13

Montero và Austin (1999 ) cho rằng lipopolysaccharide có thể hình thành nên độc tố
gây chết của V. harveyi dòng E2 đối với tôm.
Nhìn chung hemolysin của vi khuẩn đã được coi là yếu tố quan trọng của các
Vibrio gây bệnh bằng cách gây nhiễm trùng máu và tiêu chảy ở vật chủ (Zhang, 2001).
2.2.2. Dấu hiệu bệnh
Cần phân biệt rõ sự phát triển bệnh trên tôm. Nếu trong bể tôm có các đốm sáng
lớn trên những con tôm chết, đó là do các tập đoàn Coccobacilli tấn công vào các con
gây chết phát sáng, hiện tượng lâm sàng này không quan trọng. Khi nước biển xử lý
không tốt sẽ thường gặp hiện tượng này. Nếu phát sáng trên các con sống, đốm sáng
rất nhỏ bên trong cơ thể của tôm thì đó là bệnh do V. harveyi và V. splendidus gây nên
(Phạm Văn Tình, 2000).
 Dầu hiệu bên ngoài
Dấu hiệu để nhận biết tôm bị bệnh phát sáng là: tôm yếu lờ đờ, kém bắt mồi
hoặc bỏ ăn, có màu sậm hoặc trắng đục. Màu sắc cơ thể đôi khi chuyển sang màu
hồng. Tôm bơi nổi, tấp mé, phát sáng phần đầu ngực hay toàn thân (quan sát đuợc
trong bóng tối), có thể nhiễm 100% đàn tôm. Tôm bệnh có thể bị đóng rong ở mang và
vỏ, gan tôm bị teo lại, sẫm màu, tôm chậm lớn. Tôm có thể bị chết rải rác (10 – 20%)
và có thể tăng lên nếu trong giai đoạn 45 ngày nuôi đầu tiên (Đỗ Thị Hòa và ctv,
2001).
Khi tôm nhiễm khuẩn toàn thân, thì tỷ lệ chết có thể lên đến 100% (Lý Thị
Thanh Loan, 1999). Ấu trùng có thể chết từ rải rác tới hàng loạt đặc biệt ở giai đoạn
tiền ấu trùng (Zoae, Mysis) (Đỗ Thị Hòa và ctv, 2001).
 Dấu hiệu mô học
Tôm bị bệnh nặng, soi dưới kính hiển vi mẫu xoang bạch huyết và mẫu ruột
thấy dày đặc những vi khuẩn di động, cơ quan chủ yếu nhiễm khuẩn là gan tụy (Lý Thị
Thanh Loan, 1999).
14

Tôm giống dưới 45 ngày nuôi bị nhiễm bệnh phát sáng có biểu hiện tế bào ống

2.3. Các phương pháp chẩn đoán bệnh phát sáng trên tôm
2.3.1. Phương pháp vi khuẩn học
Nuôi cấy tăng sinh khối trong môi trường canh TSB, phân lập giống thuần trên
môi trường TCBS, quan sát chọn những khuẩn lạc phát sáng trên đĩa cấy, cấy tăng sinh
các khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường BHIA, sau đó định danh vi khuẩn bằng các
phản ứng sinh hóa theo khóa phân loại Bergey (Jonh và ctv, 1994).
Phương pháp này có ưu điểm là đơn giản, dễ thực hiện và ít tốn kém. Tuy nhiên
nó có nhược điểm là mất nhiều thời gian để thực hiện.
2.3.2. Phương pháp mô học
Tìm thấy các vi khuẩn hình que trong các mẫu mô tôm bệnh khi quan sát dưới
kính hiển vi. Phương pháp này đòi hỏi người thực hiện phải có chuyên môn và kỹ
thuật cao (Lý Thị Thanh Loan, 1999).
2.3.3. Phương pháp miễn dịch học
Kỹ thuật ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assays) có thể được sử dụng
để phát hiện bệnh phát sáng do V. harveyi trên tôm. Phương pháp này được thực hiện
dựa trên nguyên tắc bắt dính đặc hiệu của kháng nguyên và kháng thể. Phương pháp
này có thể xác định nhanh V. harveyi từ mẫu tôm, mẫu nước và có thể xác định tất cả
các dòng V. harveyi (Robertson và ctv, 1998).
2.3.4. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
Hiện nay có thể dùng kỹ thuật khuếch đại DNA để chẩn đoán nhanh bệnh do
Vibrio trong vài giờ mà không phải mất nhiều thời gian để phân lập vi khuẩn. Nguyên
tắc của phương pháp này là phát hiện một đoạn DNA đặc hiệu cho V. harveyi (Ruiz và
16

