BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

PHẠM THỊ THANH THUỶ

KHẢO SÁT TỶ LỆ GEN CYP1A1*2B VÀ GSTM1
Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG
KHẢO SÁT TỶ LỆ GEN CYP1A1*2B VÀ GSTM1
Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG
Chuyên ngành : miÔn dÞch
Mã số : 60.72.04

LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC
Ng−êi h−íng dÉn khoa häc
1. TS. PHẠM ĐĂNG KHOA
2.TS. TRẦN VÂN KHÁNH

Hμ néi - 2010


bên cạnh động viên khuyến khích và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá
trình học tập công tác cũng nh trong cuộc sống.
Hà Nội, ngày 16 Tháng 08 năm 2010
Phạm Thị Thanh Thuỷ

LờI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là đề tài do chính tôi thực hiện, số liệu và kết
quả trong đề tài này là hoàn toàn trung thực và cha đợc công bố trên một
công trình nghiên cứu khoa học nào.
Tôi xin hon toàn chịu trách nhiệm với những cam kết trên.
Hà nội, ngày 15 tháng 8 năm 2010
Ngời cam đoan Phạm Thị Thanh Thuỷ

2.1.1. Tiêu chuẩn chọn đối tợng nghiên cứu 20
2.1.2. Đối tợng nghiên cứu đợc thu thập tại 03 Bệnh viện 20
2.2. Phơng pháp nghiên cứu 20
2.2.1. Thit k nghiờn cu 20
2.2.2. C mu nghiờn cu 20
2.2.3. Các bớc nghiên cứu 21
2.3. CC K THUT XC NH GEN CYP1A1*2B V GSTM1 22
2.3.1. Kỹ thuật PCR 22
2.3.3. K thut Sequencing 34
2.4. Địa điểm nghiên cứu 36
2.5. Xử lý số liệu 36
CHNG 3: KT QU NGHIấN CU 37
3.1. THễNG TIN CHUNG V I TNG NGHIấN CU 37
3.2. KT QU CHIT TCH DNA 38
3.3. KIU GEN CYP1A1*2B 45
3.2. GEN GSTM1 49
3.5. Mối liên quan giữa gen CYP1A1*2B, ện gen GSTM1
và UTTT 53
3.6. KT QU TCH DềNG GII TRèNH T GEN 40
CHNG 4: BN LUN 54
4.1. KT QU TCH DềNG GII TRèNH T GEN
4.2. THễNG TIN CHUNG V I TNG V PHNG PHP
NGHIấN CU 55
4.3. Tỷ Lệ KIểU gen CYP1A1 *2b 56
4.4. GEN GSTM1 60
4.5. Mối liên quan giữa kiểu gen CYP1A1*2B, GSTM1 Và
UTTT 62

PCR
Polymerase Chain Reaction
PAH
Polycyclic aromatic hydrocacbon
IARC
International Agency for Research on Cancer
SNP
Single Nucleotide Polymorphism
TNM
Tumor lympho Node Metastasis
TSNA
Tobaco Specific Nitrosamine
UT
Ung thư
UTĐTT
Ung thư đại trực tràng
WHO
World Health Organization
DANH MỤC BẢNG

B¶ng 1.1. C¸c d¹ng SNP cña gen CYP1A1 12
B¶ng 1.2. Mèi liªn quan CYP1A1 vµ GSTM1 víi ung th− 17
Bảng 3.1: Phân bố đối tượng theo tuổi của hai nhóm nghiên cứu 37
Bảng 3.2: Phân bố đối tượng theo giới của hai nhóm nghiên cứu 38
Bảng 3.3. Nồng độ và độ tinh sạch của DNA sau chiết tách 39
Bảng 3.4: Phân bố kiểu gen CYP1A1 ở nhóm chứng 46
Bảng 3.5. Phân bố kiểu gen CYP1A1 ở nhóm bệnh 47

