19
Các tế bào tham gia vào đáp ứng miễn dịch tự nhiên
Đây là các tế bào quan trọng nhất trong đáp ứng miễn dịch ở cá (Fox, 2005).
Bạch cầu đơn nhân chỉ có số lượng giới hạn trong vòng tuần hoàn máu ngoại vi, trong
khi đại thực bào có nhiều trong các mô. Chúng tham gia vào sự thực bào và sản sinh ra
các yếu tố tương tự cytokine như: interleukin-1 (IL – 1), yếu tố hoại tử khối u (TNF –
tumor necrosis factor) kích hoạt các đáp ứng tiếp theo (Fox, 2005)
Neutrophil: là các tế bào thứ cấp xuất hiện trong giai đoạn sớm của sự viêm
(Manning, 1994; trích bởi Stoskopf S.K., 1993.), nó sản sinh cytokine để lôi kéo các tế
bào có chức năng miễn dịch khác tới vùng đã bị nhiễm (Fox, 2005) .
Tế bào giết tự nhiên ( Natural killer cell) có các thể nhận (receptor) gắn bám
vào tế bào đích và li giải nó. Các tế bào này quan trọng trong sự đáp ứng miễn dịch với
mầm bệnh virus và kí sinh trùng (Fox, 2005).
Ngoài ra còn có một số tế bào tham gia vào sự thực bào khác như: bạch cầu có
hạt ưa acid (Mainwaring và Rowley, 1985), tiểu cầu (Ferguson, 1976; Lester và Budd,
1979), tế bào lớp lót nội mô của xoang máu, tế bào hình trụ ở mang cá (Chilmonczyk
và Monge, 1980), tế bào nội mô ở dạ dày (Woodhead, 1981) và các đại thực bào trong
tâm nhĩ (Ferguson, 1975) (Trích bởi Stoskopf S. K., 1993).
Sự thực bào
Sự thực bào là cơ chế phòng vệ nguyên thủy nhất (Fox, 2005), khởi nguyên của
nó là một chức năng phục vụ cho nhu cầu dinh dưỡng ở động vật cấp thấp, nó đã tiến
hóa độc lập thành chức năng phòng vệ ở động vật có xương sống (Stoskopf S.K.,
1993). Cơ chế của sự thực bào bao gồm: nhận biết tác nhân ngoại nhiễm, gắn bám vào
tác nhân ngoại nhiễm, hút nuốt và tiêu hóa. Cơ chế của việc nhận biết và gắn bám với
tác nhân ngoại nhiễm không được hiểu biết rõ. Ở cá xương, thận và lách là hai cơ quan
chính bắt giữ kháng nguyên cho tế bào thực bào hoạt động chức năng.
Có hai loại tế bào thực bào:
Bạch cầu đơn nhân và đại thực bào.
Bạch cầu có hạt.
Da và lớp nhớt của cá

Với vai trò tham gia quan trọng của các tế bào lympho B. Ở cá, do thiếu tủy
sống, sự trưởng thành và tăng sinh của các tế bào lympho B diễn ra ở lách và phần
trước của thận (Đỗ Ngọc Liên, 1999).
Cá chỉ tổng hợp được một lớp Ig (immunoglobulin) tương đương với IgM ở
thú. IgM ở cá xương có dạng tetreametric, ở cá sụn có dạng pentametric, trong khi ở cá
mập và cá đuối có dạng monometric (Ambrosius và ctv., 1982; trích bởi Stoskopf S.
K., 1993). IgM là dạng Ig chủ yếu được tạo ra trong các đáp ứng miễn dịch thì đầu ở

