hiệu với kháng nguyên tương ứng. Khi cho kháng nguyên hữu hình
trộn với kháng thể
đặc hiệu tương ứng, thì các vi khuẩn sẽ kết lại với nhau
qua cầu nối kháng thể đặc hiệu. Do mỗi cầu nối với các kháng nguyên dưới
hình thức mạng lưới nhiều chiều, tạo nên những đám ngưng kết biểu hiện

73

A - Không xẩy ra khi cả 2 vị trí của IgG đều gắn vào một
xác vi khuẩn
B - Xảy ra khi IgG trở thành cầu nối giữa các xác vi khuẩn
C - Rất dễ xảy ra khi kháng thể là loại IgM 74
Dùng một phiến kính, nhỏ một giọt huyết thanh cần chẩn đoán, sau
đó nhỏ vào một giọt kháng nguyên đã biết, trộn đều, sau đó vài phút đọc kết
quả, nếu trong huyết thanh có kháng thể tương ứng, thì kết hợp kháng
nguyên kháng thể tạo thành đám ngưng kết, nếu kháng nguyên được nhuộm
màu, thì đám ngưng kết có màu cụm lại, xung quanh nhạt màu hơn.
2.2. Phản ứng ngưng kết chậm trong ống nghiệm
Là phản ứng vừa có tính định tính vừa có thể định lượng được hàm
lượng kháng thể.
Dùng một loạt ống nghiệm, mỗi ống cho vào một lượng không đổi
huyết thanh có độ pha loãng khác nhau theo cơ số 2 (1/2, 1/4, 1/8, 1/16 )
hoặc theo cơ số 10 (1/10, 1/100, 1/1000, 1/10.000 ) sau đó cho vào mỗi ống
nghiệm một lượng tương đương kháng nguyên, để ở nhiệt độ thích hợp theo
yêu cầu của phản ứng, sau 30 phút hoặc vài giờ đọc kết quả và tính được
hiệu giá ngưng kết. Hiệu giá ngưng kết là độ pha loãng cao nhất mà ở đó vẫn
xảy ra hiện tượng ngưng kết.
2.3. Phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ động
Khi dùng một kháng nguyên hòa tan để phát hiện một kháng thể
tương ứng trong phản ứng ngưng kết, phải cần đến tế bào mang, người ta
thường dùng hồng cầu, hạt chất dẻo như hạt latex, bentonit
Nguyên lý: Làm cho kháng nguyên hòa tan trở thành kháng nguyên
hữu hình, bằng cách gắn kháng nguyên vào hồng cầu, như vậy hồng cầu
đóng vai trò là giá đỡ cho kháng nguyên, khi kháng nguyên đã gắn trên
hồng cầu thì kháng nguyên đó trở thành kháng nguyên hữu hình và phản

hồng cầu của vi rút. Còn nếu vi rút không gặp kháng thể đặc hiệu tương ứng,
vi rút sẽ không bị trung hòa và vi rút sẽ làm hồng cầu ngưng kết lại với nhau.
- Phương pháp tiến hành phản ứng: th
ường dùng vi rút đã biết để
làm phản ứng HI với huyết thanh cần chẩn đoán. Phản ứng vừa có tính chất
định tính vừa có tính chất định lượng.
Vi rút được pha với nồng độ 4 đơn vị HA (Haemagglutination).
Hình 21. Phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ động 76
Huyết thanh được pha loãng theo cơ số 2: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 hoặc
theo cơ số 10 : 1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000
Cho hỗn hợp vi rút và huyết thanh ở mỗi nồng độ với lượng nhất
định, để ở nhiệt độ thích hợp.
Sau một thời gian 10-20 phút, cho một lượng hồng cầu pha loãng
từ 0,5-1% với một lượng nhất định vào tất cả các ống.
Đọc kết quả sau 15-30 phút
Phản ứng dương tính: Hồng cầu lắng xuống đáy thành cục tròn đỏ, chứng tỏ
huyết thanh tương ứng với vi rút.
Phản ứng âm tính: Hồng cầu bị ngưng kết thành mạng, chứng tỏ
huyết thanh không tương ứng với vi rút, nên vi rút đã làm ngưng kết hồng
cầu.
III. Phản ứng kết tủa (Precipitation test)
1- Nguyên lý: Giống phản ứng ngưng kết, chỉ khác là kháng nguyên trong
phản ứng này là kháng nguyên hòa tan được trộn với kháng thể dịch thể
tương ứng, cũng là chất hòa tan trong huyết thanh.
Nếu thiếu hoặc thừa một trong 2 thành phần này thì sự kết tủa khó
xảy ra, sự kết tủa biểu hiện bằng chất cặn màu sáng trắng dễ quan sát được.
Phản ứng kết tủa cũng cần có một số điều kiện như: nhiệt độ, pH,


