MỤC LỤC
MỤC LỤC i
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT iii
DANH MỤC CÁC BẢNG iv
DANH MỤC CÁC HÌNH vi
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ vii
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ DIẾP CÁ 3
1.1.1. Mô tả thực vật 3
1.1.2. Phân bố, sinh thái 3
1.1.3. Thành phần hóa học 4
1.1.4. Công dụng 5
1.1.5. Tác dụng dược lý và các nghiên cứu lâm sàng 5
1.1.6. Các chế phẩm có chứa Diếp cá trên thị trường 8
1.2. ĐIỀU CHẾ CAO THUỐC [7] 9
1.2.1. Chiết xuất 9
1.2.2. Cô đặc, sấy khô 10
1.2.3. Cao thuốc 11
1.3. XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU 12
1.3.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất 12
1.3.2. Mô hình thực nghiệm 13
1.3.3. Nghiên cứu liên quan nhân quả 14
1.3.4. Tối ưu hóa thông số quy trình 15
1.4. NỘI DUNG CỦA MỘT TIÊU CHUẨN CAO DƯỢC LIỆU [1] 16
CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, DUNG MÔI, TRANG THIẾT BỊ 18
2.1.1. Dược liệu và chất chuẩn 18
2.1.2. Hóa chất, dung môi 18
2.1.3. Trang thiết bị 18
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

3.4. KIỂM NGHIỆM CAO DIẾP CÁ 40
3.4.1. Hình thức cảm quan 40
3.4.2. Độ tan trong nước 40
3.4.3. Độ tan trong cồn 40
3.4.4. Cắn không tan trong nước 40
3.4.5. Độ ẩm 40
3.4.6. Độ tro 40
3.4.7. pH 41
3.4.8. Kim loại nặng (Pb) 41
3.4.9. Định tính 41
3.4.10. Định lượng 42
3.5. ĐỀ XUẤT TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM CAO DIẾP CÁ 43
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 45
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47
5.1. KẾT LUẬN 47
5.2. ĐỀ NGHỊ 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO 49
ii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
CHCl
3
Chloroform
CH
3
CN Acetonitril
DĐVN Dược điển Việt Nam
DL/DM Dược liệu/dung môi
HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid
Chromatography)
MeOH Methanol

Bảng 3.16. Cắn không tan trong nước của cao Diếp cá 40
Bảng 3.17. Độ ẩm của cao Diếp cá 40
Bảng 3.18. Tro toàn phần của cao Diếp cá 40
Bảng 3.19. Tro không tan trong acid hydrochlorid của cao Diếp cá 41
Bảng 3.20. Tro tan trong nước của cao Diếp cá 41
Bảng 3.21. pH của cao Diếp cá 41
Bảng 3.22. Giới hạn kim loại nặng cao Diếp cá 41
Bảng 3.23. Kết quả định tính cao Diếp cá 41
Bảng 3.24. Kết quả định lượng quercetin trong cao Diếp cá 42
iv
Bảng 3.25. Đề xuất tiêu chuẩn và kết quả kiểm nghiệm cao Diếp cá 43
v
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Lá và hoa Diếp cá 3
Hình 3.2. Soi bột Diếp cá 29
Hình 3.3. SKLM dịch chiết quercetin bằng CHCl3 32
Hình 3.3. Sự liên quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh 34
Hình 3.6. Ảnh hưởng của độ cồn và tỷ lệ DL/DM trên hiệu suất chiết 37
Hình 3.7. Ảnh hưởng của độ cồn và số lần chiết trên hàm lượng quercetin 38
Hình 3.8. SKLM của cao Diếp cá 42
Hình 3.9. Sắc ký đồ của quercetin chuẩn và thử 43
Hình phụ lục 1. Xu hướng liên quan giữa hiệu suất chiết với độ cồn 53
Hình phụ lục 2. Xu hướng liên quan giữa hàm lượng quercetin với độ cồn và tỷ
lệ DL/DM 53
Hình phụ lục 5. Ảnh hưởng của độ cồn và tỷ lệ DL/DM trên hàm lượng
quercetin 55
Hình phụ lục 6. Ảnh hưởng của tỷ lệ DL/DM và số lần chiết trên hàm lượng
quercetin 55
55
vi