21
thú. Ở cá không có kháng thể IgG. IgM có vai trò hoạt hóa bổ thể, có vai trò trong sự
opsonin hóa, trung hòa virus và sự ngưng kết (Tizard, 1987; trích bởi Stoskopf S.K.,
1993).
Ở lớp nhớt của cá cũng có sự có mặt của các kháng thể loại IgM và Ig tương tự
như IgA ở thú (St-Louis-Cornier và ctv., 1984; Lobb, 1987; trích bởi Stoskopf, 1993).
Miễn dịch qua trung gian tế bào:
Các lympho bào T sinh ra từ tuyến ức của cá giúp cho sự đáp ứng miễn dịch
qua trung gian tế bào . Sau các đáp ứng của đại thực bào, các lympho bào T – helper sẽ
được kích hoạt, trưởng thành thành các tế bào effector. Nó nhận diện được kháng
nguyên và gắn bám vào kháng nguyên thông qua các thể nhận trên bề mặt của các đại
thực bào, từ đó kích thích đại thực bào sản sinh các loại cytokine. Cytokine tác động
gián tiếp gây ra một loạt các phản ứng nhờ các quần thể tế bào khác.
2.8. Giới thiệu về chất bổ trợ
2.8.1. Nguyên lý tác dụng của chất bổ trợ
Cơ chế tác động của chất bổ trợ dùng trong vaccine được giải thích như sau:
Chất bổ trợ có tác dụng gây viêm, kích thích quá trình thực bào, giúp quá
trình đáp ứng miễn dịch xảy ra mạnh hơn.
Các chất bổ trợ hấp thu kháng nguyên và thải kháng nguyên từ từ ra từ chỗ
tiêm.
Chất bổ trợ còn có tác dụng lên tế bào lympho T hỗ trợ (T
H

có tính an toàn cao, nghĩa là không gây phản ứng phụ sau khi tiêm (Nguyễn Mạnh
Thắng, 2003).
2.9. Một số nét về vaccine phòng bệnh cho cá
2.9.1. Nguyên tắc ứng dụng vaccine
Nguyên tắc của việc ứng dụng vaccine là dựa vào hai đặc tính cơ bản của đáp
ứng miễn dịch đặc hiệu. Đó là tính đặc hiệu và sự ghi nhớ miễn dịch. Các tế bào ghi
nhớ cho phép hệ thống miễn dịch phát triển sự đáp ứng mạnh hơn khi có lần tiếp xúc
lặp lại với kháng nguyên. Sự đáp ứng thứ cấp này đồng thời nhanh hơn và có hiệu quả
hơn sự đáp ứng ban đầu. Nguyên tắc của vaccine là sử dụng các vi sinh vật (vi khuẩn,
virus) hoặc độc tố của chúng đã được cải biến (làm yếu, gây chết) làm cho chúng trở
nên một tác nhân không gây bệnh nhưng không làm mất tính kháng nguyên của chúng
(Nguyễn Đình Bảng và Nguyễn Thị Kim Hương, 2003).
Miễn dịch học cá có lịch sử ngắn hơn nhiều so với miễn dịch học người và thú.
Báo cáo đầu tiên về vaccine trên cá là nghiên cứu về vaccine phòng bệnh furunculosis
của Duff vào năm 1942 (Souter, 1983), đến nay đã có nhiều công trình nghiêu cứu về
vaccine cho cá. Đặc biệt từ khi nhiều nhược điểm của các biện pháp phòng trị bệnh
theo con đường hoá trị liệu bộc lộ nhiều nhược điểm, gây tác hại đến người tiêu dùng
và môi trường, việc nghiên cứu và sử dụng vaccine phòng bệnh cho cá càng thêm sự
khích lệ. Nhưng để đạt được một loại vaccine hiệu quả cả về mặt kinh tế và môi
trường thật là khó (Aasjord và Slinde, 1994). Kể từ năm 1976 cho đến năm 1993,
trong vòng gần 20 năm chỉ có 3 loại vaccine cho cá được thương mại hoá, đó là:
vaccine phòng bệnh enteric – redmouth, vaccine phòng bệnh furunculosis, vaccine
phòng bệnh do vibrio (Souter, 1983).
2.9.2 Các dạng vaccine dùng cho cá
Vaccine chết (killed vaccine) là dạng vi sinh vật đã được bất hoạt thông qua các
phương pháp xử lí hoá – lí. Hầu hết các vacine được thương mại hiện nay để phòng

23
các bệnh trên động vật thuỷ sản đều dựa vào phương pháp xử lí bằng formalin (Austin,
1984; trích bởi Stoskopf S. K., 1993). Ngoài ra còn sử dụng một số hoá chất như:


24
Kháng nguyên (Antigen)
Kháng nguyên là những dị chất đối với cơ thể, có đặc tính khi vào cơ thể sẽ
kích thích sinh ra những chất phản ứng đặc hiệu, đối lập với chúng, gọi là kháng thể.
Kháng thể sinh ra sẽ phản ứng một cách đặc hiệu với kháng nguyên tương ứng
(Nguyễn Vĩnh Phước, 1979).
Kháng thể (Antibody)
Kháng thể là các protein của huyết thanh được gọi tên chung là globulin miễn
dịch (immunoglobulin), được sinh ra trong huyết thanh khi một kháng nguyên xâm
nhập vào cơ thể, cơ thể phản ứng bằng cách sản sinh ra kháng thể để chống lại kháng
nguyên. Tính chất đặc hiệu của kháng thể là kết hợp một cách đặc hiệu với kháng
nguyên đã sinh ra nó (Đặng Đức Trạch và ctv., 1987; trích bởi Hoàng Hải Hóa, 2001).
2.10.2 Phản ứng ngƣng kết
Là sự dính các vi khuẩn vào nhau thành đám nhờ có kháng thể tương ứng và
khi có mặt dung dịch nước muối sinh lí (chất điện phân) (Vương Thị Việt Hoa và ctv.,
1999).
Đối với các kháng nguyên hữu hình như xác vi khuẩn, khi gặp kháng thể đặc
hiệu, các vi khuẩn sẽ kết lại với nhau thành đám lớn, mắt thường có thể quan sát được.
Đó là hiện tượng ngưng kết trực tiếp.
Khi cơ thể được miễn dịch, trong huyết thanh có chứa nhiều kháng thể đặc hiệu.
Khi cho kháng nguyên hữu hình (tế bào vi khuẩn đã chết) trộn với kháng thể đặc hiệu
tương ứng, các vi khuẩn phân tán rời xa nhau trong hỗn dịch, sẽ kết lại với nhau qua
cầu nối kháng thể đặc hiệu. Do mỗi cầu nối với các kháng nguyên dưới hình thức
mạng lưới nhiều chiều, tạo nên những đám ngưng kết biểu hiện bằng những đám
ngưng kết lổn nhổn như những hạt cát hoặc những cụm bông lơ lửng.
Trong thực tế, phản ứng ngưng kết xảy ra được còn phụ thuộc nhiều điều kiện
khác nhau. (Lê Văn Hùng, 2002).
Kháng thể gây ngưng kết gọi là kháng thể ngưng kết, còn kháng nguyên kích
thích sinh ra kháng thể ngưng kết gọi là kháng nguyên ngưng kết. Phản ứng tạo ra cặn

 Thiết bị
Kính hiển vi
Tủ lạnh
Cân phân tích
Bể xi măng nuôi 0,75 m
3

Máy sục khí
Máy lắc (Stuart Scientific)

26
Máy ly tâm (Hettich Zentrifugen)
 Vật liệu
Vi khuẩn Streptococcus sp. phân lập từ cá bị nhiễm bệnh do Streptococcus
sp. tại thời điểm thực hiện đề tài.
Thỏ
Cá rô phi đỏ
 Hóa chất
Nước cất
Dầu khoáng
Cồn 96
o

Nước muối sinh lý 0,9%
Môi trường thạch dinh dưỡng NA (Nutrient Agar)
Môi trường canh dinh dưỡng NB (Nutrient Broth)
Glycerol
Thuốc gây mê (Ethylenglycol monophenylether – C
2
H

Lấy mẫu vi khuẩn (gan, thận, não)

Cấy mẫu lên môi trường NA

Xem xét khuẩn lạc

Ghi nhận kết quả
 Phƣơng pháp kiểm tra dấu hiệu bên ngoài và mổ khám bệnh tích
-Kiểm tra các dấu hiệu bên ngoài: quan sát cách cá bơi, mắt, vảy, da, vây bụng,
hậu môn và mang của cá bệnh, nhận định sự khác biệt so với cá khỏe.
-Mổ khám bệnh tích bên trong:
+Mổ xoang bụng cá: trước khi tiến hành mổ cá, cá cần được đánh vẩy sạch tại
vị trí cần mổ, sau đó dùng bông tẩm cồn 70
o
sát trùng thật kĩ tại khu vực mổ để tránh
sự nhiễm tạp của các vi khuẩn từ bên ngoài.
-Đặt cá với phần bụng quay về phía người mổ.
-Cắt bỏ vây lưng và vây ngực.
-Mổ xoang bụng cá bằng 3 đường cắt:
Đường thứ nhất: bắt đầu từ phía trước hậu môn cho đến phần đầu, dừng trước
nắp mang.
Đường thứ hai: bắt đầu từ trước hậu môn hướng lên phía trên theo thành bụng
tiếp giáp thân về phía đầu đến phần mở của mang cá.
Đường thứ ba: nối hai đường cắt trên.