Smith, 2005) Tuy phương pháp này cho phép xác định nhanh tác nhân gây bệnh nhưng
chi phí để thực hiện lại quá tốn kém và đòi hỏi phải đầu tư trang thiết bị cao.
2.4. Một số loài thảo dược có tiềm năng trong việc điều trị bệnh phát sáng
trên tôm
Ngày nay, việc sử dụng các loại hóa chất và kháng sinh trong nuôi tôm đã kéo
theo các tác động xấu ảnh hưởng đến môi trường và sức khỏe của con người. Theo xu

dụng.
Từ các kết quả nghiên cứu ban đầu, thảo dược trong tương lai có thể được xem
là một trong những giải pháp hiệu quả và bền vững cho việc điều trị bệnh phát sáng
trên tôm. Tuy nhiên, đây chỉ là những kết quả ban đầu, để có thể đưa chúng vào sử
dụng trong thực tế cần phải có những nghiên cứu khác kỹ hơn để đánh giá hiệu quả tác
động của chúng trong thực tiễn sản xuất, cũng như nắm được cơ chế tác dụng và kiểm
tra tính an toàn của chúng đối với tôm.
Sau đây là đặc điểm của vài loài thảo dược mà bước đầu đã được nghiên cứu và
xác định là có khả năng điều trị bệnh phát sáng trên tôm:
2.4.1. Nhục đậu khấu
Nhục đậu khấu còn gọi là nhục quả, muscade (Pháp), nutmeg (Anh). Tên khoa
học là Myristica fragrans thuộc họ Myristicaceae.
Nhục đậu khấu thuộc loại cây to, cao 8-10m. Toàn thân nhẵn. Lá mọc so le,
xanh tươi quanh năm. Màu hoa vàng trắng. Quả hạch, hình cầu hay quả lê, màu vàng,
đường kính 5-8cm, khi chín nở theo chiều dọc thành 2 mảnh, trong chứa một hạt có vỏ
dày cứng, bao bọc bởi một áo hạt bị rách màu hồng.
Nhục đậu khấu là loại cây ưa khí hậu nóng ẩm, được trồng nhiều ở vùng nhiệt
đới.
Trong cây có chứa một loại tinh dầu thơm, dễ bay hơi, trong đó Myristicin
(C
11
H
12
O
3
) chiếm 4% thành phần hóa học của tinh dầu này. Về mặt cấu trúc hóa học,
Myristicin giống tương tự 3 loại ether thơm khác là eugenol, isoeugenol và safrol. Hợp
chất này được xem là một chất dược liệu quý trong y học
18


hoại thư và bệnh lao phổi. Eugenol rất thông dụng trong nha khoa (làm chất hàn răng
tạm eugenat, làm thuốc điều trị viêm ngà, viêm xương ổ răng, làm toả bạc khi tráng
bạc trên răng), trong việc điều trị răng mòn, tê buốt (Chatterjee và ctv, 1982).
2.4.4. Cây sả
Sả hay còn gọi là Mao hương có tên khoa học là Cymbopogon citratus, thuộc
họ Lúa - Poaceae.
Sả là cây thảo sống lâu năm, mọc thành bụi, phân nhánh nhiều, cao khoảng
1,5m. Thân rễ trắng hoặc hơi tím. Lá dài đến 1m, hẹp, mép hơi ráp; bẹ trắng, rộng.
Cụm hoa gồm nhiều bông nhỏ không cuống.
Là một loài liên nhiệt đới mọc hoang và được trồng lấy củ, lá làm gia vị và làm
thuốc.