công nghiệp chiết xuất dược liệu của Việt Nam chưa phát triển mạnh, phương pháp
chiết xuất chỉ là dạng thô sơ như nấu cao, cô cao trực tiếp. Chính vì vậy, việc điều
chế sản xuất cao Diếp cá là rất thực tế và khả thi.
Tuy nhiên, hạn chế lớn nhất của việc khai thác và sử dụng cây thuốc ở nước ta là
vấn đề tiêu chuẩn chất lượng. Yêu cầu cao nhất của một dược phẩm khi được sử
dụng trên con người là tính an toàn và hiệu quả trị liệu của nó. Để đánh giá và thống
nhất được các chuẩn mực đánh giá cho một nguyên liệu có thể sử dụng làm thuốc
hay một thành phẩm có thể đưa ra thị trường, người ta phải xây dựng các tiêu chuẩn
chất lượng, đồng thời xây dựng các phương pháp thử để đánh giá các tiêu chuẩn đó.
Đặt vấn đề Dương Huỳnh Điểm
1
Vì những lý do trên, đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật sản xuất
cao Diếp cá Houttuynia cordata Thunb.” được thực hiện nhằm mục đích cụ thể
như sau:
- Kiểm nghiệm dược liệu Diếp cá.
- Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng quercetin/cao Diếp cá.
- Tối ưu quy trình chiết xuất cao Diếp cá.
- Đề xuất phương pháp kiểm nghiệm cao Diếp cá.
Ý nghĩa của đề tài:
- Tìm được quy trình chiết cao Diếp cá tối ưu.
- Giảm bớt chi phí trong quy trình chiết xuất khi áp dụng ở quy mô công nghiệp.
- Đề xuất hướng kiểm nghiệm cao Diếp cá.
- Quy trình chiết xuất cao Diếp cá sẽ là cơ sở cho các nghiên cứu sau này trên các
quy mô pilot và công nghiệp.
Đặt vấn đề Dương Huỳnh Điểm
2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ DIẾP CÁ
Cây Diếp cá còn có tên là cây Giấp cá, Lá giấp, Ngư tinh thảo.
Tên khoa học là Houttuynia cordata Thunb.

O
H
O
H
O
O
H
H
O
O
H
H
O
O
O
O
O
O
O
O
H
H
H
H
O
H
quercetin quercitrin
Tinh dầu
Thành phần chủ yếu của tinh dầu Diếp cá là các nhóm aldehyd và các dẫn xuất
ceton như methyl n-nonyl ceton (đây là chất làm cho Diếp cá khi vò có mùi tanh),

Ngoài ra Diếp cá còn có tác dụng ngăn cản sự sinh sản của các vi khuẩn
Streptococcus pneumonia và Staphylococcus aureus.
Đặt vấn đề Dương Huỳnh Điểm
5
Tác dụng trên các vi khuẩn Shigella, Salmonella và E.coli thì yếu hơn.
Diếp cá còn có khả năng diệt được Gonococcus và ngăn cản sự phát triển của các
siêu vi trùng cảm cúm [14, 28].
Tác dụng kháng viêm
Hoạt chất trong Diếp cá có khả năng chống sưng viêm và làm hạ sốt. Là do các acid
béo trong lá khô có khả năng ngăn chặn sự tổng hợp prostaglandin-thủ phạm gây ra
phản ứng sưng viêm (do phản ứng loại ức chế cyclooxygenase) [14].
Diếp cá còn được dùng để điều trị hen suyễn, viêm mũi dị ứng do tác dụng ức chế
phản ứng quá mẫn qua trung gian tế bào Mast [23].
Tác dụng trên hệ miễn nhiễm
Chất decanoyl acetaldehyde trong Diếp cá có khả năng làm tăng tính thực bào của
các tế bào bạch cầu, đồng thời cũng tăng tỷ lệ properdin nên giúp tăng khả năng của
hệ miễn nhiễm chống lại các bệnh tật, tăng sức đề kháng để ngăn ngừa các bệnh do
siêu vi trùng [13].
Tác dụng lợi tiểu
Tác dụng này có được có thể là do liên quan đến các chất quercitrin, isoquercitrin
và muối kali trong cây Diếp cá.
Khi dùng dịch chiết nước Diếp cá để ngâm tưới trên thận của cóc và chân của ếch
thì nhận thấy các vi mạch máu giãn nở, làm gia tăng sự lưu thông của máu và tạo ra
sự tăng bài tiết nước tiểu. Chất isoquercitrin còn có tác dụng làm tăng sự bền chắc
của các vi mạch máu.
Vì vậy các bệnh nhân cao huyết áp nên ăn thêm Diếp cá để giúp lợi tiểu, hạ huyết
áp, đồng thời giúp mạch máu vững chắc hơn [15].
Đặt vấn đề Dương Huỳnh Điểm
6
Tác dụng trên hệ hô hấp

