ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, những tiến bộ vượt bậc trong khoa học tự nhiên và những hiểu biết
ngày càng sâu sắc của nền y học hiện đại làm cho sự phân tách giữa nền y học phương
Đông và y học phương Tây ngày càng trở nên rõ rệt. Tuy nhiên, những hạn chế rõ ràng
của các loại thuốc có nguồn gốc từ tổng hợp hóa dược như có nhiều tác dụng phụ hoặc
phản ứng có hại, dễ gây tương tác đang ngày càng làm cho con người hướng sự quan
tâm của mình vào các loại thuốc có nguồn gốc từ dược liệu.
Việt Nam là một trong những nước trên thế giới có nguồn dược liệu phong phú
và đa dạng nhất. Đồng thời, Việt Nam cũng là một nước có kinh nghiệm sử dụng thuốc
cổ truyền lâu đời. Với những đặc điểm như vậy, việc phát triển các loại thuốc có nguồn
gốc từ dược liệu là phù hợp với điều kiện thực tiễn của nước ta cũng như xu hướng
phát triển của nền y học hiện đại.
Bìm bìm biếc là một cây thuốc được dùng phổ biến theo kinh nghiệm dân gian ở
nước ta. Hạt của cõy Bỡm bìm biếc có giá trị sử dụng cao. Theo kinh nghiêm dân gian,
nó thường được sử dụng trong các bài thuốc thông đại và tiểu tiện, thông mật, đôi khi
dùng để trị giun [10], [23]. Bộ phận này của cây hiện nay được dùng nhiều dưới dạng
cao mềm, cao đặc hoặc cao khô trong nhiều sản phẩm như: sản phẩm Boganic
đ
(công
ty Traphaco), sản phẩm Bổ gan thông mật
đ
(công ty Sohaco), sản phẩm Nagatec
đ
(công
ty Nam Dược) với công dụng chủ yếu điều trị viêm gan, vàng da, mụn nhọt, lở
ngứa
Với những giá trị sử dụng như vậy, việc nghiên cứu và xây dựng tiêu chuẩn của
hạt và cao Bìm bìm biếc là một việc làm hết sức cần thiết. Chính vì vậy, chúng tôi tiến
hành thực hiện đề tài “Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng của hạt và cao Bìm bìm biếc”
với mục tiêu xây dựng tiêu chuẩn của hạt và cao khô Bìm bìm biếc nhằm góp phần
nâng cao chất lượng của hạt và cao khô Bìm bìm biếc.
+ Quả nang, hình cầu hoặc ovan.
+ Hạt hình tròn nhẵn hoặc có nhiều lông.
2
1.1.3. Phân bố của chi Ipomoea
Họ Bìm bìm hay họ Khoai lang hoặc họ Rau muống (Convolvulaceae), là một
nhóm của 55-60 chi và khoảng 1.625-1.650 loài, chủ yếu là cõy thõn thảo dạng dây
leo, nhưng cũng có một số loài ở dạng cây gỗ hay cây bụi, phân bố rộng khắp thế giới.
Ở Việt Nam, họ Bìm bìm có 20 chi với khoảng 100 loài: Aniseia, Argyreia, Bonamia,
Cordisepalum, Dichondra, Erycibe, Evolvulus, Hewitia, Ipomoea, Jacquemontia,
Lepistemon, Merremia, Mina, Neuropeltis, Operculina, Phabitis, Porana, Stictocardia,
Tridynamia, Xenostegia.
Chi Ipomoea là một chi lớn của họ này, gồm khoảng 500 loài, phân bố rộng
khắp các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, bao gồm các loài dõy bũ, dây leo, và cõy
thõn bụi . Ở Việt Nam, chi Ipomoea có khoảng 35 loài. Một số loài là cây trồng như
rau muống, khoai lang, còn lại đều là cây mọc tự nhiên, phân bố rộng khắp các vùng
miền trong cả nước [22].