28
Não cá
(màu trắng đục)

Hình 3.1 : Đƣờng cắt giải phẫu xoang cơ thể cá.

hành lưu trữ vi khuẩn làm giống trong môi trường canh NB có bổ sung 50% glycerol
(v/v).
Để quan sát hình thái vi khuẩn, ta thực hiện bằng cách: dùng que cấy lấy một ít
khuẩn từ một khuẩn lạc có hình thái đặc trưng trên cho lên lam kính có sẵn một giọt
nước muối sinh lí, quan sát hình thái vi khuẩn với vật kính 40 của kính hiển vi.
Streptococcus sp. có dạng hình cầu, có thể đứng riêng lẻ, thành từng cặp hoặc tạo
thành chuỗi dài. Trong môi trường canh, Streptococcus sp. có dạng chuỗi dài hơn
trong môi trường thạch.
3.3.4. Phƣơng pháp nuôi cấy và thu sinh khối vi khuẩn Streptococcus sp.
dạng FKC (Formalin Killed Cell)
 Phƣơng pháp nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn
Dùng que cấy vòng đã khử trùng lấy một ít vi khuẩn từ ống giống vi khuẩn gốc
cấy lên đĩa môi trường NA, ủ ở nhiệt độ phòng trong 24h. Đây là bước tăng sinh sơ
khởi (tiền tăng sinh) để chọn được khuẩn lạc như mong muốn và số lượng cần thiết.

30
Chọn khuẩn lạc mong muốn cấy vào bình môi trường NB. Nút chặt bình, nuôi
cấy lắc ở nhiệt độ phòng trong 24h. Yêu cầu là bình nuôi cấy phải lớn để có thể thu
được sinh khối vi khuẩn mong muốn.
 Phƣơng pháp tạo FKC
Sau 24 h nuôi cấy, môi trường trở nên đục do vi khuẩn phát triển nhiều. Để
kiểm tra sự tạp nhiễm, lấy mẫu cho lên lam kính, quan sát dưới kính hiển vi với vật
kính 40, xem xét hình thái đặc trưng của vi khuẩn và các vi sinh vật có hình thái khác.
Dùng pipette hút dung dịch formalin 36% với số thể tích bằng 0,5% thể tích
môi trường có trong bình (Theo Aasjord P. M. và Slinde E., 1994). Trộn đều, để qua
đêm. Với nồng độ trên, formalin sẽ giết chết hết số vi khuẩn có trong bình.
Đem li tâm huyền dịch vi khuẩn ở 6000 vòng/phút trong 20 phút. Hút bỏ phần
nước nổi. Rửa lại bằng nước muối sinh lí 0,9% liên tiếp 3 lần để xả sạch hết formalin.
Xác vi khuẩn thu được sẽ có màu trắng, đựơc gọi là vi khuẩn dạng FKC. Số vi khuẩn
thu được đem cân để xác định khối lượng, rồi pha loãng bằng nước muối sinh lí để thu

xi lanh. Vì máu cá ít cho nên cần phải thao tác nhanh, nếu không máu sẽ đông lại bịt
kín mũi kim gây trở ngại cho thao tác lấy.
Máu lấy được cho chảy từ từ vào thành xi lanh rồi để nằm nghiêng trong 15 –
20 phút cho máu đông lại. Cần nới pitton ra xa phần máu để tạo khoảng trống cho
huyết thanh chảy ra, cũng như khi thu huyết thanh sẽ không làm vỡ hồng cầu, ảnh
hưởng đến chất lượng huyết thanh. Mẫu máu thu được được mang lên phòng thí
nghiệm để thu huyết thanh và thử phản ứng ngưng kết. Nếu chưa thực hiện công việc
tiếp theo thì để mẫu máu qua đêm trong ngăn mát của tủ lạnh.
Lấy máu trên thỏ: Thỏ được lấy máu ở tĩnh mạch vành tai. Các chú ý khi lấy
máu thỏ cũng tương tự như lấy máu trên cá. Hình 3.3. Thao tác lấy mẫu máu trên cá

32

Thu huyết thanh
Có thể thu huyết thanh bằng cách chắt lấy huyết thanh sau khi để xi lanh nằm
nghiêng, các thành phần trong huyết tương đã đông lại. Hoặc li tâm mẫu máu, cách
này sẽ thu được nhiều huyết thanh và huyết thanh trong hơn.
3.3.7. Phƣơng pháp thực hiện phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính
Dùng một phiến kính sạch, nhỏ lên đó một giọt huyết thanh của cá hay thỏ, sau
đó nhỏ vào một giọt kháng nguyên đã biết, trộn đều, đọc kết quả trong vài phút. Nếu
trong huyết thanh có kháng thể tương ứng thì sự kết hợp kháng nguyên – kháng thể sẽ
tạo thành đám ngưng kết dạng lấm tấm như hạt cát hay dạng bông. Phản ứng ngưng
kết mạnh khi cho kết quả trong 5 phút.
Để so sánh, thực hiện mẫu đối chứng tương tự như trên nhưng với một kháng
nguyên khác.
D1
C1
B1
A1
Nước muối sinh lý ( l)