Hình 2.3. Cây sả (Shahi và ctv, 2005)
20

Thành phần hoá học: Củ Sả chứa 1 – 2% tinh dầu màu vàng nhạt, thơm mùi
chanh, mà thành phần chủ yếu là citral (65 – 85%), geraniol (40%).
Ngoài công dụng dùng làm gia vị, Sả đã được dùng làm thuốc trong nhân dân.
Sả được dùng để chữa: cảm mạo, nóng sốt đau đầu, đau dạ dày, ỉa chảy, phong thấp tê
đau, đòn ngã tổn thương… Người ta còn dùng toàn cây Sả chưng cất tinh dầu; tinh dầu
Sả dùng khử mùi hôi tanh, xua ruồi muỗi. Dùng xoa ngoài chữa cúm và phòng bệnh
truyền nhiễm (Shahi và ctv, 2005).
2.4.5. Cây ổi
Ổi có tên khoa hoc là Psidium guajava, thuộc họ Sim - Myrtaceae.
Cây cao khoảng 5 – 10m. Vỏ nhẵn, mỏng, khi già bong từng mảng lớn. Cành
non vuông, có nhiều lông mềm, về sau hình trụ và nhẵn. Lá mọc đối, thuôn hay hình
trái xoan, gốc tù hay gần tròn, gân lá nổi rõ ở mặt dưới. Hoa trắng, mọc đơn độc hay
tập trung 2 – 3 cái thành cụm ở nách lá. Quả mọng hình cầu, chứa rất nhiều hạt hình
bầu dục. Ðài hoa tồn tại trên quả.


lượng của sản phẩm, góp phần thúc đẩy nền kinh tế của xã hội loài người phát triển đi
lên một cách bền vững.
Từ khi dịch bệnh phát sáng do Vibrio trên tôm bùng nổ, đã có nhiều công trình
nghiên cứu được tiến hành nhằm kiểm soát và ngăn chặn dịch bệnh này, trong đó đã có
nhiều kết quả nghiên cứu đã được ứng dụng vào trong hoạt động sản xuất thực tiễn.
Các nhà khoa học nhìn nhận trong thời gian sắp tới việc ứng dụng của công nghệ sinh
22

học vào việc giải quyết vấn đề bệnh phát sáng trên tôm sẽ tập trung vào hai hướng
chính đó là: các phương pháp chẩn đoán phát hiện bệnh và các sản phẩm để ngăn chặn,
kiểm soát dịch bệnh.
2.5.1. Ứng dụng của công nghệ sinh học trong việc chẩn đoán phát hiện
bệnh phát sáng do Vibrio trên tôm
Các kỹ thuật chẩn đoán phát hiện bệnh trên tôm ngày nay đã có nhiều tiến bộ
nhờ việc áp dụng các thành tựu nghiên cứu của công nghệ sinh học, đặc biệt là công
nghệ sinh học phân tử. Việc sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để phát hiện bệnh
trên tôm đã trở nên phổ biến và được sử dụng rộng rãi ở nhiều nơi. Các kỹ thuật như
ELISA và PCR đã được sử dụng để phát hiện các bệnh phổ biến trên tôm, đặc biệt là
các bệnh do virus như bệnh đốm trắng do WSSV, bệnh đầu vàng… Ưu điểm của các
phương pháp này là tính chính xác và rút ngắn được thời gian phát hiện. Đã có mhiều
đề xuất về sử dụng các kỹ thuật như ELISA và PCR cho việc phát hiện nhanh bệnh
phát sáng do Vibrio trên tôm. Việc tìm các đoạn DNA và tạo ra các kháng thể bắt dính
kháng nguyên đặc trưng của Vibrio đã được nhiều nhà khoa học tiến hành nghiên cứu.
Năm 1998, Robertson và ctv đã nghiên cứu tạo ra một kháng thể đa dòng từ thỏ có thể
dùng để phát hiện nhiều dòng V. harveyi. Theo các phương pháp này thời gian phát
hiện bệnh được rút ngắn rất nhiều. Tuy nhiên, hiện nay tại nhiều nơi trên thế giới,
người ta vẫn chủ yếu sử dụng phương pháp phân lập vi khuẩn để phát hiện bệnh phát
sáng do chi phí để thực hiện phương pháp này thấp hơn các phương pháp ELISA và
PCR. Do hạn chế về tính kinh tế nên đây sẽ là một hướng không khả thi trong thời
gian sắp tới.