Dung dịch
kháng nguyên

Vòng ngưng kết Kháng huyết
thanh
Kháng
huyết thanh
0,5ml

Kháng nguyên
0,5ml
Kháng
nguyên
âm 0,5ml
Kháng nguyên
Vòng trắng đục
Kháng huyết

Kháng
nguyênVùng
trung
gian Kháng
thể
Hình 23. Miễn dịch khuếch tán đơn (A) và miễn dịch khuếch tán
kép (B) trong ống nghiệm

79
Nguyên lý: Lợi dụng tính chất khuếch tán của chúng về phía nhau,
rồi gặp nhau, kết hợp với nhau bão hòa và kết tủa ở vùng có tỷ lệ tương ứng
đồng đều giữa kháng nguyên và kháng thể.
Phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch ống nghiệm (Kỹ thuật
Oudin):
Có thể chia làm hai loại: Phản ứng kết tủa khuếch tán đơn và kép.
Phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch đơn
Thạch đã trộn sẵn kháng thể (hoặc kháng nguyên) rồi cho vào trong
ống nghiệm trước, sau đó cho lên mặt thạch một lượng dung dịch kháng
nguyên (hoặc kháng thể).
Kháng nguyên (hoặc kháng thể) sẽ khuếch tán vào trong thạch đi
xuống phía dưới và sẽ gặp kháng thể (hoặc kháng nguyên) đã có trong đó


I II
Hình 24a (Theo
Ian R. Tizard. 2004)
I. Định hiệu giá huyết thanh II. Định hiệu gía kháng nguyên
1 - Kháng nguyên 1 - Kháng thể
2, 3, 4, 5, 6 - kháng thể pha loãng 2, 3, 4, 5, 6 - kháng thể pha loãng
lần lượt từ: 1/2, 1/4, 1/8, 1/32 lần lượt từ: 1/2, 1/4, 1/8, 1/32
I II
Hình 24b (Theo
Ian R. Tizard. 2004)
I. Định loại kháng nguyên II. Định loại kháng thể
1 - Kháng thể đã biết 1- Kháng nguyên đã biết
2, 3, 4, 5 - kháng nguyên chưa biết 2, 3, 4, 5 - kháng thể chưa biết
6 - kháng nguyên tương ứng 6 - kháng thể tương ứng

Ian R. Tizard. 2004)
A B C
Hình 25. Hiện tượng hai kháng nguyên: Không đồng nhất (A); đồng
nhất (B); đồng nhất một phần (C) phát hiện bằng phản ứng
Ouchterlon
y

82
Nhận định kết quả được căn cứ vào đường kết tủa, có thể có 3
trường hợp sau:
Các lỗ chứa kháng nguyên đều đồng nhất và tương ứng với kháng
thể thì các đường kết tủa sẽ gặp nhau và nối liền nhau.
Nếu hai lỗ chứa kháng nguyên chỉ có một phần tương ứng với một
phần khác của kháng thể thì sẽ xuất hiện hai đường kết tủa cắt nhau, tức là
các kháng nguyên không có liên quan với nhau.
Nếu 2 lỗ chứa kháng nguyên có liên quan một phần cùng có chung
một nhóm quyết định X (KN XY và KNXZ) phản ứng với một hỗn hợp
kháng thể chống XY, sẽ tạo ra 2 đường kết tủa gặp nhau, nhưng một đường
dài và một đường ngắn hơn (giống hình cựa gà).
1.5. Phương pháp điện di miễn dịch (Electrophoresis)
Là phương pháp cải tiến của phương pháp kết tủa khuếch tán trong
thạch nhưng sử dụng điện trường để cho kháng nguyên và kháng thể gặp
nhau, phương pháp này thực hiện qua 2 giai đoạn. Giai đoạn 1, tách rời từng
thành phần kháng nguyên trước bằng điện di. Giai đoạn 2, miễn dịch

thể sẽ chiếm lấy bổ thể, không còn bổ thể cho hệ thống 2, nên không có sự
dung huyết, hồng cầu đóng thành cục tròn đỏ dưới đáy ống nghiệm. Phản
ứng dương tính, tức con vật có kháng thể tương ứng với kháng nguyên.
- Nếu ở hệ thống 1 không có sự kết hợp kháng nguyên kháng thể
do trong huyết thanh không có kháng thể tương ứng, thì bổ thể sẽ không
được dùng cho hệ thống 1, bổ thể còn sẽ tham gia vào hệ thống 2 làm tan
hồng cầu, tạo nên huyễn dịch có màu đỏ. Phản ứng âm tính, tức là trong
huyết thanh không có kháng thể tương ứng.
V. Phản ứng trung hòa
1. Phản ứng trung hòa độc tố
Độc tố của vi khuẩn khi được vô độc bằng formol thì trở thành giải
độc tố, không còn tính độc nhưng vẫn còn tính kháng nguyên cao, nên
người ta thường dùng giải độc tố làm vắc xin, và khi tiêm cho cơ thể,
chúng kích thích cơ thể sinh kháng thể rất tốt. Khi kháng thể đặc hiệu
Hình 26. Nguyên lý của phản ứng kết hợp bổ thể
(Theo Ian R. Tizard. 2004).
Nếu bổ thể kết hợp với KN-KT sẽ không xảy ra hiện tượng tan hồng
cầu. Nếu không có kháng thể để kết hợp thì bổ thể sẽ làm tan hồng cầu