Helaf
®
(Công ty Cổ phần Dược Hậu Giang)
Cao khô Diếp cá 210 mg.
Cao khô Rau má 45 mg.
Tá dược vừa đủ.
Công dụng: hỗ trợ điều trị trĩ, táo
bón và kiết lỵ
Hình 1.2. Sản phẩm Helaf
Cenditan
®
(Công ty Cổ phần Dược phẩm 3/2)
Cao Diếp cá 75 mg.
Bột Rau má 300 mg.
Công dụng: Trị táo bón, trĩ, giải
nhiệt, thông tiểu, mát gan, giải độc.
Hình 1.3. Sản phẩm Cenditan
Ruton
®
(Công ty cổ phần dược phẩm OPC), thành phần gồm rau Diếp cá, nụ Hòe.
Tác dụng thanh nhiệt, giải độc, lợi tiểu.
Troxiton
®
(Công ty cổ phần Dược Danapha), thành phần gồm Bạch truật, Đương
quy, Trần bì, Cam thảo, Diếp cá, Đảng sâm, Hoàng kỳ. Tác dụng chữa bệnh trĩ, bồi
bổ cơ thể, giúp lưu thông máu huyết, trợ tiêu hóa, kháng khuẩn kháng viêm.
Đặt vấn đề Dương Huỳnh Điểm
8
Triselan
®

Các phương pháp sắc, hầm, hãm hay nấu cao trong y học cổ truyền là phương pháp
chiết ở nhiệt độ sôi với dung môi là nước. Với các dung môi khác, dụng cụ chiết
cần có bộ phận ngưng tụ dung môi nên gọi là phương pháp chiết hồi lưu.
Ngoài ra, còn chiết ở điều kiện chân không, chiết ở áp suất nén, chiết dưới tác dụng
(siêu âm, chất diện hoạt), chiết bằng CO
2
lỏng
1.2.2. Cô đặc, sấy khô
Cô đặc
Mục đích để điều chế cao lỏng và cao đặc. Khi cô không được gây phân hủy hoạt
chất có trong dịch chiết: cô ở nhiệt độ thấp, thời gian cô ngắn, cô dịch chiết loãng
trước, dịch chiết đặc sau.
Sấy khô
Để điều chế cao khô cần sấy khô dịch chiết đã cô thành cao lỏng hoặc cao mềm.
Sấy dưới áp suất giảm, nhiệt độ thường dưới 50
o
C: dịch chiết cô đặc được trải
thành lớp mỏng trên các khay thép không rỉ hoặc sắt tráng men. Phương pháp này
có ưu điểm là sấy nhanh và bảo toàn được lượng hoạt chất có trong cao thuốc.
Sấy trên trống quay tạo màng mỏng: sử dụng máy sấy tạo màng mỏng trên trục
quay gồm một hình trụ có đường kính 0,7 - 1,5 m, chiều dài 2 - 4 m, kín ở hai đầu
có bộ phận cung cấp nhiệt vào bên trong, thường là hơi nước, trống quay gắn với
một trục quay. Một phần của hình trụ được gắn vào dịch chiết tạo màng bám trên bề
mặt của hình trụ dày khoảng 0,1-1 mm. Sau đó lớp dịch chiết và trống quay được
làm nóng ở nhiệt độ cao. Cao đã khô được lấy ra bằng lưỡi dao đặt sát vào trống
quay. Phương pháp này có ưu điểm là thời gian làm khô nhanh do diện tích bay hơi
dung môi lớn.
Sấy khô bằng phương pháp phun sấy: thiết bị phun sấy có bơm nhu động điều
chỉnh tốc độ phun dịch, bơm nén khí tạo áp lực phun thích hợp, đầu phun có các
kích thước lỗ phun khác nhau. Dịch chiết được phun vào buồng sấy thành các hạt