Alteromonas sp. P7 là một vi khuẩn gram âm, di động, hình que, có cytochrome
oxidase, có khả năng tổng hợp chất sắc tố trong môi trường nước biển. Chúng có khả
năng phát triển ở nồng độ muối NaCl 6% và không phát triển trên môi trường agar có
chứa sucrose, muối mật, thiosulphate citrate, trên môi trường Mac Conkey, hoặc trên
môi trường không có NaCl. Vi khuẩn này không có khả năng phát sáng, không có
enzyme amylase, gelatinase, catalase, urease và không khả năng tạo vòng indole cũng
như biến đổi nitrate. Alteromonas sp. P7 có thể sử dụng citrate như nguồn carbon duy
nhất và không có khả năng sử dụng các nguồn carbon khác như là arabinose, dextrose,
24

galactose, lactose, mannitol, sorbitol và sucrose. Với những đặc điểm này, người ta đã
xếp vi khuẩn này vào loài Alteromonas và được chỉ định là Alteromonas sp. P7
(Abraham, 2004).
Người ta đã phân lập Alteromonas sp. P7 từ các ấu trùng Fabricius của tôm sú và
nhận thấy chúng có khả năng chống lại V. harveyi. Tất cả các dòng V. harveyi phân lập
được bị ức chế theo các mức độ khác nhau bởi Alteromonas sp. P7 ở trong phòng thí
nghiệm. Hợp chất kháng khuẩn được tạo ra bởi Alteromonas sp. P7 có thể hòa tan trong
dung môi hữu cơ và bám dính chặt lên bề mặt của các tế bào vi khuẩn và hợp chất này
không bị phân hủy khi xử lý bằng trypsin (Okereke và Montville, 1991). Từ đó, người ta
cho rằng hợp chất này có thể không phải là các protein có trong tự nhiên mặc dù các dòng
Alteromonas xác định đã được báo cáo là sản xuất các hợp chất protein kháng khuẩn (Mc
Carthy, 1994). Các chất kháng khuẩn được thải ra ngoài là sản phẩm của quá trình biến
dưỡng thứ cấp. Người ta cho rằng các chất kháng khuẩn này có thể là một pyrole hoặc
quinolinol hoặc tyrosol và isatin hoặc là một đường đa có khả năng tan trong ethyl acetate
(T. J. Abraham, 2004).
Các thí nghiệm được tiến hành đã chỉ ra rằng Alteromonas sp. P7 giúp giảm rõ
rệt tỷ lệ chết ở ấu trùng tôm sú in vivo từ V. harveyi M3 bằng cách ngăn chặn sự phát
triển và sinh sản của các vi khuẩn gây bệnh (Abraham, 2004).
Gần đây, tại nhiều nơi trên thế giới đã nổi lên các đề tài nghiên cứu về khả năng
ứng dụng của phage trong lĩnh vực thủy sản. Fraser (2003) và một số nhà khoa học

26

Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1. Thời gian và địa điểm
3.1.1. Thời gian
Từ 21/03/2005 đến 26/06/2005.
3.1.2. Địa điểm
- Phòng Bệnh học Thủy sản – Trung tâm Quan trắc – Viện Nghiên cứu Nuôi
trồng Thủy sản II.
- Trại Thực nghiệm nuôi Thủy sản Thủ Đức – Viện Nghiên cứu Nuôi trồng
Thủy sản II.
3.2. Vật liệu và đối tượng nghiên cứu
3.2.1. Vật liệu
Hợp chất chiết xuất từ các thảo dược ký hiệu là B
2
thuộc họ Fabaceae, L, L
2
và
M thuộc họ Asteraceae.
3.2.2. Đối tượng nghiên cứu
- Tôm sú không mang các mầm bệnh để bố trí thí nghiệm, trọng lượng bình
quân từ 15 – 20 g/con.
- Giống vi khuẩn V. harveyi thuần chủng, phân lập từ tôm bệnh.
3.2.3. Dụng cụ và hóa chất
3.2.3.1. Dụng cụ
- Dụng cụ bố trí thí nghiệm: bể nuôi, hệ thống sục khí, vợt thùng, thau

