BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Tên đề tài:

" KHẢO SÁT TỈ LỆ NHIỄM CÁC VI SINH VẬT GÂY BỆNH
TRONG SẢN PHẨM KEM CÓ CHỨA SỮA TẠI TRUNG TÂM
QUATEST3 THEO TIÊU CHUẨN 46/2007/QĐ-BYT "

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ
GVHD:ThS. NGUYỄN VĂN MINH
ThS. TRẦN THỊ ÁNH NGUYỆT
SVTH: LÂM VĂN THẮNG
MSSV: 1153010771
Khóa: 2011-2015
Bình Dƣơng, ngày 26 tháng 05 năm 2015


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành cảm ơn:
Ban giám hiệu trường Đại học Mở Tp.Hồ Chí Minh, ban chủ nhiệm bộ môn
Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong
suốt quá trình học tập tại trường.
Thầy Nguyễn Văn Minh đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ em rất nhiều cũng như
cho em những lời khuyên quý giá để em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, em
xin gửi đến thầy lời cảm ơn chân thành nhất.
Em cũng xin cảm ơn chị Trần Thị Ánh Nguyệt đã tạo điều kiện để em tiếp xúc

DANH MỤC BIỂU ĐỒ ................................................................................................VI
DANH MỤC HÌNH ẢNH .......................................................................................... VII
DANH MỤC PHỤ LỤC............................................................................................ VIII
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................................. 1
PHẦN 1. TỔNG QUAN ................................................................................................. 4
1.1. Tồng quan về QUATEST 3 ................................................................................... 4
1.1.1. Những nét chung ............................................................................................. 4
1.1.2. Nhiệm vụ ........................................................................................................ 4
1.1.3. Phòng thử nghiệm vi sinh – GMO .................................................................. 5
1.2. Tổng quan về kem ................................................................................................. 6
1.2.1. Nguồn gốc: ...................................................................................................... 6
1.2.2. Thành phần của kem ....................................................................................... 7
1.2.3. Các vi sinh vật trong kem ............................................................................... 7
1.3. Đại cương về các vi sinh vật gây bệnh thường hiện diện trong kem .................... 7
1.3.1. Đại cương về Coliforms .................................................................................. 7
1.3.2. Đại cương về Escherichia coli........................................................................ 8
1.3.3. Đại cương về Staphylococus aureus ............................................................. 11
1.3.4. Đại cương về Listeria monocytogenes ......................................................... 14
1.3.5. Đại cương về Salmonella .............................................................................. 17
1.3.6. Giới thiệu về phương pháp PCR ................................................................... 22
PHẦN 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ............................................................... 31
2.1. Vật liệu ................................................................................................................ 31
2.2. Thiết bị - Hóa chất: .............................................................................................. 31
2.3. Phương pháp kiểm nghiệm: ................................................................................. 32
2.3.1. Quy trình chung ............................................................................................ 32
2.3.2. Mô tả mẫu: .................................................................................................... 32
2.3.3. Đồng nhất mẫu:............................................................................................. 32

SVTH Lâm Văn Thắng


Tài liệu tham khảo : ..................................................................................................... 75
PHẦN PHỤ LỤC ..............................................................................................................i

SVTH Lâm Văn Thắng

Trang III


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
APHA

American Public Health Association

AOAC

Association of Official Analytical Chemists

BYT

Bộ Y tế

BS

British Standards

Đ

Đạt


Tiêu chuẩn Việt Nam

HACCP

Hazard Analysis and Critical Control Points

USFDA

United States Food and Drug Administration

SVTH Lâm Văn Thắng

Trang IV


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1 Bảng phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật trong mẫu kem chứa sữa. ........ 33
Bảng 2.2 Bảng tóm tắt các phản ứng của Listeria spp. ................................................. 42
Bảng 2.3 Các phản ứng sinh hóa của các chủng Salmonella ........................................ 47
Bảng 2.4 Các phản ứng kháng huyết thanh thử khẳng định .......................................... 48
Bảng 2.5 Điều kiện để nuôi cấy các vi sinh vật ............................................................. 48
Bảng 2.6 Mồi đặc trưng cho từng loại vi sinh vật ......................................................... 49
Bảng 2.7 Nồng độ các thành phần phản ứng PCR phát hiện các vi sinh vật:
Salmonella spp và Listeria monocygenes ...................................................................... 50
Bảng 2.8 Chương trình nhiệt trên máy PCR .................................................................. 51
Bảng 3.1 Kết quả đánh giá mô tả mẫu ........................................................................... 54
Bảng 3.2 Giới hạn vi sinh vật trong thực phẩm không được phép ................................ 57

