

-ΩΩ*ΩΩ- Công nghệ DNA tái tổ hợp Nhập môn Công nghệ sinh học
31
Chương 2



Nhập môn Công nghệ sinh học
32
1. Tách các đoạn DNA từ genome
Phương pháp này được thực hiện như sau: DNA hệ gen (genomic
DNA) của một sinh vật được cắt thành các đoạn nhỏ dài khoảng 20 kb (kích
thước thích hợp tùy thuộc vào loại vector nhận chúng) bằng enzyme hạn chế
rồi gắn vào vector để xây dựng thư viện genome (genomic library).
Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae
.
Thông thư
4 bp, ví dụ như Mbo - -
.
(clone).
.
Nhập môn Công nghệ sinh học
33
(physical mapping).

2. Sinh tổng hợp cDNA từ mRNA
Đoạn DNA được tổng hợp dựa trên khuôn mẫu mRNA được gọi là
cDNA (complementary DNA). ba
như sau:
- .
- - 2 (Mg
2+
.
- .
mRNA-cDNA (khi tổng hợp sợi th E.
coli


2.1.

PCR là một kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong công nghệ sinh học
hiện đại và đã đóng góp rất lớn cho những tiến bộ về sinh học phân tử, đánh
dấu một bư
các enzyme hạn chế và kỹ thuật Southern blot (phân tích DNA).
AAAAAA 3’ mRNA
AAAAAA 3’ mRNA


Mô
(ví dụ: não)
Sinh tan tế bào
và tinh sạch mRNA
Nhập môn Công nghệ sinh học
35
in vitro đ
- đ
20 nucleotide.

▪ Nguyên tắc của PCR
Taq polymerase là một loại enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (có ở
vi khuẩn chịu nhiệt độ cao Thermus aquaticus
tide (dATP,
dCTP, dGTP và dTTP) và hai primer, trên cơ sở khuôn mẫu của một đoạn
DNA nhất
, nhờ vậy có thể đủ số lượng để
tách ra, phân tích trình tự hoặc tạo dòng. P
DNA 3’ -
5’
- ).
Nguyên tắc của PCR được trình
đầu tạo ra các đoạn DNA có chiều dài xác
định. Nếu biết trình tự của đoạn gen cần khuếch đại thì có thể tổng hợp nhân
tạo các primer tương ứng để thực hiện PCR và tách chúng ra bằng kỹ thu
- , qua đó từ 10
-6
g
DNA ban đầu có thể khuếch đại lên tới trên 1

. Các primer ở các vị trí không bắt cặp chính xác lại bị rời ra (do
nhiệt đ . Enzyme Taq
polymerase bổ sung các dNTP từ 5’ 3’.

III. Tạo dòng (gắn) đoạn DNA/gen vào vector
1. Enzyme hạn chế
Việc phát hiện ra các enzyme hạn chế (restriction enzyme) của vi
khuẩn cắt DNA ở những trình tự đặc trưng, đã giúp cho việc thao tác gen dễ
dàng hơn, vì nó có thể giảm chiều dài của các phân tử DNA thành một tập
hợp bao gồm các đoạn ngắn hơn.
Các enzyme hạn chế hiện diện trong hầu hết các tế bào vi khuẩn để
ngăn cản DNA ngoại lai (của bacteriophage) tiếp quản bộ máy tổng hợp
Gen đích
DNA khuôn mẫu
Khuếch đại theo hàm mũ
Chu kỳ 35
2
2
= 4 2
3
= 8 2
4
= 16 2
36
= 68 tỷ bản sao
bản sao bản sao bản sao
Nhập môn Công nghệ sinh học
37
protein của tế bào. DNA của chính chúng sẽ được bảo vệ khỏi tác dụng của
enzyme hạn chế, nhờ sự có mặt của các enzyme nội bào có thể methyl hóa


(B1)
(B2)
Hình 2.3. Các kiểu cắt và nhận biết trình tự nucleotide của enzyme hạn chế.
(A1): tạo ra đầu bằng và (A2): tạo ra đầu so le với trình tự 6 nucleotide. (B1): tạo
ra đầu bằng và (B2): tạo ra đầu so le với trình tự 4 nucleotide.