1.1.4. Đặc điểm của một số loài thuộc chi Ipomoea
1.1.4.1. Ipomoea aquatica Forsk
- Tên thường gọi: Rau muống, bìm bìm nước.
- Đặc điểm thực vật: Cây mọc bò, ở nước hay trên cạn. Thân rỗng, dày, có
những đốt, mặt ngoài nhẵn. Lỏ hỡnh 3 cạnh, đầu nhọn, cũng có khi hẹp và dài, không
có lông. Phiến lá dài 7-9 cm, rộng 3,5-7 cm; cuống lá nhẵn, dài 3-6 cm. Hoa to, màu
trắng hoặc hồng tím, ống hoa tím nhạt, mọc từng 1-2 hoa trên một cuống dài 1-2 cm;
đài hình chén, 5 răng nhọn không đều; tràng hợp hình phễu, 5 cánh hoa hàn liền. Nhị
không bằng nhau, đính ở gốc tràng; bầu nhẵn. Quả nang, hình cầu, đường kính 7-9 cm.
Hạt 4, có lông màu hung, đường kính 4 mm.
- Thành phần hóa học:
+ 92% nước; 3,2% protit; 2,5% glucid; 1% cenluloza; 1,3% tro.
+ Hàm lượng muối khoáng rất cao: 100 mg% Ca, 37 mg% P; 1,4 mg% Fe.
+ Hàm lượng vitamin: 23 mg% vitamin C; 0,1 mg% vitamin B1; 0,09 mg%
- Công dụng: Ngoài công dụng thực phẩm, làm nguyên liệu chế tinh bột khoai,
có thể dùng khoai lang làm thuốc nhuận tràng sẽ cho phân mềm, không lỏng, không
đau bụng [7],[9],[10],[13].
Ngoài ra, cũng đó có nghiên cứu chứng minh khả năng làm tăng tính nhạy cảm
của Insulin, tăng khả năng kiểm soát đường huyết của lá và củ khoai lang ở bệnh nhân
đái tháo đường type II [15],[19].
4
1.1.4.3. Ipomoea turpethum R.Br.
- Tên thường gọi: chỡa vôi.
- Đặc điểm thực vật: Dây leo bằng thân quấn, sống dai. Cành hình trụ. Lá hình
trứng hoặc thuôn dài, đôi khi 3 cạnh; phía dưới có hình tim, dài 5-12 cm, rộng 2,5-7,5
cm; cuống lá dài 1-7 cm. Hoa to màu trắng hoặc vàng nhạt mọc ở nách lá, cuống hoa
dài 1-7 cm. Quả nang, đường kính 15-16 cm, 4 cạnh, mở theo đường nứt ngang. Hạt 3-
4, hình thấu kính, màu đen nhạt, đường kính 6-7 mm.
- Thành phần hóa học: Hoạt chất chủ yếu là gluco-nhựa 7-8%. Gluco-nhựa của
chỡa vụi phân tích sâu hơn sẽ được hai phần: một phần không tan trong ether là
turpethin, chiếm khoảng 90%; phần còn lại tan trong ether là turpethin α và β.
- Công dụng: Theo kinh nghiệm dân của nhân dân Việt Nam, củ chỡa vụi
thường được dùng chữa thấp khớp, đau nhức các khớp xương. Thân cây chỡa vụi hơ
hoặc xào núng dựng đắp lên phụ nữ sau khi sinh để chữa đau bụng.
Theo kinh nghiệm của các nước phương Tây, thân rễ chỡa vụi dùng làm thuốc
tẩy mạnh với liều 4-8g dưới dạng thuốc sắc hoặc với liều 1-4g bột [10].
1.1.4.4.Ipomoea digitata Lin.
- Tên thường gọi: Tầm sét, Bìm bìm xẻ ngón.