Là một khối đặc quánh, độ ẩm không quá 20%.
Cao khô
Có thể chất khô tơi, độ ẩm không quá 5%.
Đặt vấn đề Dương Huỳnh Điểm
11
1.3. XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU
1.3.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất
Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất dược liệu:
Nguyên liệu
Bản chất của nguyên liệu đóng vai trò rất lớn trong quá trình chiết xuất. Bề dày của
vách tế bào, đường kính của ống trao đổi là hai yếu tố quan trọng nhất. Độ dày của
vách tế bào hay chiều dài của các kênh bào tương càng lớn thì quá trình hòa tan
chiết xuất càng chậm. Đường kính các kênh bào tương càng lớn, các chất qua lại
vách tế bào càng dễ dàng. Quá trình chiết xuất càng xảy ra nhanh. Nguyên liệu càng
chia nhỏ thời gian thẩm thấu qua vách giảm làm cho quá trình chiết nhanh hơn. Tuy
nhiên, càng chia nhỏ nguyên liệu, tính chọn lọc của quá trình càng giảm, dịch chiết
càng có nhiều tạp chất.
Chất tan
Độ tan trong dung môi của chất tan càng lớn, quá trình chiết xảy ra càng nhanh.
Kích thước phân tử chất tan càng lớn, tốc độ khuếch tán và khả năng qua vách tế
bào càng giảm.
Dung môi
Khả năng hòa tan của dung môi với chất tan càng lớn, quá trình hòa tan càng nhanh
làm cho quá trình chiết xảy ra nhanh hơn. Khả năng hòa tan các chất trong dung
môi khác nhau thì khác nhau và phụ thuộc nhiều vào bản chất của chất tan và dung
môi. Độ nhớt của dung môi càng thấp, khả năng thấm vào tế bào, sự khuếch tán của
chất tan và dung môi xảy ra dễ dàng, quá trình chiết xảy ra càng nhanh.
Kỹ thuật chiết
Chênh lệch nồng độ càng lớn, tốc độ khuếch tán càng cao. Việc tăng lượng dung
môi làm tăng sự chênh lệch nồng độ nên quá trình chiết xảy ra nhanh hơn. Sự khuấy