- Cắt trên một đường thẳng đối xứng để tạo ra các phân tử đầu bằng
(Hình 2.3, A1 và B1).
Nhập môn Công nghệ sinh học
38
- Cắt trên những vị trí nằm đối xứng quanh một đường thẳng đối xứng
để tạo ra những phân tử đầu so le (đầu dính) (Hình 2.3, A2 và B2).
Vì một enzyme hạn chế nhận biết một trình tự duy nhất, cho nên số vị
trí cắt trên một phân tử DNA đặc biệt thường là nhỏ. Các đoạn DNA được
cắt bởi enzyme hạn chế có thể được phân tách theo kích thước bằng điện di
agarose gel để nghiên cứu. Do sự tương tự của tổ chức phân tử trong tất cả
các cơ thể, cho nên DNA vi khuẩn, DNA thực vật và DNA động vật có vú
tương hợp nhau về cấu trúc. Vì thế, một đoạn DNA từ một dạng sống này có
thể dễ dàng được pha trộn với DNA của một dạng sống khác. Sự tương tự
này cũng phù hợp đối với plasmid, nhân tố di truyền ngoài nhân được tìm
thấy trong nhiều loài vi khuẩn khác nhau. Chúng là những phân tử DNA
mạch vòng đóng-sợi đôi được dùng làm vector mang các đoạn DNA ngoại
lai (foreign DNA) dùng trong kỹ thuật tái tổ hợp DNA.

2. Các vector được dùng để tạo dòng các đoạn DNA
in vitro
5’-PO
4
.

- . 3.000 bp, mang gen
Amp
r
, gen lacZ
.
- .
2.6).
Nhập môn Công nghệ sinh học
40 2.4. Plasmid vector pUC19. Vùng tạo dòng (từ 396-447) được gắn vào gen
lacZ’, nhưng không can thiệp vào chức năng của gen.

2.5. Plasmid vector pGEM -T Easy. Loại vector này đã được mở sẵn ở
vùng tạo dòng trên gen lacZ mang hai đầu T, thích hợp cho việc gắn các sản phẩm
PCR do chúng có mang hai đầu A.

AGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCATAATCATGGTCAT

EcoRI SacI KpnI BamHI XbaI HincII PstI SphI HindIII
SmaI
XmaI
AccI

…GGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTC… …CAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTGCGCGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCC
M13-20 primer binding site T7 primer binding site KS primer binding site…

…KS primer binding site… SK primer binding site

T3 primer binding site M13 reverse primer binding site
BssHII T7 Promoter KpnI DraII XhoI SalI
ApaI
EcoO1091
ClaI HindIII EcoRV EcoRI PstI SmaI BamHI SpeI XbaI EagI BstXI SacII SacI
Bsp1061 NotI
T3 Promoter BssHII β-gal α-fragment
Nhập môn Công nghệ sinh học
42
2.2. Bacteriophage vector
Có hai loại bacteriophage thường được sử dụng là và M13, tuy
nhiên chương này chỉ trình bày loại phổ biến hơn là bacteriophage .
Bacteriophage
cos
cos (R-cos và L-cos)
(lysis)

).


R
ori
A…………J b att int xis red gam cIII N cI cro cII O P Q S R
Các gen hình
thành đầu,
đuôi và phát
sinh hình thái
Vùng hợp nhất và tái tổ
hợp (vùng đệm)
Vùng điều hòa và
miễn dịch
Vùng sao
chép DNA
Vùng phân
giải vật chủ
Vùng điều hòa
chức năng muộn
R-cos
Nhập môn Công nghệ sinh học
43
-
.
khoảng 1/3 chiều dài của phage
phage
. Trên
phage vector
in vitro (in vitro
(Hình 2.8).
vector. Sợi đ
(ví dụ: đoạn Klenow của DNA polymerase
I của E. coli
ase 3’ -
(polymerase 5’ 3’
.
.