sequencer t
ng ABI 44
Hỡnh 3.17. Kt qu so sỏnh trỡnh t t c v trỡnh t GeneBank 44
ca gen GSTM1 44 1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là loại ung thư thường gặp ở các
nước Phương Tây, đứng thứ 3 về tỷ lệ mắc, đứng thứ 2 về tỷ lệ tử vong chỉ
sau ung thư phổi [7]. Tần suất cao này duy trì suốt 40 năm nay mặc dù tû lÖ
tö vong những năm gần đây có giảm, đặc biệt là ở phụ nữ. Do sự thay đổi
về thói quen sinh họat và lối sống, b
ệnh có xu hướng tăng lên ở Châu Á nói
chung và Việt Nam nói riêng [68 ].
Tại Việt Nam, hiện UTĐTT xếp hàng thứ tư sau các ung thư phổi, dạ
dày, gan (nam); vú, dạ dày, cổ tử cung (nữ). Theo ghi nhận của Bệnh viện
K Hà Nội năm 1991 tỷ lệ là 4,3/100.000 dân, năm 1999 tỷ lệ đã là
13,3/100.000 dân [3, 7], đến năm 2000, tần suất mắc bệnh là 7,3/100.000
dân, đến nay tỷ lệ mắc là 7,5/100.000 dân, như vậy tỷ lệ mắc vẫn cao.
Hi
ện nay, các biện pháp phát hiện sớm ung thư đại trực tràng bao
gồm: xét nghiệm tìm máu ẩn trong phân; nội soi đại trực tràng (với những

là các kiu gen: CYP1A1*2A, CYP1A1*2B, CYP1A1*4.
Glutathione S transferase M1 (GSTM1) cũng là gen mã hóa cho
enzym tham gia vào quá trình chuyển hoá, đào thải các chất gây UT. Trong
khi CYP1A1 có chức năng hoạt hoá thì GSTM1 là một trong những enzym
của giai đoạn II có chức năng chuyển các chất gây UT, đã đợc CYP1A1
hoạt hoá, thành dạng không độc để đào thải ra ngoài. Khi không có gen
này, nguy cơ UT phổi, bàng quang. tăng lên có ý nghĩa thống kê [27, 30,
66]. Do đó, tùy sự phối hợp hoạt động của hai loại gen này mà chúng sẽ
tham gia vào hoạt hóa hay loại bỏ các chất gây UT và làm tăng ho
c giảm
nguy cơ UT ở các tạng khác nhau trong cơ thể.
Nghiên cứu tìm hiểu sự tác động của các gen nhạy cảm góp phần
phát hiện sớm những trờng hợp bị UTTT mc phõn t, nhm giảm
thiểu tác hại của nó đối với ngời bệnh cũng nh cộng đồng. ở Việt Nam
cha có nghiên cứu nào đánh giá sự tác động của hai gen ny bnh nhõn
UTĐTT, trong khuôn khổ luận văn này chúng tôi tiến hành nghiờn cu 3

Kho sỏt t l gen CYP1A1*2B và GSTM1 ở bệnh nhân ung
đại trực tràng, nhằm hai mục tiêu sau:
1. Xác định tỷ lệ gen CYP1A1*2B và GSTM1 ở nhúm bệnh nhân
ung th đại trực tràng và nhóm chứng.
2. Tỡm hiu mối liên quan giữa gen CYP1A1*2B và GSTM1 với
bệnh ung th đại trực tràng. 4


5

Hiện các nhà chuyên môn chưa chứng minh được yếu tố nào là
nguyên nhân gây bệnh ung thư đại trực tràng. Các nghiên cứu dịch tễ học
chỉ gợi ý : sự thay đổi trong thói quen ăn uống (việc ăn nhiều chất béo) có
liên quan đến căn bệnh này. Các yếu tố di truyền cũng rất quan trọng,
người có bệnh viêm đường tiêu hóa, viêm loét đại tràng hay có tiền sử bị
ung thư hoặc gia đình có người bị bất cứ bệ
nh ung thư nào và người ít vận
động đều là người có nguy cơ cao, nhất là đối với người trên 50 tuổi.
2. NGUYÊN NHÂN VÀ CÁC YẾU TỐ NGUY CƠ
2.1. Chế độ dinh dưỡng
UTĐTT là loại ung thư có liên quan chặt chẽ với chế độ dinh dưỡng.
Chế độ ăn không hợp lí: Quá nhiều chất béo, nhiều mỡ động vật, thịt hun
khói, ít hoa quả tươi có liên quan đến nguy cơ UTĐTT trong khi các
vitamin (A, C, D, E) và khoáng chất (calcium) cũng góp phần làm gi
ảm
nguy cơ mắc UTĐTT.
Những thực phẩm lên men có nhiều chất Nitrosamin và Aflatoxin
cũng làm tăng tỷ lệ mắc ung thư. Những nước có nền công nghiệp phát
triển như Nhật Bản, Singapore tỉ lệ mắc ung thư đại trực tràng tăng lên
rõ rệt nhất.
Chế độ ăn ít xơ làm giảm khối lượng phân và kéo dài thời gian phân
còn lại trong ruột, tạo điều kiện cho việc s
ản xuất các chất ung thư nội sinh
dẫn đến làm tăng thời gian niêm mạc ruột tiếp xúc với các chất gây ung thư.
Dùng kháng sinh đường ruột kéo dài, không đúng chỉ định sẽ gây loạn khuẩn
chí đường ruột, một tác nhân làm tăng nguy cơ UTĐTT. Rượu và thuốc lá
cũng được chứng minh là có vai trò quan trọng trong UTĐTT [8, 63].