2
, L, L
2
và M theo phương
pháp kháng sinh đồ. Mục tiêu là sàng lọc các chất có hiệu quả và xác định các mức
nồng độ có ý nghĩa của chất đó đối với vi khuẩn V. harveyi trong phòng thí nghiệm.
Gồm các bước sau:

28

Sơ đồ 1. Bố trí thử nghiệm tác dụng của các hợp chất
3.3.1.1. Phân lập dòng thuần Vibrio harveyi
- Lấy mẫu: chọn ngẫu nhiên 2-3 con tôm nuôi ao có dấu hiệu nhiễm khuẩn.
- Lấy máu tôm: mỗi con 0,1 ml, sau đó nhỏ lên các đĩa cấy chứa môi trường
TCBS, dàn đều khắp bề mặt môi trường, mỗi con cấy lên 1 đĩa. Ủ trong tủ
ấm ở 30
0
C trong 24 giờ.
- Chọn khuẩn lạc phát sáng trên môi trường TCBS cấy chuyền sang môi
trường BHIA (có bổ sung 2% NaCl). Ủ trong tủ ấm ở 30
0

Ống số 1 2
3
4 5 6 7 8 9 10
BaCl
2
1%(ml) 0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

H
2
SO
4
1%(ml) 9,9

tan các hợp chất thảo dược trong dung môi DMSO với các nồng độ dự kiến
thử nghiệm tùy vào mức độ tan của các hợp chất trong dung môi. Cụ thể,
các nồng độ cho từng hợp chất là:
+ Hợp chất B
2
: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 và 100 µg/µl.
30

+ Hợp chất L: 600, 700, 800, 900, và 1000 µg/µl.
+ Hợp chất L
2
: 600, 700, 800, 900 và 1000 µg/µl.
+ Hợp chất M: 200, 300, 400, 500, 600 và 700 µg/µl.
- Dùng pippet hút 5 µl các hợp chất cần thử nghiệm tẩm vào các đĩa giấy.
- Chuẩn bị các đĩa môi trường MHA để thử kháng sinh đồ.
- Dùng pipet hút 0,5 ml dung dịch vi khuẩn cho vào môi trường MHA trong
đĩa petri, dàn đều dịch vi khuẩn lên đĩa thạch. Sau đó dùng pipet hút hết
phần dung dịch vi khuẩn thừa trên mặt thạch.
- Dùng kẹp vô khuẩn lấy các đĩa giấy đã tẩm các hợp chất hợp chất thử
nghiệm đặt lên bề mặt thạch, cách mép đĩa petri khoảng 2,5 cm, đảm bảo
mặt đĩa giấy tẩm hợp chất tiếp xúc phẳng với bề mặt thạch.
- Ủ các đĩa petri trong tủ ấm ở 30
0
C sau các khoảng thời gian 4 giờ, 8 giờ và
12 giờ kiểm tra và đo vòng vô khuẩn.
3.3.2. Thử nghiệm trong phòng ướt Wet-lab
Sau giai đoạn thử nghiệm trong phòng thí nghiệm, bước đầu đánh giá hợp chất M
là có hiệu quả nhất đối với V. harveyi. Giai đoạn tiếp theo là tiến hành thí nghiệm đánh
giá hiệu quả điều trị của hợp chất M đối với tôm đã cho nhiễm V. harveyi trong bể nuôi
trong phòng Wet-lab. Hai nồng độ của hợp chất M được chọn để thử nghiệm là 500 và