3.1.2. Các adapter
vector DNA .
Nhập môn Công nghệ sinh học
45


Nhập môn Công nghệ sinh học
46
3.2. Gắn các sản phẩm PCR
Trong một số trường hợp nhất định có thể thay thế phương pháp tạo
dòng truyền thống bằng phương pháp PCR, vì PCR cho phép sản xuất ra
một lượng lớn đoạn DNA mong muốn và sau đó có thể tạo dòng đoạn DNA
này trong các vector plasmid hoặc phage thích hợp. Phương thức tạo dòng
cho các sản phẩm PCR hoàn toàn giống tạo dòng các đoạn DNA thu được từ
những thao tác DNA truyền thống, và có thể được tạo dòng với đầu bằng
hoặc đầu kết dính (so le). DNA polymerase ổn nhiệt như Taq polymerase đã
khuếch đại các sản phẩm PCR có gốc A lồi ra ở đầu 3’. Như vậy, có thể tạo
dòng sản phẩm PCR vào trong các dT vector (được gọi là tạo dòng dA:dT).
Điều này cho thấy việc bổ sung các gốc A vào đầu cuối có thể giúp gắn
thành công sản phẩm PCR với vector đã được chuẩn bị các gốc T lồi ra
(Hình 2.10). Phản ứng được xúc tác bởi DNA ligase, như trong một phản
ứng gắn truyền thống.


transformation).

4.1. Điện biến nạp
Đây là kỹ thuật hiệu quả nhất để biến nạp vi khuẩn. Hai thông số quan
trọng của phương thức này là loại tế bào vi khuẩn và tần số xung điện cần
thiết. Thể tích của dung dịch tế bào thường được dùng là 30 µL (tương ứng
với nồng độ 10
10
tế bào E. coli/mL) có bổ sung 5 ng plasmid trong một
cuvette có khoảng trống điện cực (electrode gap) 0,1 cm. Hiệu suất biến nạp
của phương thức này lớn hơn 1 10
9
thể biến nạp/µg plasmid siêu xoắn và
khoảng 1 10
8
thể biến nạp/µg plasmid được dùng trong phản ứng gắn. Tần
số biến nạp khoảng 0,02 cho cả hai loại plasmid. Tần số biến nạp thấp đã
ngăn cản được sự đồng biến nạp (co-transformation) vào vi khuẩn của hai
hoặc nhiều phân tử plasmid.
Phương pháp điện biến nạp có một số ưu điểm sau:
- Hiệu suất biến nạp cao.
- Có thể dùng một thể tích dịch tế bào nhỏ. Thể tích dịch tế bào
khoảng 20 µL có thể cho hiệu suất khoảng 10
9
thể biến nạp.
- Phương pháp chuẩn bị tế bào biến nạp rất đơn giản, không sử dụng
các kỹ thuật phức tạp và tốn thời gian. Hơn nữa, các tế bào dùng để biến nạp
có thể được chuẩn bị trước và bảo quản vô hạn định mà không mất tính khả
biến.
Nhập môn Công nghệ sinh học

cần hiệu suất biến nạp cao hơn (ví dụ: xây dựng thư viện cDNA, xây dựng
thư viện phân tích trình tự DNA ) thì tốt hơn hết là dùng phương pháp điện
biến nạp. Tuy nhiên, nếu không có sẵn thiết bị biến nạp bằng điện thì vẫn có
thể thu được hiệu suất biến nạp cao bằng cách dùng các chủng vi khuẩn
thích hợp hơn cho mục đích này và có thể thu được hiệu suất 10
9
thể biến
nạp/µg plasmid.