84
này gặp độc tố tương ứng chúng sẽ kết hợp và làm cho độc tố đó không
còn hoạt tính nữa hay còn gọi là độc tố đã bị trung hòa.
Huyết thanh chứa kháng thể kháng độc tố được gọi là huyết thanh
kháng độc tố và được sử dụng vào mục đích chữa bệnh. Khi tiêm huyết
thanh kháng độc tố vào cơ thể, nếu gặp độc tố, chúng sẽ kết hợp và trung
hòa độc tố đó, đây là phản ứng trung hòa trên cơ thể.
Nếu cho kháng độc tố (kháng thể đặc hiệu chống độc tố) kết hợp
với độc tố tương đương, thì phản ứng trung hòa sẽ xảy ra, nếu thực hiện in
vitro trong ống nghiệm, sẽ thấy phức hợp miễn dịch này biểu hiện như
những cụm bông lơ lửng, vì vậy người ta gọi là phản ứng lên bông.

loãng. Bằng phương pháp này người ta xác định được hiệu giá của huyết
thanh trung hòa.
Phản ứng trung hòa rất có ý nghĩa, người ta có thể sử dụng để định
typ virus, định lượng kháng thể, chuẩn độ liều gây nhiễm hoặc liều gây
chết 50% đối tượng thí nghiệm của một loại virus.
VI. Các phản ứng sử dụng kháng thể đánh dấu

Trong nhiều trường hợp để phát hiện phức hợp kháng nguyên-
kháng thể cần phải sử dụng một số kỹ thuật mới nhìn thấy được. Người ta
thường dùng những ký thuật sau đây:
Phản ứng miễn dịch huỳnh quang: Dùng thuốc nhuộm huỳnh
quang để nhuộm kháng thể rồi cho kết hợp với kháng nguyên (trực tiếp
hoặc gián tiếp) và phát hiện phức hợp kháng nguyên-kháng thể bằng kính
hiển vi huỳnh quang.
Phản ứng miễn dịch đánh dấu enzym hay gọi là phản ứng ELISA.
1. Phản ứng miễn dịch huỳnh quang (Immuno-fluorescent test)
Khi kháng thể hoặc kháng-kháng thể được nhuộm màu bằng thuốc
nhuộm huỳnh quang (thường dùng Fluoescein isothiocyanat có màu xanh
lục, rodamin có màu đỏ gạch) cho kết hợp với kháng nguyên, thì phức hợp
kháng nguyên- kháng thể khi soi dưới kính hiển vi huỳnh quang sẽ phát
sáng. Thuốc nhuộm huỳnh quang phải đạt các tiêu chuẩn:
Không làm tổn thương tới tính sinh miễn dịch của kháng thể.
Kết hợp với kháng thể một cách bền vững.
Với một lượng ít nhưng có màu sắc rõ rệt

86
Thuốc dễ sử dụng và dế phân biệt với các mầu khác.
1.1. Phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp
Trong phản ứng này thường dùng kháng thể đặc hiệu nhuộm màu
để phát hiện kháng nguyên chưa biết.

Immunosorbent Assay).
Đây là một trong nhữnng phương pháp quan trọng được ứng dụng
rộng rãi trong chẩn đoán thú y.
2.1. Phản ứng ELISA gián tiếp tìm kháng thể
Nguyên lý: Các giếng của khay nhựa được phủ sẵn kháng nguyên.
Kháng nguyên phải được gắn chặt vào khay nhựa sao cho sau khi
rửa phải còn một lớp kháng nguyên phủ trong các giếng. Nhỏ huyết thanh
(cần kiểm tra) vào các giếng, nếu trong huyếtt thanh có kháng thể đặc hiệu
Hình 27. ELISA sandwich. Kháng nguyên được gắn vào khay
nhựa bởi kháng thể. Sự có mặt của kháng nguyên được xác
định bằng kháng thể thứ 2 và kháng - kháng thể đã gắn enzyme
(Theo Ian R. Tizard. 2004)

88
thì kháng thể sẽ kết hợp với kháng nguyên được pha sẵn trong giếng. Sau

89 Hình 28. ELISA gián tiếp. Kháng nguyên được gắn trực tiếp
vào khay. Sự có mặt của kháng thể sẽ được xác định bằng
kháng kháng thể đã gắn enzyme. Sau khi thêm cơ chất phản

là bước điện di trong gel để tách các loại protein riêng biệtt. Bước 2:
Chuyển các protein lên giấy thấm. Bước 3 là phát hiện kháng nguyên bằng
phản ứng miễn dịch enzyme: Màng được ủ trong huyết thanh có chưa kháng
thể nguyên. Sau khi rửa, kháng kháng thể gắn enzyme được bổ sung vào và
màu sẽ xuất hiện (tại những dải có chứa kháng nguyên tương ứng với kháng
thể) sau khi được gặp cơ chất enzyme thích hợp.