- Đặc điểm thực vật: Cây leo bằng thân quấn, mảnh, không có lông. Cành hình
trụ. Lá chia thành 5-7 thùy sõu, đường kính lá 8-20 cm, hình chân vịt, nhẵn, có
cuống dài 4-8 cm. Cụm hoa ở nách lá, hỡnh chựy lưỡng phân, trông hơi gù. Hoa
màu hồng, hình ống rộng, lá đài bị xé rách, bầu 2 ô, đựng 2 noãn. Quả nang hình
cầu, mở bằng 4 mảnh vỏ, chứa 4 hạt có lông màu hung đỏ.
- Thành phần hóa học: nhiều chất nhầy.
không thò ra ngoài. Chỉ nhị phồng, có lông ở gốc. Bao phấn hình mũi tên. Bầu giữa, 3
ô, mỗi ô đựng 2 noón. Vũi nhụy mảnh như sợi chỉ, đớnh noón trung tâm. Quả nang,
hình cầu, nhẵn, đường kính 8 mm, có 3 ngăn. Hạt 2-4, hình 3 cạnh, lưng khum, hai bên
dẹt, nhẵn, màu đen hoặc trắng tùy loài, dài 5-8 mm, rộng 3-5 mm [9],[10].
6
Hình 1.1. Cây Bìm bìm biếc (Ipomoea nil)
1.2.3. Phân bố, thu hái
Cây Bìm bìm biếc mọc hoang ở nhiều tỉnh nước ta; ngoài ra còn mọc ở Ấn Độ,
Indonesia, Thái Lan, Philippin, Trung quốc
Vào cỏc thỏng 7-10, quả chín, hái về đập lấy hạt phơi khô [10].
1.2.4. Bộ phận dùng
Bộ phận dùng làm thuốc của cây Bìm bìm biếc là hạt.
Trong Đông y, hạt Bìm bìm được gọi là “Khiờn ngưu tử”. “Khiờn” là dắt,
“ngưu” là trâu, “tử” là hạt; tương truyền thời xưa có người dùng hạt Bìm bìm mà khỏi
bệnh, đã dắt trâu đến tạ ơn người mách thuốc, nên vị thuốc từ hạt Bỡm bỡm mới có tên
là “Khiờn ngưu tử” [10],[20].
1.2.5. Thành phần hóa học
Hạt Bìm bìm biếc chứa khoảng 2% chất glucozit gọi là phacbitin, khoảng 11%
chất béo, 2% sắc tố cũng là glucozit.
Phacbitin được cấu tạo bởi các chất sau: acid phacbitic, acid tiglic, methyl
ethylacetic, acid nilic. Acid phacbitic cấu tạo bởi acid ipurolic, glucoza và ramnoza [9].
1.2.6. Tác dụng – Công dụng
1.2.6.1. Tác dụng
Phacbitin có tác dụng tẩy mạnh, tăng sức co bóp của ruột. Ngoài ra, cũn cú tỏc
dụng diệt giun (in vivo).
7
Theo Đông y, Khiên ngưu tử có vị cay, tớnh núng, hơi có độc, vào 3 kinh phế,
thận, đại tràng. Có tác dụng tả khí phận thấp nhiệt, trục đờm, tiêu ẩm lợi nhị tiện (đại
tiểu tiện), là thuốc chữa tiện bĩ, cước khí, chủ trị hạ khí; lợi tiểu tiện chữa cước thũng
(phù), sát trùng.
giun đũa, cũng có thể dùng cho cả trường hợp giun tóc: Khiên ngưu tử 8g, Tân lang (vỏ
Quả cau) 8g, Đại hoàng 4g. Tất cả đem nghiền mịn, trộn đều, ngày uống 2 lần, vào
sáng sớm và buổi chiều khi đói bụng, mỗi lần uống 3 - 4g, dùng nước sôi chiêu thuốc,
trẻ nhỏ tùy theo tuổi cần giảm bớt liều [10],[20].