Tôm không mang các
m
ầm bệnh

Lô đối
chứng âm,
15 con
Lô đối
chứng dương,
15 con
Lô thử nghiệm nồng
độ 500 mg/kg, 15
con
Lô thử nghiệm nồng
độ 750 mg/kg, 15
con
Tiêm 0,05
ml nước
muối sinh
lý
Tiêm 0,05
ml dịch vi
khuẩn
Tiêm 0,05
ml dịch vi
khuẩn
Tiêm 0,05
ml dịch vi
khuẩn
Theo dõi biểu hiện của tôm

cơ thể/ngày.
- Lô thử nghiệm tác dụng của thuốc ở nồng độ 750 mg/kg: bố trí 3 bể, các
con tôm được gây cảm nhiễm 0,05 ml dung dịch vi khuẩn (10
6
CFU/ml) và
cho ăn thức ăn tổng hợp có tẩm hợp chất M với nồng độ 750 mg/kg trọng
lượng cơ thể/ngày.
Các con tôm sau khi tiêm được thả lại bể theo đúng bố trí. Chăm sóc và quan
sát các dấu hiệu biểu hiện bệnh bằng cách so sánh với đối chứng âm và đối chứng
dương. Quan sát theo dõi các biểu hiện của tôm, bắt đầu cho tôm ăn thức ăn có tẩm
thuốc ngay khi có biểu hiện bệnh.
3.3.2.1. Phương pháp kiểm tra các tính chất hoá lý của nước nuôi
Trong kỹ thuật nuôi tôm, vấn đề chất lượng nước nuôi rất quan trọng. Nước
nuôi tôm phải có các tính chất hoá lý phù hợp với tôm, nếu không có thể làm tôm bị
sốc và chết. Vì vậy trước khi thả tôm, cần phải tiến hành kiểm tra các tính chất hoá lý
của nước nuôi.
Phương pháp kiểm tra các tính chất hoá lý của nước:
- Đo độ mặn của nước biển bằng máy đo độ mặn.
- Đo pH: dùng pH meter cầm tay để đo pH.
- NH
3
/: sử dụng bộ test NH
3
của Sera.
- Đo COD: dùng KMnO
4
để oxy hóa các chất hữu cơ, sau đó dùng KI trung hòa
KMnO
4
dư và chuẩn độ bằng Na

nghiệm sẽ được kiểm tra bằng cách trải cho thật khô trên các đĩa thạch chứa môi
trường TCBS, mỗi lô sẽ cấy 3 đĩa: 2 đĩa cấy với 50 µl mẫu nước và một đĩa cấy với
100 µl mẫu nước.
Kiểm tra vi khuẩn trong tôm
- Mỗi lần lấy mẫu bắt khoảng 3 con ở mỗi bể.
- Tiến hành lấy mẫu máu tôm của từng con (0,1 ml).
- Sau đó mẫu máu của từng con sẽ được cấy trải lên 1 đĩa thạch chứa môi
trường TCBS. Ủ trong tủ ấm ở 30
0
C trong 24 giờ.
- Xác định các khuẩn lạc nghi ngờ là các khuẩn lạc màu lục, khi quan sát
trong tối thấy phát sáng.
- Cấy vi khuẩn sang môi trường BHIA + 2% NaCl, ủ trong tủ ấm ở 30
0
C
trong 24 giờ để tăng sinh khối vi khuẩn.
- Kiểm tra các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn: khả năng sử dụng các đường
glucose, sorbitol, manitol, sucrose, lactose, galactose; khả năng sử dụng
citrate như nguồn carbone duy nhất trên môi trường Simons Citrate Agar;
khả năng sinh gas từ glucose; khả năng phân giải Gelatin; khả năng khử
34

Nitrate; phản ứng Indol hoá; khả năng sử dụng các acid amin như arginine,
lysine, ornitine; phản ứng với esculine; khả năng sử dụng tinh bột; phản ứng
VP và phản ứng O/F (Jonh, 1994).
3.3.3. Phương pháp phân tích số liệu thống kê
Các số liệu thí nghiệm được xử lý sử dụng phần mềm thống kê SPSS và
EXCEL. SPSS là một chương trình phân tích số liệu tự động do máy tính thực hiện
dựa trên các công thức toán học đã được lập trình.
Các công thức toán học thường dùng trong phân tích thống kê (Nguyễn Văn

– X)
2

∑
n
i=1
n-1
1

S
2

=
X
35

Đặt giả thiết H
0
: m
1
= m
2

X
i
= X
1i
– X
2i


n
1
(X
i
– X)
2

∑
n
i=1
n-1
1

S
2

=
√S
2
/n
|X|
t(n-1) =