Chương 5 PHƯƠNG PHÁP PCR
(POLYMERASE CHAIN REACTION)
1. Nguyên tắc của phương pháp PCR:
DNA polymerase thực hiện tổng hợp mạch mới từ DNA mạch khuôn
cần sự hiện diện của mồi chuyên biệt.
Mồi: đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của
mạch khuôn.
Nhiệt độ nóng chảy của mồi: Tm (ở nhiệt độ này, 50 % DNA mạch đôi
bị tách mạch thành mạch đơn). T
m
= 4(G + C) + 2(A + T) °C
Nếu cung cấp 2 mồi chuyên biệt (mồi xuôi và mồi ngược) bắt cặp bổ
sung với 2 đầu của một trình tự DNA, DNA polymerase sẽ xúc tác
tổng hợp đoạn DNA nằm giữa 2 mồi.
2. Phản ứng PCR:

Thành phần phản ứng:
- DNA bản mẫu
- Mồi xuôi và mồi ngược
- dNTP (gồm 4 loại: dATP, dGTP, dTTP, dCTP)
- MgCl
2
- Enzyme polymerase (Taq polymerase, Pfu…)
- Dung dịch đệm.
- Nước cất 2 lần (đã khử trùng)

Các bước của phản ứng:
Là một chuỗi nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 bước:
Bước 1: Biến tính (denaturation)
DNA được biến tính ở nhiệt độ cao, thường là 94 – 95
0

Enzyme Pfu DNA polymerase thu nhận từ vi khuẩn Pyroccus
furiosus có khả năng chịu nhiệt cao hơn, có hoạt tính 3’-5’
exonuclease.
-
Tth polymerase, tách chiết từ Thermus thermophilus, có khả năng
phiên mã ngược khi có RNA và Mn2+, khi có DNA và Mg2+ thì
enzyme này thực hiện khuếch đại DNA.

Mồi và nhiệt độ lai T
a
- Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất, quyết định tính đặc hiệu của phản
ứng.
-
Khi thiết kế mồi cần chú ý: thành phần GC, khả năng bắt cặp bổ
sung giữa “mồi xuôi” và “mồi ngược”, khả năng tạo cấu trúc “kẹp
tóc”.
-
Tm của 2 mồi không cách biệt quá xa.
-
Mồi đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại và không bắt cặp
với trình tự khác trên gen.

Các thành phần khác của phản ứng:
-
dNTP: thường sử dụng ở nồng độ là 20 -200 µM đối với mỗi loại.
-
Mg
2+
: quá ít


sản phẩm PCR tạo ra ở từng thời điểm.
Nguyên tắc: xác định hàm lượng sản phẩm dựa trên tín hiệu huỳnh
quang.
-
PCR nested: sử dụng nhiều hơn một cặp mồi

thu nhận sản phẩm đặc hiệu hơn.