9
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là hạt và cao khô của cõy Bìm bìm biếc (Ipomoea nil (L.)
Roth), họ Khoai lang (Convolvulaceae). Cây do chúng tôi tự trồng và thu hái vào tháng
9/2009.
Xử lý nguyên liệu: Hạt được phơi sấy khô, tán nhỏ. Các nguyên liệu nghiên cứu
(hạt và cao khô) bảo quản nơi thoáng mát.
2.1.2. Phương tiện nghiên cứu
2.1.2.1. Thuốc thử, dung môi, hóa chất
- Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích.
- Dung môi, thuốc thử đạt tiêu chuẩn DĐVN IV.
2.1.2.2. Dụng cụ
- Dụng cụ thí nghiệm thủy tinh, buret, bình chiết, nồi cách thủy.
- Cân kỹ thuật, cân phân tích Precisa.
- Kính hiển vi.
- Máy đo độ ẩm Sartorius.
- Máy đo tro toàn phần Nabertherm.
- Máy chụp ảnh Canon 8.0
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.2.1. Nghiên cứu về hạt Bìm bìm biếc
- Nghiờn cứu đặc điểm hình thái hạt và đặc điểm bột.
- Định tính cỏc nhúm chất có trong hạt.
- Xác định độ ẩm, tro toàn phần, lượng tạp chất có trong hạt.
4
1N, đun sôi, để nguội, lọc. Kiềm hóa dịch lọc bằng amoniac đặc, sau đó lắc với
CHCl
3
2-3 lần, mỗi lần 5ml, gạn lấy lớp dung môi hữu cơ rồi cho bốc hơi cách thủy
đến khô thu được cắn.
Hòa tan cắn bằng 2-3ml H
2
SO
4
1N, chia vào 3 ống nghiệm, tiến hành 3 phản
ứng, phản ứng dương tính nếu xuất hiện các hiện tượng sau:
- Phản ứng với TT Mayer: Thêm 1-2 giọt TT Mayer, xuất hiện tủa trắng hoặc
vàng nhạt.
- Phản ứng với TT Bouchardat: Thêm 1-2 giọt TT Bouchardat, xuất hiện tủa
nâu.
- Phản ứng với TT Dragendorff: Thêm 1-2 giọt TT Dragendorff, xuất hiện tủa
đỏ cam [1].
• Định tính nhóm saponin
11
Cân khoảng 5g dược liệu vào bỡnh nún dung tích 50ml, thêm 20ml EtOH 90
0
,
đun cách thủy sôi trong vài phút, lọc nóng thu dịch lọc. Cho vài giọt dịch lọc vào ống
nghiệm có sẵn 5ml nước cất, lắc mạnh ống nghiệm theo chiều dọc trong 5 phút rồi để
yên. Sau 15 phút, quan sát, phản ứng dương tính nếu thấy cột bọt bền và cao [1].
• Định tính nhóm flavonoid
Cân khoảng 5g dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml, thêm 15ml EtOH
90
0
phản ứng dương tính nếu xuất hiện tủa bông trắng [1].
12
• Định tớnh nhúm chất béo
Cân khoảng 5g dược liệu cho vào bỡnh nón dung tích 50ml. Thêm 10ml CHCl
3
vào, đun cách thủy sôi trong vài phút, lọc lấy dịch. Nhỏ 1 giọt dịch lọc lên trên giấy
lọc, sấy nhẹ để bay hết dung môi. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện vết mờ trên giấy
lọc [1].
• Định tính nhóm caroten
Lấy một ít dịch lọc ở trên cho vào ống nghiệm, bốc hơi trên cách thủy đến cắn.
Thêm 1-2 giọt dung dịch H
2
SO
4
đậm đặc vào cắn. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện
màu xanh [1].
• Định tính nhựa
Cân khoảng 10g dược liệu, chiết hồi lưu bằng cồn 90
0
trong khoảng 2-3 giờ.