IV. Chọn dòng mang DNA tái tổ hợp
Trong thí nghiệm tạo vector tái tổ hợp, hỗn hợp vector và một lượng
lớn phân tử DNA cắt cùng một enzyme hạn chế được gắn lại với nhau bằng
enzyme DNA ligase. Kết quả, hỗn hợp này có plasmid tái tổ hợp lẫn các
Nhập môn Công nghệ sinh học
49
plasmid không có gen ngoại lai chèn vào và chúng được trộn lẫn với các tế
bào vi khuẩn để thực hiện biến nạp. Sau đó, người ta chuyển tất cả lên môi
trường dinh dưỡng chọn lọc để chúng phát triển thành các dòng tức các
khuẩn lạc vi khuẩn. Do cách tiến hành thí nghiệm trong một hỗn hợp không
đồng nhất như vậy nên các dòng vi khuẩn mọc lên có ba loại như sau:
- Tế bào vi khuẩn không nhận plasmid.
- Tế bào vi khuẩn nhận plasmid không có gen ngoại lai chèn vào.
- Tế bào vi khuẩn nhận đúng plasmid tái tổ hợp.
Vì vậy, việc xác định đúng các dòng vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp
phải mất nhiều công sức. Có ba phương thức chính để xác định các dòng
DNA tái tổ hợp là lai khuẩn lạc và vết tan, khử hoạt tính bằng chèn đoạn, và
tạo dòng định hướng.

1. Lai khuẩn lạc và vết tan
DNA được tạo dòng trong plasmid sản xuất ra các khuẩn lạc khi các

ứng trên phim X-quang. (ví dụ: Amp
r
, lacZ của cắt bởi
E. coli
-galactosidase của gen lacZ
-
-gal sẽ có màu trắng do đoạn DNA ngoại lai chèn vào giữa gen lacZ
lacZ không bị mất hoạt tính (Hình 2.11). Hin Bam
của vector
Bam Hin
đ E. coli
(protruding ends) Hin Bam
E. coli
Nhập môn Công nghệ sinh học
51
- .
HI
Bam
HI
Bam
HI

Amp
rAmp
r

Gen
lacZ
mất hoạt tính
lacZ
Đoạn DNA
ngoại lai
chèn giữa
gen
lacZ
làm
gen
lacZ
mất
hoạt tính
Amp

r

Hình 2.12. Tạo dòng định hướng. Tet
r
: gen kháng tetracycline, Tet
s
: gen kháng
tetracycline bị khuyết đoạn và mất hoạt tính.

V. Biểu hiện của gen được tạo dòng
Muốn gen tạo dòng có biểu hiện tổng hợp protein cần cấu tạo vector
có đủ các yếu tố phiên mã và dịch mã. Các vector này được gọi là vector
Các thể biến nạp được
dàn mỏng trên môi

III
H B
B H

Amp
r

Tet
r

Amp
r

Tet
sH

B
H B
Amp
r

H

B

E. coli
E. coli
. Để biểu hiện tất cả các gen ngoại lai trong E.
coli phải bắt đầu bằng việc gắn đoạn gen ngoại lai vào trong vector biểu
hiện (thường là plasmid). Vector này phải có đủ các cấu trúc cần thiết sau:
- Các trình tự mã hóa gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker) để đảm
bảo duy trì vector trong tế bào.
- Một promoter kiểm soát phiên mã (ví dụ: lac, trp hoặc tac) cho phép
sản xuất một lượng lớn mRNA từ các gen được tạo dòng.
- Các trình tự kiểm soát dịch mã như vùng liên kết ribosome được bố
trí thích hợp và codon khởi đầu ATG.
- Một polylinker để đưa gen ngoại lai vào trong một hướng chính xác
với promoter.
Nhập môn Công nghệ sinh học
54
Chỉ khi được cấu trúc đầy đủ như thế, các vector biểu hiện mang gen
ngoại lai mới được biến nạp vào chủng E. coli thích hợp.
Tuy nhiên, cần lưu ý là số lượng các bản sao của vector phải hợp lý
đối với một tế bào vật chủ và nó có sự ổn định lâu dài, đồng thời cần tránh
sự thủy phân sản phẩm protein (proteolysis) do các enzyme của tế bào. Hình
2.13 mô tả một loại vector biểu hiện ở prokaryote.
Hình 2.13. Vector biểu hiện pRSET A ở prokaryote (E. coli) được thiết kế dựa
trên hệ thống biểu hiện promoter T7. Sự biểu hiện của các gen đích tạo dòng
trong vector được cảm ứng bằng cách sản xuất T7 RNA polymerase trong tế bào
vật chủ E. coli chủng BL21(DE). P
T7
-promoter mạnh của bacteriophage T7 cho