Hình 1.2: E. coli dưới kính hiển vi điện tử ( Internet ) .................................................... 8
Hình 1.3: Staphylococcus aureus dưới kính hiển vi điện tử (Internet) ......................... 11
Hình 1.4: Listeria monocytogenes dưới kính hiển vi (Internet) .................................... 14
Hình 1.5. Vi khuẩn Salmonella (Internet). .................................................................... 18
Hình 1.6 Vị trí của các kháng nguyên của Salmonella ................................................ 21
Hình 1.7 Nguyên tắc của PCR là nhân bản DNA đích qua các chu kỳ nhiệt................ 24
Hình 1.8: Sơ đồ khối minh họa nguyên tắc hoạt động của máy luân nhiệt với buồng
ủ nhiệt Peltier ................................................................................................................. 27
Hình 1.9: Hình vẽ minh họa cơ chế hoạt động chống ngoại nhiễm của UNG ............. 28
Hình 2.1: Quy trình chung trong kiểm nghiệm mẫu ..................................................... 32
Hình 2.2 Cấy & đọc kết quả phản ứng CAMP ............................................................. 41
Hình 3.1 Kết quả điện di đoạn gen đặc trưng của Salmonella trên gel agarose 2% ..... 71

SVTH Lâm Văn Thắng

Trang VII


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC PHỤ LỤC
PHỤ LỤC 1: HÌNH ẢNH ...............................................................................................i
Hình 1 Khuần lạc Coliforms trên môi trường VRBA. ......................................................i
Hình 2 Phản ứng IMViC .................................................................................................i
Hình 3 Môi trường RVS trước và sau khi cấy dịch khuẩn .............................................ii
Hình 4 Môi trường XLD trước và sau khi cấy ................................................................ii
Hình 5 Phản ứng sinh hóa trên môi trường TSI agar .................................................... iii
Hình 6 Phản ứng urease: âm tính (trái), dương tính (phải) ........................................... iii
Hình 7 Môi trường LDC trước(A) và sau khi cấy vi khuẩn (B:dương tính, C âm
tính) ................................................................................................................................ iii

EC broth ................................................................................................................ viii

7.

Tryptone ................................................................................................................ viii

8.

Butterfield's phosphate buffered ........................................................................... viii

9.

L - EMB agar ...........................................................................................................ix

10.

MRVP broth .........................................................................................................ix

SVTH Lâm Văn Thắng

Trang VIII


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

11.

Brain heart infusion broth (BHI broth) ................................................................ix

12.


20.

Tryptone soya yeast extract agar (TSYEA) (ISO 11290-1:1996) ...................... xv

21.

Tryptone soya yeast extract broth (TSYEB) (ISO 11290-1:1996) ....................xvi

22.

Molity agar (ISO 11290-1:1996) .......................................................................xvi

23.

Blood agar. .........................................................................................................xvi

24.

10.H2O2 3 % ..................................................................................................... xvii

25.

Rappaport-Vassilliadis medium with soya (RVS broth). ................................ xvii

26.

Muller-Kauffmann tetrathionate-novobiocin broth (MKTTn broth) .............. xviii

27.


35.

Nutrient agar ................................................................................................... xxiii

36.

L-Lysine decarboxylation medium. ................................................................ xxiii

37.

Semi - solid nutrient agar. ................................................................................xxiv

38.

Nước muối sinh lý ............................................................................................xxiv

39.

ONPG solution .................................................................................................xxiv

40.

Reagents ...........................................................................................................xxiv

SVTH Lâm Văn Thắng

, NaCl và 1

sodium pyruvate ...........................xi

Ở Canada hàng năm có khoảng trên 2 triệu người bị ngộ độc do thức ăn, nếu
tính trung bình theo dân số thì cứ 11 người có 1 người mắc bệnh. Ở Mỹ có khoảng
13 triệu người ngộ độc thức ăn trong năm và cứ 18 người có 1 người mắc bệnh do
thực phẩm, trong đó 85

số ca ngộ độc thức ăn là do nguyên nhân vi sinh (Nguyễn

Phùng Tiến và cs., 2003).
Ngày nay các sản phẩm thực phẩm và nước giải khát tương đối đa dạng, trong
đó Kem hay cà rem (từ tiếng Pháp: crème) là món ăn ngọt dạng đông lạnh rất được
người dân ưa chuộng trong những ngày nắng nóng. Kem được làm từ sản phẩm sữa
như kem béo, trứng gà thêm vào gia vị và đường. Tuy mới xuất hiện ở Việt
Nam trong đầu thế kỷ 20 nhưng hiện nay kem đã có vị trí rất quan trọng trong ẩm
thực của người Việt (vi.wikipedia.org/wiki/Kem).
Khi nhu cầu ẩm thực kem càng tăng nhanh đặt ra vấn đề an toàn vệ sinh của
các sản phẩm kem. Ở Việt Nam, tình hình vệ sinh an toàn thực phẩm trong cả nước
nói chung và các khu vực đô thị nói riêng trong thời gian qua đang tạo nhiều lo lắng
cho người dân. Để khảo sát mức độ ô nhiễm vi sinh vật trong kem hiện nay tôi đã

