BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***************
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ TÁC DỤNG CỦA MỘT VÀI HỢP
CHẤT TỰ NHIÊN CHIẾT XUẤT TỪ THẢO MỘC TRONG
ĐIỀU TRỊ BỆNH PHÁT SÁNG DO Vibrio harveyi TRÊN
TÔM SÚ (Penaeus monodon)
Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2001 – 2005
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ĐÌNH NGHI
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2005
1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
**********
ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ TÁC DỤNG CỦA MỘT VÀI HỢP
CHẤT TỰ NHIÊN CHIẾT XUẤT TỪ THẢO MỘC TRONG
ĐIỀU TRỊ BỆNH PHÁT SÁNG DO Vibrio harveyi
TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon)
Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:
TS. LÝ THỊ THANH LOAN NGUYỄN ĐÌNH NGHI
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2005
2
LỜI CẢM TẠ
Đầu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô trong trường Đại học Nông
Lâm đã trang bị cho tôi những kiến thức quý giá trong suốt bốn năm đại học giúp tôi có
2
và M) là
M.
- Hợp chất M cho hiệu quả tốt kháng được V. harveyi và giúp giảm
tỷ lệ chết ở tôm khi cho tôm bệnh ăn thức ăn có trộn với hợp chất M ở nồng
độ 500 và 750 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày. Quan sát kết quả bước đầu cho
thấy hợp chất này không ảnh hưởng xấu tới sự phát triển của tôm.
ABSTRACT
NGUYEN DINH NGHI, Nong Lam University, Ho Chi Minh City, July/2005.
“EVALUATE THE EFFECT OF NATURAL SUBSTANCES EXTRACTED FROM
HERBS IN CURING VIBRIOSIS (Vibrio harveyi) ON BLACK TIGER SHRIMP
(Penaeus monodon).
Guiding council:
Dr. LY THI THANH LOAN
The subject was studied on V. harveyi, has recognized as a devastating pathogen
of shrimp. V. harveyi usually result in up to 100% mortality in larvae and postlarvae of
Penaeus shrimp. In this research, A antibiogram method was used to screen herbal
compounds possess antimicrobial activity against V. harveyi in vitro, combine with
disposing experiments to test effectivity of herbal compounds on shrimp in vivo.
Results:
- M compound was found out a highest effective compound against
V. harveyi among 4 herbal compounds (L, L
2
, M and B
2
compounds).
- M herbal compound showed activity against V. harveyi and
decreased mortality of shrimp when shrimp fed on diets supplemented with
500 and 750 mg/kg body weight/day of M compound. And this compound
didn’t have any damaging effect to the growing of shrimp.
2.4. Một số loài thảo dược có tiềm năng trong việc điều trị ...................................... 16
bệnh phát sáng trên tôm
2.4.1. Nhục đậu khấu ........................................................................................ 17
2.4.2. Cây Neem ................................................................................................ 18
2.4.3. Hương nhu tía .......................................................................................... 18
2.4.4. Cây sả ...................................................................................................... 19
2.4.5. Cây ổi ...................................................................................................... 20
2.5. Các hướng ứng dụng của công nghệ sinh học trong việc ................................... 21
ngăn chặn dịch bệnh phát sáng do Vibrio trên tôm trong tương lai
2.5.1. Ứng dụng của công nghệ sinh học trong việc chẩn ................................ 22
đoán phát hiện bệnh phát sáng do Vibrio trên tôm
2.5.2. Ứng dụng của công nghệ sinh học trong việc tạo ................................... 22
ra các chế phẩm dùng trong ngăn chặn và điều trị bệnh
phát sáng do Vibrio trên tôm
Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Thời gian và địa điểm ......................................................................................... 26
3.1.1. Thời gian ................................................................................................. 26
3.1.2. Địa điểm .................................................................................................. 26
3.2. Vật liệu và đối tượng nghiên cứu ....................................................................... 26
3.2.1. Vật liệu .................................................................................................... 26
3.2.2. Đối tượng nghiên cứu .............................................................................. 26
3.2.3. Dụng cụ và hóa chất ................................................................................ 26
3.2.3.1. Dụng cụ ........................................................................................ 26
3.2.3.2. Môi trường và hóa chất ................................................................ 27
3.3. Phương pháp tiến hành ....................................................................................... 27