Bốc hơi dịch chiết trên cách thủy đến cắn. Rửa cắn vài lần bằng nước sôi, mỗi lần
10ml. Cắn sau khi rửa được sấy khô, tán nhỏ để làm các phản ứng sau:
- Hiện tượng huỳnh quang: Lấy 0,5g cắn, thêm 5ml dung dịch amoniac loãng.
Lắc kỹ 15 phút, phản ứng dương tính nếu dịch trên không có màu vàng nhưng soi dưới
ánh sáng tử ngoại lại xuất hiện huỳnh quang màu.
- Hiện tượng đốt cháy: Lấy một ít cắn đốt cháy, phản ứng dương tính nếu có
mùi đặc trưng của nhựa [1].
2.3.1.3. Xác định độ ẩm, tro toàn phần và lượng tạp chất có trong hạt
• Xác định độ ẩm bằng phương pháp nhiệt độ: sử dụng máy đo độ ẩm Sartorius
Cách xác định: Khởi động máy đo độ ẩm Sartorius. Lấy một lượng dược liệu
Cách xác định: Cân một lượng mẫu vừa đủ đã được chỉ dẫn trong chuyên luận,
dàn mỏng trên tờ giấy, quan sát bằng mắt thường hoặc kính lúp; khi cần có thể dựng
rây để phân tách tạp chất và dược liệu.Cõn phần tạp chất đó [5].
Lượng tạp chất lẫn trong dược liệu được tính theo công thức sau:
X (%) = . 100
Trong đó:
a: Khối lượng tạp chất (g).
P: Khối lượng dược liệu (g).
X: Phần trăm tạp chất có trong dược liệu (%).
2.3.1.4. Định lượng chất béo trong dược liệu theo chuyên luận DĐVN IV
Nguyên tắc: Chiết xuất chất béo trong dược liệu bằng dung môi hữu cơ. Dung
môi thường dùng là chloroform, ether ethylic hoặc ether dầu hỏa. Cất thu hồi dung môi
và sấy cắn đến khối lượng không đổi.
Cách xác định: Nghiền nhỏ dược liệu, xác định độ ẩm dược liệu bằng máy xác
định độ ẩm. Cân chính xác khoảng 20g bột dược liệu, cho vào cối sứ nghiền cùng với
2–3g Natri sulphat khan. Đựng dược liệu đã nghiền trong túi giấy lọc, dùng bông lau
14
sạch cối rồi cho bông vào túi, gập miệng túi. Đặt túi vào bình Soxhlet, chiết chất béo
có trong bột hạt bằng CHCl
3
đến kiệt (cách thử: nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc, hơ
nóng, nếu không để lại vết bóng mờ trên giấy là đạt yêu cầu). Chuyển dịch chiết trong
bình cầu sang một cốc sạch khụ đó cõn trước bì, cho bay hơi đến kiệt dung môi trên
nồi cách thủy rồi đem cân xác định khối lượng của cắn. Cắn được bảo quản trong tủ
lạnh [1],[5].
Hàm lượng chất béo trong dược liệu được tính theo công thức:
X(%) =
Trong đó:
a: Khối lượng cắn (g).
P: Khối lượng dược liệu đem định lượng (g).
HCl 0,5N đã dùng cho mẫu trắng [5].
Chỉ số xà phòng hóa được tính theo công thức:
Chỉ số xà phòng hóa =
Trong đó:
a: Số ml dung dịch HCl 0,5N dùng cho mẫu thử (ml).
b: Số ml dung dịch HCl 0,5N dùng cho mẫu trắng (ml).
P: Lượng mẫu thử (g).
• Xác định chỉ số ester
Chỉ số ester là số mg KOH cần thiết để xà phòng hóa cỏc ester chứa trong 1g
mẫu thử.