25
25
25
25
25
25
25
Huyết thanh ( l)
25
25
Vi khuẩn ( l)
25
25
25
25
25
25
25

tâm có nắp và lắc mạnh. Dùng ống tiêm 5ml hút dung dịch trên.
+ Cắt lông lưng thỏ một vùng rộng phía mặt lưng, tiêm 1ml dung dịch trên dưới
da thỏ. Sau đó, thỏ được tiêm huyền dịch FKC lặp lại theo định kỳ: sau 2 tuần (14
ngày), 4 tuần (28 ngày), 5 tuần (35 tuần). Thỏ đối chứng tiêm nước muối sinh lí. Đồng
thời tại các thời điểm này, chúng ta lấy mẫu máu từ thỏ, thu huyết thanh và thử phản
ứng ngưng kết với kháng nguyên (vi khuẩn Streptococcus sp.) để xác định mức độ tạo
kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên. Trên thỏ đối chứng cũng thực hiện cách thử
nghiệm tương tự như trên.
Bảng 3.1 : Lịch tiêm huyền dịch vi khuẩn Streptococcus sp.
dạng FKC cho thỏ

Ngày tiêm
Loại để tiêm
Vị trí tiêm
Liều tiêm (ml)
Ngày lấy máu
Ngày thứ 1
Ngày thứ 14
Ngày thứ 28
Ngày thứ 35
Ngày thứ 42
FKC + DK
FKC + DK
FKC + DK
FKC
FKC
Dưới da
Dưới da
Dưới da
Dưới da

mục 3.3.4.
+ Vi khuẩn Streptococcus sp.: cùng dòng vi khuẩn điều chế FKC. Trước tiên vi
khuẩn được nưôi cấy tăng sinh trên môi trường thạch NA, ủ ở nhiệt độ phòng trong
24h. Sau đó thu nhân sinh khối vi khuẩn. Pha loãng vi khuẩn bằng nước muối sinh lí
0,9%. Vi khuẩn được xác định nồng độ bằng cách thực hiện theo phương pháp đếm
khuẩn lạc trên đĩa thạch.
Cách thực hiện:
Thí nghiệm được bố trí thành 6 lô gồm: 3 lô thí nghiệm (E1, E2, E3) và 3 lô đối
chứng (C1, C2, C3) với các mật độ cá nuôi khác nhau: 25 con (mật độ nuôi thấp), 50
con (mật độ nuôi trung bình), 100 con (mật độ nuôi cao).
Tiêm cá vi khuẩn Streptococcus sp. dạng FKC như mục 3.3.5. Cá ở lô đối
chứng tiêm nước muối sinh lí.
14 ngày sau khi chủng cá, thực hiện gây cảm nhiễm (tiêm thử thách) tất cả số cá
(cả lô thí nghiệm và lô đối chứng) với vi khuẩn Streptococcus sp. còn sống có nồng
độ 8,5*10
5
CFU/ml với liều tiêm và cách tiêm như mục 3.3.5. Sau khi gây cảm nhiễm,
cá không được cho ăn.
Tiếp tục theo dõi trong 14 ngày, mỗi ngày kiểm tra xem có cá chết hay hấp hối
không. Nếu có thì tiến hành phân tích quan sát dấu hiệu, mổ khám bệnh tích và phân
lập vi khuẩn để xác định nguyên nhân. Sau thời gian thí nghiệm, tất cả số cá còn lại
được giải phẩu để phân lập vi khuẩn gây bệnh giống như phân lập mẫu cá bệnh thu
ngoài tự nhiên. 36 Hình 3.6: Bể bố trí thí nghiệm 2
Tóm tắt thí nghiệm được thể hiện qua bảng 3.2

8,5*10
5
0,1/0,2
14
100
FKC
0,1/0,2
8,5*10
5
0,1/0,2
14
25
NMSL
0,1/0,2
8,5*10
5
0,1/0,2
14
50
NMSL
0,1/0,2
8,5*10
5
0,1/0,2
14
100
NMSL
0,1/0,2
8,5*10
5