cng nhn thy nguy c t vong v mc nhng loi ung th vũm hng, gan,
d dy, c t cung ngi Vit mi di c sang cao hn so vi dõn bn x. 7

Trong khi đó, ung thư đại trực tràng, phổi, vú lại thấp hơn so với dân có
nguồn gốc ở đây.
2.3.1.Các yếu tố di truyền trong ung thư đại trực tràng không có đa
polyp (Hội chứng Lynch)
Còn gọi là ung thư đại tràng do di truyền không phải đa polyp
(HNPCC- Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer) [68].
Hội chứng Lynch chiếm 5% các trường hợp ung thư trực tràng.
Nguyên nhân của hội chứng này đã được xác định: có sự đột biến của một
trong năm gen sửa lỗi bắt cặp nhiễm sắc thể (Mismatch Repair Genes:
MLH1, MSH2, MSH6, PMS1, PMS2).
Người có HNPCC có nguy cơ mắc các bệnh lý ác tính của đại trực
tràng (70-80% trong suốt cuộc đời), nội mạc tử cung (30-60%), buồng
trứng, dạ dày, ruột non, niệu quản, tuyến bã da.
Để chẩn đoán hội chứng Lynch, trước tiên cần nghĩ đến khả năng có
thể có hội chứng này. Tiêu chuẩn chẩn đoán chặt chẽ nhất hiện nay là tiêu
chuẩn Amsterdam:
* Có tối thiểu ba người trong phả hệ mắc ung thư đại tràng và
* Một người là trực hệ của một trong hai người còn lại, và
* Ít nhất có một người bị ung thư đại tràng ở độ tuổi dưới 50.
20% người bị HNPCC có đột biến gen tự phát.
Chẩn đoán xác định HNPCC dựa vào xét nghiệm xác định sự đột biến của
các gen nói trên
9

- Cỏc polyp (hamartoma) ri rỏc trong ng tiờu hoỏ, nhng tp trung
ch yu rut non
- Cỏc sang thng sc t da v niờm mc khoang ming
- U tinh hon (u t bo Sertoli)
Ngi cú hi chng Peutz-Jegher cú nguy c mc cỏc bnh lý ỏc tớnh
ca ng tiờu hoỏ (t thc qun n trc trng, cao nht l i trng), tu,
phi, vỳ, c t cung, bung trng.
3. CHT GY UNG TH
Nhiều hóa chất ở dạng tự nhiên hay chuyển hóa có thể ảnh hởng tới
DNA và dẫn đến UT nếu nh bị phơi nhiễm lâu dài. Ngời ta thấy rằng có
hơn 80% các loại UT ở ngời xuất hiện dờng nh là hậu quả của sự phơi
nhiễm với môi trờng [65]. Trong quá trình sống, cơ thể cần tiếp nhận các
chất từ bên ngoài vào để phục vụ cho nhu cầu trao đổi chất cung cấp năng
lợng và xây dựng cơ thể. Bên cạnh những chất cần thiết, cơ thể cũng tiếp
nhận cả những chất lạ đối với các chuyển hoá thông thờng. Trong đó, có
những chất có thể gây biến đổi hoạt động của tế bào, gây nên những rối
loạn sinh trởng, phát triển tế bào và có thể dẫn đến UT - gọi là các chất
gây UT. Bên cạnh đó, bản thân quá trình chuyển hóa các chất trong cơ thể
cũng có thể sinh ra các chất có khả năng gây UT. Đó là các chất nh [15,
31, 38, 55]:
- Amin dị vòng (Heterocyclic amines: HCA) sinh ra trong quá trình
chế biến thịt, đặc biệt trong các món rán, nớng hay nấu kỹ.
- Hydrocacbon nhân thơm đa vòng (polycyclic aromatic
hydrocarbon: PAH) có trong các món thịt nớng, quay, khói thuốc lá Ví
dụ nh Benzo[a]pyrene, chất này sau khi đợc hoạt hóa có khả năng tơng
tác, gắn kết với DNA, hoạt hóa oncogen, khởi đầu cho việc hình thành UT.