Chỉ số ester được tính theo công thức:
Chỉ số ester = Chỉ số xà phòng hóa – chỉ số acid
2.3.1.6. Xác định acid bộo cú trong chất béo bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ
Sắc ký khí khối phổ là một thiết bị ghép nối giữa sắc ký khí – một thiết bị tách
với khối phổ ký – cũng là một thiết bị hoàn hảo trong việc nhận biết các chất.
• Sắc ký khí
Là kỹ thuật chia tách trong đó các thành phần của mẫu phân tích phân bố giữa
hai pha: pha tĩnh với diện tích tiếp xúc rất lớn, pha động có bản chất khí thấm qua pha
tĩnh. Mẫu được làm bay hơi và được mang bởi pha động khớ (khớ mang) đi qua cột.
16
Mẫu phân bố trên pha tĩnh lỏng dựa vào độ hòa tan ở nhiệt độ nhất định. Các thành
phần của mẫu phân tách ra khỏi nhau dựa trên áp suất hơi tương đối và ái lực khác
nhau của chúng đối với pha tĩnh.
• Detector chọn lọc khối phổ (MSD: Mass Selective Detector)
Nguyên tắc hoạt động: Dựa trên nguyên tắc bẻ gãy phân tử chất phân tích thành
các mảnh ion có tỷ số giữa khối lượng và điện tích m/z xác định và đặc trưng cho chất
phân tích.
Quá trình ion hóa: Có nhiều kỹ thuật ion hóa, nhưng kỹ thuật ion hóa bằng va
chạm điện tử EI (electric impact) là phổ biến hơn cả. Quá trình ion hóa được thực hiện
bởi sự va chạm phân tử chất phân tích với dũng điện tử có năng lượng cao (70eV). Quá
Cách xác định: Nếu không có chỉ dẫn đặc biệt trong chuyên luận riờng, cõn
chính xác khoảng 4,000 g bột dược liệu có cỡ bột nửa thô cho vào trong bỡnh nún 250
- 300 ml. Thêm chính xác 100,0 ml nước, đậy kín, ngâm lạnh, thỉnh thoảng lắc trong 6
giờ đầu, sau đó để yên 18 giờ. Lọc qua phễu lọc khô vào một bình hứng khô thích hợp.
Lấy chính xác 20 ml dịch lọc cho vào một cốc thuỷ tinh đó cõn bỡ trước, cô trong cách
thủy đến cắn khô. Sấy cắn ở 105
0
C trong 3 giờ, lấy ra để nguội trong bình hút ẩm 30
phỳt, cõn nhanh để xác định khối lượng cắn sau khi sấy, tính phần trăm lượng chất
chiết được bằng nước theo dược liệu khô [5].
Lượng chất chiết được bằng nước trong dược liệu được tính theo công thức:
X(%) =
Trong đó:
P: Khối lượng dược liệu đem cân (g).
a: Khối lượng cắn (g).
h: Độ ẩm dược liệu (%).
2.3.2. Nghiên cứu về cao khô Bìm bìm biếc
2.3.2.1. Phương pháp điều chế cao khô
Quá trình điều chế gồm hai giai đoạn:
- Giai đoạn 1: Chiết xuất dược liệu bằng các dung môi thích hợp.
- Giai đoạn 2: Sau khi thu được dịch chiết dược liệu, tiến hành lọc, cô đặc dịch
chiết bằng các phương pháp khác nhau để độ ẩm còn lại không quá 5 %.
Để đạt đến thể chất quy định, quá trình cô đặc và sấy khô dịch chiết thu được
thường được tiến hành trong các thiết bị dưới áp suất giảm ở nhiệt độ không quá 60
0
C.
Nếu không có các thiết bị cô đặc và sấy dưới áp suất giảm thì được phép cô cách thủy
và sấy ở nhiệt độ không quá 80
0
C. Tuyệt đối không được cô trực tiếp trên lửa [5].
Mất khối lượng do làm khô là sự giảm khối lượng của mẫu thử biểu thị bằng
phần trăm (kl/kl) khi được làm khô trong điều kiện xác định ở mỗi chuyên luận.