): dược liệu, dung môi hay
điều kiện chiết xuất; quả được gọi là biến số phụ thuộc (y
i
): hiệu suất chiết, tỷ lệ
hoạt chất, tỷ lệ tạp chất hay hiệu quả kinh tế.
Mô hình thực nghiệm hay gặp trong chiết xuất dược liệu là mô hình yếu tố: khảo sát
nhiều yếu tố, mỗi yếu tố có nhiều mức. Một mô hình thực nghiệm có F yếu tố với L
mức đòi hỏi số thí nghiệm là L
F
. Mô hình yếu tố đầy đủ có ưu điểm là cho phép
khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố cũng như tương tác của chúng. Tuy nhiên mô
hình này cần có số thí nghiệm rất lớn khi số yếu tố tăng lên. Mô hình giản lược cho
phép giảm bớt số thí nghiệm nhưng vẫn khảo sát được sự ảnh hưởng của các yếu tố
(thí dụ: mô hình hay gặp: D-Optimal, Taguchi OA ). Ngày nay, việc thiết kế các
mô hình thực nghiệm có thể được thực hiện nhanh chóng và chính xác nhờ phần
mềm chuyên dụng như Design – Expert [4]. Vấn đề là nhà chiết xuất phải phân tích
rõ ràng các mối liên quan nhân quả để lựa chọn biến số rồi tiến hành thiết kế mô
hình thực nghiệm phù hợp.
1.3.3. Nghiên cứu liên quan nhân quả
Công nghệ có tên là logic mờ-thần kinh có khả năng nghiên cứu mối liên quan giữa
các yếu tố ảnh hưởng trên kết quả chiết xuất về các mặt: xu hướng liên quan, mức
độ liên quan và qui luật liên quan nhân quả (phần mềm FormRules).
Qui luật nhân quả được xem là tri thức nông, có thể cho nhà chiết xuất biết nếu
dược liệu/dung môi/kỹ thuật thế nào thì kết quả chiết xuất sẽ ra sao với xác suất bao
nhiêu.
Qua kết quả nghiên cứu liên quan nhân quả, nhà nghiên cứu có thể chọn yếu tố có
ảnh hưởng trọng yếu để tiến tới giai đoạn tối ưu hóa, bỏ qua các ảnh hưởng không
đáng kể. Nhờ đó việc xây dựng quy trình chiết xuất dược liệu được như mong muốn
mà tiết kiệm thời gian và công sức.
Đặt vấn đề Dương Huỳnh Điểm

Đặt vấn đề Dương Huỳnh Điểm
Quy trình Sản phẩm
Tối ưu hóa thông số
15
Xác lập mô hình nhân quả
- Không giới hạn về số biến x
1
, x
2
, x
k,
đáp ứng yêu cầu nghiên cứu với nhiều biến
về dược liệu, dung môi, kỹ thuật chiết xuất.
- Có thể tối ưu đồng thời nhiều biến y
1
, y
2
y
k,
phù hợp với thực tế kết quả chiết xuất
cần đáp ứng nhiều mặt như hiệu suất chiết, tỷ lệ hoạt chất, tỷ lệ tạp chất hay hiệu
quả kinh tế.
- Không phụ thuộc vào mô hình toán học mà dựa vào khả năng luyện mạng với sự
lựa chọn nhiều thông số phù hợp.
- Phù hợp với nhiều loại dữ liệu phức tạp, phi tuyến, không dùng số, định tính hay
thiếu trị số.
- Áp dụng một cách dễ dàng nhờ các hàm tối ưu hóa trực quan: Tent, Up, Down,
Flat hay Flat-Tent.
1.4. NỘI DUNG CỦA MỘT TIÊU CHUẨN CAO DƯỢC LIỆU [1]
Yêu cầu cao nhất của một dược phẩm khi được sử dụng trên người là tính an toàn

Dược liệu Diếp cá (Herba Houttuyniae cordata) đã phơi khô, được mua tại cơ sở
chuyên mua bán dược liệu Hòa Thạnh – Phùng Qui Minh, địa chỉ 72 Triệu Quang
Phục, phường 10, quận 5, TPHCM.
Dược liệu được bảo quản lưu mẫu tại Ban Nghiên Cứu Khoa Học – Thư viện, Khoa
Dược Đại học Y Dược TPHCM.
Quercetin chuẩn do Bộ y tế – Viện kiểm nghiệm TPHCM cung cấp, số lô
QT104040608, hàm lượng 94,26% C
15
H
10
O
7
, hiện trạng nước 0,23%.
2.1.2. Hóa chất, dung môi
Bảng 2.1. Danh sách hóa chất, dung môi
Hóa chất, dung môi Độ tinh khiết Nguồn gốc
Ethanol 96% PA Cty TNHH một thành viên dược
phẩm OPC – Bình Dương.
Methanol PA Trung Quốc.
Acid hydrochloric PA Trung Quốc
Cloroform PA Trung Quốc
Toluen PA Trung Quốc
Aceton PA Trung Quốc
Sắt (III) clorid PA Trung Quốc
Natri hydroxyd PA Trung Quốc
n - Butanol PA Trung Quốc
Magie Trung Quốc
Methanol HPLC Merck
Acetonitril HPLC Merck
2.1.3. Trang thiết bị