SVTH Lâm Văn Thắng

Trang 1


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

tìm hiểu theo. TIÊU CHUẨN 46/2007/QĐ-BYT 14 Quy định giới hạn tối đa ô
nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm.
Xuất phát từ những lí do trên, tôi đã thực hiện đề tài: " KHẢO SÁT TỈ LỆ
NHIỄM CÁC VI SINH VẬT GÂY BỆNH TRONG SẢN PHẨM KEM CÓ

Kiểm định và đánh giá an toàn công nghiệp.

SVTH Lâm Văn Thắng

Trang 4


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

–

Khảo sát, quan trắc, phân tích, đánh giá thực trạng và tác động môi trường.

–

Khảo sát, đánh giá các điều kiện kỹ thuật, thực trạng công nghệ, chuyển giao
công nghệ.

–

Đào tạo và tư vấn năng suất chất lượng, ứng dụng kỹ thuật mã số - mã vạch.

–

Đào tạo nghiệp vụ, chuyên môn và kỹ thuật về tiêu chuẩn đo lường chất
lượng.

–

Nghiên cứu, chế tạo và cung cấp các chuẩn đo lường, mẫu chuẩn và các

Trang 5


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

Các thiết bị vi sinh như tủ cấy vô trùng, nồi hấp, tủ ấm, kính hiển vi, tủ đông
sâu… Các thiết bị để thử nghiệm thực phẩm biến đổi gen như PCR Real Time, máy
ly tâm lạnh, máy điện di ngang, thiết bị nhân gen, tủ lắc ổn nhiệt
(www.quatest3.com./ thu-nghiem).

1.2. Tổng quan về kem
Kem hay cà rem (từ tiếng Pháp: crème) là món ăn ngọt dạng đông lạnh làm
từ sản phẩm sữa như kem béo, trứng gà thêm vào gia vị và đường. Hỗn hợp này
được khuấy đều khiến nước đá không kết tinh được. Kết quả là kem ở dạng mịn
(vi.wikipedia.org/wiki/Kem).
1.2.1. Nguồn gốc:
Kem có xuất xứ từ thời La Mã cổ đại, tiền thân của kem là món tuyết ngọt
được vị Hoàng đế Nero sai người lên tận đỉnh núi Apennine để lấy "tuyết tươi" về
ướp nó nhiều lần với mật ong và hoa quả (vi.wikipedia.org/wiki/Kem).
Vào thời Đường, món Tuyết ngọt được người Trung Quốc tạo ra hình hài
mới. Đó là hỗn hợp của sữa trâu, bò, dê đã được lên men, trộn với bột mỳ, sau đó
được ướp long não cho có hương vị và làm lạnh bằng băng với muối. Món quý này,
cũng như tuyết ngọt của Nero, chỉ được dùng trong những buổi tiệc lớn của triều
đình (vi.wikipedia.org/wiki/Kem).
Về sau, năm 1925, trong Cuốn sách "Description of the World" (Diện mạo thế
giới) của Marco Polo đã làm cả châu Âu kinh ngạc. Trong số vô vàn những điều lạ
lẫm, Marco Polo nói đến có một thứ được gọi là "sữa được làm khô trong một thứ
bột nhão". Theo người Ý, đặc sản này của Trung Hoa sẽ mãi chỉ là sữa và bột nhão
nếu không có Marco Polo. Chính nhờ ông mà nó mới trở thành kem ở châu Âu
(vi.wikipedia.org/wiki/Kem).


Hình 1.1. Kem giải khát bổ dƣỡng (Internet).
1.2.2. Thành phần của kem
Kem gồm có thành phần chính là sữa, đường, các chất phụ gia, các loại hương
bổ sung như vani, socola, dâu....
Ngoài ra trên thị trường ngày nay có xuất hiện các loại bột làm kem thuận tiện
trong qua trình chế biến. Bột kem cũng được làm từ sữa, đường và các phụ gia
nhưng đã được sấy khô thành dạng bột và có thể bảo quản lâu dài. Ngoài ra bột kem
có bổ sung hương liệu phù hợp với khẩu vị của từng người (vi.wikipedia.org/wiki
/Kem).
1.2.3. Các vi sinh vật trong kem
Các vi sinh vật thường nhiễm trong các sản phẩm kem là Enterobacteriace,
Coliforms, E.coli, S. aureus, Salmonella, Listeria ....
Trong phạm vi bài báo cáo này em chỉ khảo sát mức độ nhiễm các vi sinh vật
gây bệnh trong các sản phẩm kem có chứa sữa theo Tiêu chuẩn 46/2007/QĐ-BYT.