Việc xác định mất khối lượng do làm khô không được làm thay đổi tính chất lý
hóa cơ bản của mẫu thử.
Cách xác định: Dùng một chộn cõn có nắp mài làm bì đựng mẫu thử. Sấy bì
trong thời gian 30 phút, để nguội trong bình hút ẩm rồi cân xác định khối lượng bì.
Làm nhỏ cao, cho vào bỡ cõn chính xác khoảng 5 g cao. Đem cao vào sấy trong tủ sấy
ở áp suất thường đến khối lượng không đổi. Sau đó làm nguội cao đến nhiệt độ phòng
trong bình hút ẩm có silicagel rồi cân ngay [5].
Mất khối lượng do làm khô của cao được tính theo công thức:
X (%) =
19
Trong đó:
m1: Khối lượng cao trước khi sấy (g)
m2: Khối lượng cao sau khi sấy (g)
X: Mất khối lượng do làm khô của cao (%).
2.3.2.5. Định lượng chất béo có trong cao theo chuyên luận DĐVN IV
Phương pháp tiến hành tương tự như định lượng chất bộo cú trong hạt.
2.3.2.6. Xác định acid bộo cú trong chất béo bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ
Phương pháp tiến hành tương tự như xác định acid bộo cú trong chất béo của
hạt.
2.3.2.7. Xác định lượng chất chiết được trong cao bằng cồn theo phương pháp chiết
lạnh
Cỏch xác định: Cân chính xác khoảng 4,000g cao đã làm nhỏ cho vào trong
bỡnh nún 250 - 300 ml. Thêm chính xác 100,0 ml cồn, đậy kín, ngâm lạnh, thỉnh
thoảng lắc trong 6 giờ đầu, sau đó để yên 18 giờ. Lọc qua phễu lọc khô vào một bình
hứng khô thích hợp. Lấy chính xác 20 ml dịch lọc cho vào một cốc thuỷ tinh đó cõn bỡ
trước, cô trong cách thủy đến cắn khô. Sấy cắn ở 105
0
C trong 3 giờ, lấy ra để nguội
chú ý không đưa chất khử khuẩn vào mẫu thử.Thử nghiệm được áp dụng cho tất cả các
dược phẩm gồm cả nguyên liệu và thành phẩm của các thuốc không tiệt khuẩn trong
quá trình sản xuất.
• Đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí
Đối với chế phẩm hòa tan tốt hoặc tạo thành dung dịch hơi đục, dùng phương
pháp đĩa thạch. Hòa tan 10 g chế phẩm vừa đủ trong 100 ml NaCl 0,9% để được dung
dịch chế phẩm có độ pha loãng ở tỷ lệ 1/10.
Hòa loãng chế phẩm sao cho khi cấy 1 ml dịch chế phẩm vào môi trường trong
một hộp Petri, số khuẩn lạc mọc khoảng 30 đến 300 khuẩn lạc. Lấy dung dịch có độ
pha loãng cuối cùng cho vào 2 hộp Petri, mỗi hộp 1ml. Thêm vào mỗi hộp 15 ml đến
20 ml môi trường thạch casein đậu tương hoặc môi trường thạch thường đã đun chảy
và để nguội đến 45°C. Đậy hộp, trộn đều bằng cách xoay qua, xoay lại. Sau đó để yên
cho thạch đông cứng ở nhiệt độ phòng. Lật ngược hộp, mang ủ ở 30 - 35°C từ 48 giờ
đến 72 giờ. Sau thời gian ủ, kiểm tra vi khuẩn mọc ở đĩa, đếm số lượng khuẩn lạc. Lấy
giá trị của đĩa có số lượng khuẩn lạc lớn nhất mà số khuẩn lạc trong đĩa không lớn hơn
300 và tính ra số lượng vi khuẩn trong 1 g hoặc 1 ml chế phẩm. Nếu thấy không có
21
khuẩn lạc mọc ở đĩa có độ pha loãng 1/10 thì kết luận chế phẩm có ít hơn 10 vi khuẩn
trong 1g hoặc 1ml.