11

năng gắn một nguyên tử oxy vào nhiều loại chất hoá học khác nhau, biến
chất không tan trong nớc, độc, thành chất tan nhiều hơn trong nớc và ít
độc hơn. Cytochrom P450 gồm ba cấu tử: cytochrom P450 reductase,
cytochrom P450 và phospholipid. Đây là một hệ thống enzym đặc hiệu cơ
chất rất rộng, có nhiều dạng phân tử (isoenzym), khoảng 150 dạng khác
nhau. Có thể nói rằng, cytochrom P450 là một chất xúc tác sinh học đa
năng nhất đợc biết cho đến nay. Cytochrom P450 đợc coi là một đại gia
đình (superfamily) với những protein chứa hem, xúc tác cho sự chuyển hoá
nhiều chất ngoại sinh (xenobiotic) và nhiều chất nội sinh có đặc tính a
lipid. ở giai đoạn chuyển hoá này các enzym thuộc hệ thống CYP450 có:
CYP1A1, 2E1, 2D6
Giai đoạn II gồm các phản ứng liên hợp giúp cho các chất hoá học
hình thành liên hợp hoà tan trong nớc nhiều hơn để có thể dễ dàng đợc
đào thải. Bao gồm các enzym nh: Glutathione-S-transferase (GSTs), N-
acetyl-transferase (NATs), UDP-glucuronosyltransferase
Nh vậy, sự thay đổi hoạt tính của các enzyme chuyển hóa chất gây
UT có thể liên quan đến khả năng nhạy cảm đối UT của cá thể.
4. GEN CYP1A1 V GSTM1 TRONG UNG TH V UTTT
4.1. Tớnh a hỡnh thỏi ca gen CYP1A1
CYP1A1 là gen mã hoá cho một enzym thuộc gia đình Cytochrom
P450, nằm trên đoạn nhiễm sắc thể 15q24.2-4. CYP1A1 còn đợc gọi dới
một tên khác là Aryl hydrocarbon hydroxylase (AHH) [20].
Tính đa hình thái của gen CYP1A1 đợc đánh giá thông qua tần suất
các kiu gen của nó. Đến nay, ngoài dạng nguyên thuỷ của CYP1A1
(CYP1A1*1), ngời ta đã xác định đợc tính đa hình thái của sự thay đổi
một nucleotid (Single nucleotide polymorphism: SNP) của gen này ở các
dân tộc khác nhau.

2500 C ặ T 477 Arg ặ Trp
CYP1A1*11
2546 C ặ G 492 Pro ặ Arg

Các SNP có thể gặp ở vùng mã hóa (exon) và vùng không mã hóa
(intron). Đối với các thay đổi xảy ra ở vùng mã hóa, sự thay thế các
nucleotid sẽ dẫn đến sự thay đổi bộ ba mã hóa, kết quả là hoặc đa đến sự
thay đổi về acid amin trong chuỗi polypeptid sản phẩm hoặc tạo bộ ba mã
kết thúc (CYP1A1*7). Các thay đổi xảy ra ở vùng không mã hóa không tạo
ra sự thay đổi về trình tự acid amin.
Đa phần những thay đổi này là hiếm gặp và cha biết rõ hết vai trò
của chúng trong chuyển hóa và UT. Hiện nay, các công bố chủ yếu nghiên
cứu mối liên quan giữa UT với một số SNP, nh: CYP1A1*2A,
CYP1A1*2B, CYP1A1*4. 13