1.3. Đại cƣơng về các vi sinh vật gây bệnh thƣờng hiện diện trong kem
1.3.1. Đại cương về Coliforms
Coliforms và Fecal coliforms (coliforms phân) là nhóm các vi sinh vật dùng để
chỉ thị khả năng có sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm.
Coliforms hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, trong ruột người, động vật máu nóng
(Trần Linh Thước, 2002).
1.3.1.1 Đặc điểm hình thái và nuôi cấy
SVTH Lâm Văn Thắng

Trang 7


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp


E.coli phát triển trên môi trường dinh dưỡng bình thường, nhiệt độ từ (1846)0C hay thấp hơn. Trên môi trường thạch để tủ ấm 370C tạo khuẩn lạc thấp, lồi,
mềm, không màu, đường kính 1-3 mm. Trên môi trường thạch EMB khuẩn lạc có
màu tím ánh kim (Trần Linh Thước, 2002).
1.3.2.3 Đặc điểm sinh hóa
E.coli lên men được nhiều loại đường như glucose, lactose, manitol, xylose,
glycerol, rhamose, sorbitol, arabinose....không lên men đường dextrin và inositol.
Phản ứng đặc trưng để phân biệt E.coli với các vi khuẩn đường ruột khác là IMViC
( Indol:+, Methyl Red +, Voges- Proskauer: -, Citrate -) (Trần Linh Thước, 2002).
1.3.2.4 Cấu trúc kháng nguyên và độc tố
E.coli có khoảng 150 yếu tố O, 100 yếu tố K và 50 yếu tố H, được chia thành
nhiều tuyp huyết thanh khác nhau. Kháng nguyên O (somatic antigen) là kháng
nguyên của vách tế bào, cấu tạo bởi lipopolysaccharide, có trên 150 loại khác nhau
(Bộ Y tế, 2009).
Những chủng E.coli liên qua đến tiêu chảy thuộc các nhóm sau:
– EPEC (enteropathogenic E.coli): một số tuýt oihuyết thanh gây tiêu chảy ở trẻ
duới 2 tuổi, cơ chế gây bệnh chưa rõ. Các tuýt thường gặp là O26, O44, 086,
O111, O112, O14, O119, O124, O125, O126, O127, O128, O142 (Bộ Y tế,
2009).
– ETEC (enterotoxignic E.coli) : thường gặp ở các trẻ ở các nước đang phát triển,
chúng cũng gây bệnh cho người lớn, đặc biệt lả du khách nên được gọi là
traveler’s diarrhea. ETEC gây bệnh bằng cách tiết 2 loại độc tố ruột: LT( heat
labile) và ST (heat stable):
+ Độc tố LT: không bền với nhiệt, có cấu trúc chức năng miễn dịch giống độc
tố vi khuẩn tả. LT gây hoạt hóa adenylcyclase trong tế bào biểu mô ruột, làm
tăng lượng AMP vòng. Do kích thích bài tiết ion Cl- và bicarbonate, đồng
thời thời ức chế tái hấp thu Na+, hậu quả cuối cùng gây tiêu chảy mất nước
(Bộ Y tế, 2009).

SVTH Lâm Văn Thắng


thỏ lại cao hơn 100 lần. Trên thỏ VT2 gây manh

tràng xuất huyết còn VT1 gây tiêu chảy không có máu (Bộ Y tế, 2009).
1.3.2.5 Sức đề kháng của Escherichia coli
E.coli bị diệt ở 600C từ 15-30 phút, nhiệt độ lạnh chịu được 2 giờ. Trong điều
kiện tự nhiên, E.coli sống được một vài tuần đến một vài tháng (Nguyễn Ngọc
Tuân, 2002).