• Đếm tổng số nấm mốc, và nấm men
Dùng phương pháp đĩa thạch tương tự như đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí,
nhưng sử dụng môi trường thạch Sabouraud ủ các đĩa ở nhiệt độ ở 20°C đến 25°C, theo
dõi trong 5 ngày.
Công thức tính:
X =
Trong đó:
X: Tổng số vi khuẩn hiếu khí hoặc vi nấm trong 1g/1ml mẫu thử
A1/A2: Số khuẩn lạc vi sinh vật trung bình ở độ pha loãng K1/K2.
• Thử nghiệm tỡm cỏc vi khuẩn gây bệnh
- Tìm Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa
bằng một vùng màu hồng tới đỏ) trên môi trường Thạch xanh brilliant và Khuẩn lạc
màu đen hoặc màu xanh trên môi trường Thạch bismuth sulfit chế phẩm không chứa
Salmonella.
Nếu thấy có khuẩn lạc như trên trong 2 môi trường đó, đem nhuộm soi thấy
gồm những trực khuẩn hình gậy, Gram âm, thực hiện tiếp bằng cách chuyển khuẩn lạc
nghi ngờ riêng biệt sang ống môi trường thạch - sắt - ba đường (nghiêng). Trước tiên
cấy ria trên mặt thạch nghiêng, sau cấy sâu xuống phần đứng của thạch, ủ ở 35°C đến
37°C trong 18 đến 72 giờ. Kiểm tra nếu không thấy môi trường bị kiềm hóa (màu đỏ)
ở phần nghiêng và acid hóa (màu vàng) phần dựng đứng, có hoặc không có kèm theo
màu đen ở phần dựng đứng do sinh H
2
S, chế phẩm không chứa Salmonella.
+ Tìm Escherichia coli: Cấy ria một quai cấy từ môi trường lactose đó cú vi
khuẩn mọc lên trên bề mặt môi trường thạch Mac - Conkey. Đậy nắp, lật ngược hộp, ủ
ở 35°C đến 37°C trong 18 đến 72 giờ. Kiểm tra nếu không có khuẩn lạc màu đỏ gạch,
có thể có vùng mật kết tủa bao quanh trong môi trường thì chế phẩm không có
Escherichia coli. Nếu có khuẩn lạc như vậy thì chuyển khuẩn lạc nghi ngờ lên mặt
thạch Endo. Đậy đĩa, lật ngược, ủ ở 43 đến 45°C trong 18 đến 72 giờ. Kiểm tra nếu
không có những khuẩn lạc màu đỏ sinh ánh kim thì chế phẩm không có Escherichia
coli. Kết hợp các phản ứng thử nghiệm sinh hóa và đặc điểm nuôi cấy để kết luận sự có
mặt của Escherichia coli trong chế phẩm.
23
Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT
3.1.1. Nghiên cứu về hạt Bìm bìm biếc
3.1.1.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật của hạt Bìm bìm biếc
• Đặc điểm bên ngoài:
Hạt gần giống một phần năm khối cầu, mặt lưng lồi hình cung, có một rónh
nụng ở giữa. Mặt bụng hẹp, gần như một đường thẳng tạo thành do hai mặt bên. Rốn
nằm ở cuối mặt bụng và lõm xuống. Hạt dài 4-7 mm, rộng 3-4,5 mm. Mặt ngoài hơi lồi
4 Tanin - Phản ứng với dd FeCl
3
-
Không
- Phản ứng với chì acetat 10% -
- Phản ứng với gelatin 1% -
25
a
b
b
c
c
d
Copyright: Tài liệu đại học ©