Trong nghiên cứu này, CYP1A1*2B là dạng SNP có sự thay đổi
nucleotid ở vị trí 2455 A ặ G thuộc exon 7 và dẫn tới sự thay đổi bộ ba mã
hóa acid amin ở vị trí 462 Isoleucin ặ Valine. Do đó, gen CYP1A1*2B có 2
dạng alen -A, -G và tạo nên 3 dạng kiểu gen: A/A; A/G và G/G [22, 32, 69].
4.2. Tớnh a hỡnh thỏi ca gen GSTM1
Glutathione S tranferase (GSTs) là một đại gia đình gen mã hóa các
enzym đợc biểu lộ rộng rãi trong các mô của cơ thể; có cơ chất là các
xenobiotic và các sản phẩm của sự oxy hoá các chất. GSTs có tác dụng khử
độc thuộc phase II của quá trình chuyển hóa các xenobiotic trong cơ thể.
Do đó GSTs góp phần bảo vệ cơ thể chống lại các tác nhân UT xâm nhập
vào cơ thể [56, 57, 58]. Hình 1.4. Sơ đồ gen GSTM1 khi đột biến mất gen [42]
Gen GSTM1 bao gồm 8 exon, có kích thớc từng exon khoảng 36 -
112 bp. Chúng đợc phân cách bởi các intron có kích thớc rất khác nhau,
từ 87 - 2641 bp. GSTM1 nằm giữa hai đoạn lặp lại có kích thớc 4,2kb.
Kiu gen GSTM1 do sự kết hợp của 3 alen GSTM1*A, GSTM1*B và
GSTM1*0. Tại exon 7, nucleotid 534 G ặ C dẫn đến sự thay đổi về acid
amin 172 Lys ặ Asn, tạo ra hai alen GSTM1*A và GSTM1*B. Đây là hai
alen có chức năng mã hóa cho các monomer để hình thành nên các dạng
hoạt động của enzyme: homo- hay hetero-dimer. Mc Lellan và CS (1997)
đã mô tả 2 trờng hợp ngời Saudi Arabians có hoạt tính enzyme GSTM1
cực nhanh với hai bản copy của gen này [56]. Alen GSTM1*0 do mất gen
hoàn toàn (mất đoạn chứa gen dài 16kb) nên không biểu lộ thành protein là
alen không có chức năng [42, 50, 58]. Ngời ta thấy rằng sản phẩm của hai
alen GSTM1*A và GSTM1*B không có sự khác nhau về chức năng và hoạt
tính enzyme. Do đó, khi xác định gen GSTM1 ngời ta không phân biệt hai
alen này và thể hiện kiu gen dới các dạng: (+/+) và (+/-) là có mặt gen
GSTM1 còn (-/-) là không có mặt gen [30, 35, 51].

GSTM4
GSTM2
GSTM1
GSTM5
GSTM3
Alen nguyên thủy
Mất Alen
bằng, nguy cơ UT, đợc giả thiết, nhẹ hơn. Trong các nghiên cứu thực
Chất gây uT
Hoạt hóa
Bất hoạt
Đào thải
CYP1A1
GSTM1
Tổn thơng DNA
Đột biến gen 16

nghiệm, CYP1A1 có khả năng hoạt hóa các chất gây UT nh: Benzo(k)
fluorathene, benzo[a]pyrene, benzo[g,h,i]perylene, benzo[a]anthracene và
chrysene. Những chất hóa học gây UT này có trong khói thuốc lá, tác nhân
gây UT ngoại sinh. Do đó khi CYP1A1 thay đổi thì có thể làm tăng hoặc
giảm nguy cơ bị UT. Gen GSTM1 tham gia vào giai đoạn II của quá trình
chuyển hoá các chất gây UT hoá học và các dạng khác của quá trình khử
độc và đào thải các chất. Nh vậy, hai gen CYP1A1 và GSTM1 có liên
quan với giai đoạn I và II khử độc bởi các enzym tơng ứng và làm
tăng/giảm nguy cơ UT [27, 28, 30].
Nghiên cứu ở Mỹ cho thy nu ch nghiờn cu riờng CYP1A1*2B thỡ
khụng thy cú mi liờn quan vi UTTT nhng nu kt hp thờm vi s
cú mt ca GSTM1 thỡ tng nguy cơ mắc bnh UTTT. [54].
Nhiu nghiờn cu cho thy gen CYP1A1 làm tăng nguy cơ UTDD
[35, 40].
Ngời ta cũng phát hiện thấy mối liên quan với một số UT khác nh:
UT vú, UT tiền liệt tuyến, UT buồng trứng (những UT có liên quan đến sự
hoạt hoá estrogen thông qua CYP1A1) [32].