SVTH Lâm Văn Thắng

Trang 10


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

Formol, acid femic, HgCl2 diệt vi khuẩn trong 5 phút. Hấp autoclave 1210C
trong 15 phút diệt được E.coli (Nguyễn Phùng Tiến và cs.,2003).
1.3.2.6 Triệu chứng ngộ độc
Thời gian ủ bệnh từ 2-20 giờ, người trúng độc đau bụng dữ dội, ít nôn mữa, đi
phân lỏng khoảng 1-15 lần trong ngày. Thân nhiệt bình thường hay tăng nhẹ, trường
hợp nặng có thể sốt cao, mệt mỏi tay chân co quắp, đổ mồ hôi, thời gian khỏi bệnh
tương đối dài (Nguyễn Phùng Tiến và cs.,2003).
1.3.3. Đại cương về Staphylococus aureus
1.3.3.1 Đặc điểm hình thái

Hình 1.3: Staphylococcus aureus dƣới kính hiển vi điện tử (Internet)
S.aureus thuộc giống Staphylococus, bộ Bacillales, họ Staphylococcaea là vi
khuẩn hình cầu, tụ lại từng chùm, Gram (+), kích thước 0,8- 1µm, không di động
không sinh bào tử, không tạo capsule. Trên môi trường canh có thể hình thành
chuỗi ngắn, khi canh trường già hơn có thể bắt màu gram âm (Trần Linh Thước,

+ Protein A: cũng là thành phần của thành tế bào có tác dụng tham gia trong
phản ứng kết hợp bổ thể (Bộ Y tế, 2009).
Teichoid acid : bản chất là những glycerol hay rabitol photphate, liên kết với
peptidoglycan và nó cũng có tính kháng nguyên. Kháng thể chóng lại teichoid acid
đã dược tìm thấy ở bệnh nhân viêm nội tâm mạc do S.aureus (Bộ Y tế, 2009).
Nang : chỉ có ở một số dòng S.aureus có tác dụng ngăn cản sự thực bào của
bạch cầu trung tính (Bộ Y tế, 2009).
 Độc tố và enzyme
Độc tố ruột: khoảng 50

S.aureus tiết ra độc tố ruột. Chúng được kí hiệu từ

A-E. Đây là những protein được cấu tạo từ những polypeptid đơn giản. Có 5 nhóm
huyết thanh học được đặt tên là SEA (Staphylococus Enterotoxin A), SEB, SEC,
SED và SEE. Nhóm thứ 6 SEF không được xem là độc tố ruột và đặt lại là độc tố
gây hội chứng shock toxin-1. Những độc tố này có sức đề kháng cao với nhiệt độ.

SVTH Lâm Văn Thắng

Trang 12


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

Độc tố ruột được tiết ra khi chúng mọc trên thức ăn nhiều đường và protein (Bộ Y
tế, 2009).
Độc tố gây dung huyết tế bào α, β, γ, δ : tất cả đều có kiểu kháng nguyên riêng
biệt. Những tế bào hồng cầu của nhiều loài khác nhau sẽ có tính mẫn cảm khác
nhau đối với các độc tính nảy. Độc tố α và β gây dung huyết mạnh, trong đó độc tố
α có ái lực mạnh với hồng cầu thỏ, độc tố này gây co thắt cơ trơn, hoại tử da và gây

mửa có máu. Đau đầu co cơ, toát mồ hôi. Triệu chứng cấp tính qua nhanh sau 1-2
ngày (Nguyễn Ngọc Tuân, 2002).
1.3.4. Đại cương về Listeria monocytogenes

Hình 1.4: Listeria monocytogenes dƣới kính hiển vi (Internet)
1.3.4.1 Đặc điểm hình thái
L. monocytogenes thuộc Bộ: Bacillales, Họ Listeriaceae, Giống: Listeri, là
trực khuẩn Gram (+), hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, phát triển ở nhiệt độ từ 1 –
450C, không tạo bào tử nhưng có chuyển động điển hình khi được cấy ở nhiệt độ 20
- 250C và có thể phát triển trong tế bào (Trần Linh Thước, 2002).
Là vi khuẩn hình que mảnh, chiều ngang khoảng 0,5µm, chiều dài khoảng 12µm. Phản ứng catalase dương tính. Sau khi nhuộm Gram ta thấy những tế bào hình
que riêng lẻ hoặc những tế bào nối với nhau thành một chuỗi tế bào. Vi khuẩn này
có thể tồn tại ở pH rộng từ 4,3 - 9,6 (J. M Farber và cs., 1991).
1.3.4.2 Đặc điểm nuôi cấy
Listeria monocytogenes có khả năng phát triển tốt trên môi trường giàu dinh
dưỡng. Trên môi trường Oxford agar cho khuần lạc màu nâu đen hay màu xanh đen,
đường kính 2-3 mm, có vòng phân giải màu đen, khuẩn lạc lõm xuống sau 48h nuôi
cấy, đây là điểm đặc trưng của của giống Listeria. Trên môi trường ALOA khuẩn

SVTH Lâm Văn Thắng

Trang 14