3.3.1. Thử nghiệm trong phạm vi phòng thí nghiệm ........................................ 27
3.3.1.1. Phân lập dòng thuần Vibrio harveyi ............................................ 28
3.3.1.2. Phương pháp kháng sinh đồ ......................................................... 29
theo phương pháp Mc Farland
3.3.2. Thử nghiệm trong phòng ướt Wet-lab .................................................... 30
TCBS: Thiosulfate Citrate Bile salts Sucrose agar
TSB: Tryptone Soya Broth
VP: Voges Proskauer
WSSV: White Spot Syndrome Virus
YHV: Yellow Head Virus
LD: Lethal Dose
DANH SÁCH CÁC BẢNG
TRANG
Bảng 2.1. Đặc điểm sinh hóa học của V. harveyi ...................................................... 12
Bảng 3.1. Thành phần dung dịch của các ống nghiệm trong thí ............................... 29
nghiệm Mc Farland
Bảng 4.1. Kết quả các phản ứng sinh hoá định danh Vibrio harveyi ....................... 36
Bảng 4.2. Kết quả tác dụng của các hợp chất ở các khoảng thời gian ...................... 37
Bảng 4.3. So sánh hiệu quả của hợp chất M qua các khoảng thời ............................ 38
gian ở từng nồng độ thử nghiệm
Bảng 4.4. So sánh hiệu quả giữa các nồng độ sau các khoảng thời .......................... 39
gian đối với V. harveyi
Bảng 4.5. Kết quả kiểm tra các tính chất hóa lý của nước nuôi tôm ........................ 40
Bảng 4.6. Tỷ lệ tôm chết (%) ở các lô thử nghiệm ................................................... 41
Bảng 4.7. Kết quả kiểm tra mẫu nước và mẫu tôm của các bể thí ........................... 42
nghiệm
DANH SÁCH CÁC HÌNH
TRANG
Hình 2.1. Khuẩn lạc V. harveyi phát sáng trong tối .................................................. 11
Hình 2.2. Lá và hạt cây Neem ................................................................................... 18
Hình 2.3. Cây sả ........................................................................................................ 19
Hình 2.4. Cành và quả ổi ........................................................................................... 20
Hình 4.1. Kết quả kháng sinh đồ của hợp chất M ..................................................... 40
1
Phần 1. MỞ ĐẦU
vẫn đang còn trong giai đoạn nghiên cứu trong phòng thí nghiệm. Để có thể đưa vào
ứng dụng trong sản xuất cần phải tiến hành nhiều thí nghiệm kiểm tra hiệu quả của
chúng trong việc điều trị bệnh trên tôm. Hiện tại Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản
II, các cán bộ nghiên cứu đã tìm ra một số hợp chất chiết xuất từ thảo dược có nhiều
tiềm năng trong việc điều trị bệnh phát sáng trên tôm. Bước tiếp theo trong nghiên cứu
là đánh giá hiệu quả tác dụng của hợp chất đó trong việc điều trị trước khi đưa ra ứng
dụng thực tế trong sản xuất. Đây cũng chính là nội dung thực hiện đề tài khóa luận,
“ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ TÁC DỤNG CỦA MỘT VÀI HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN
CHIẾT SUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH PHÁT SÁNG DO Vibrio
harveyi TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon).”
1.2. Mục tiêu đề tài
Đánh giá hiệu quả tác dụng của hợp chất chiết xuất từ thảo dược trong việc điều
trị bệnh nhiễm khuẩn do Vibrio harveyi gây ra trên tôm sú (Penaeus monodon).
1.3. Nội dung
- Phân lập dòng V. harveyi thuần trên mẫu tôm có dấu hiệu nhiễm
khuẩn.
- Thử nghiệm tác dụng của các hợp chất chiết suất từ thảo dược đối
với vi khuẩn V. harveyi bằng phương pháp kháng sinh đồ.
- Bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu quả tác dụng của hợp chất thử
nghiệm đối với V. harveyi gây bệnh trên tôm.
3
Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tình hình nuôi tôm
2.1.1. Tình hình nuôi tôm trên thế giới
Lịch sử nuôi cá và các loại thủy sản đã có từ rất lâu. Những tài liệu sớm nhất ghi
chép về hoạt động nuôi trồng thủy sản ở Trung Quốc vào thế kỷ XII trước Công
nguyên. Vào thế kỷ XV, cá Măng và các loài thủy sản khác bao gồm cả tôm biển được
nuôi phổ biến trong những đầm nước lợ diện tích lớn tại Indonesia (Nguyễn Văn Hảo,
2000). Nhưng nhìn chung nghề nuôi tôm chỉ mới bắt đầu phát triển nhanh từ những năm
đầu thập kỷ 80 của thế kỷ XX và có thể chia nghề nuôi tôm trên thế giới thành 3 giai
Mặc dù bắt đầu muộn nhưng có thể nói nghề nuôi tôm đã phát triển khá nhanh và
dần dần đã trở thành một ngành kinh tế quan trọng ở vùng ven biển của nhiều quốc gia.
Nhìn chung, ở các quốc gia có nghề nuôi tôm phát triển, diện tích nuôi tôm ngày càng
được mở rộng. Một ví dụ điển hình là tại Trung Quốc, năm 1991, tổng diện tích nuôi là
140.000 ha, năm 1997 diện tích nuôi tăng lên 160.000 ha (Nguyễn Văn Hảo, 2000) và
đến năm 2001 diện tích nuôi của Trung Quốc là 230.000 ha (Shenzhen, 2002).
Theo số liệu của FAO, năm 2003 tổng sản lượng tôm nuôi của châu Á đạt 1,35
triệu tấn, chiếm khoảng 86% sản lượng toàn cầu, trong đó dẫn đầu là Trung Quốc với
sản lượng đạt 390.000 tấn. Điều này cho thấy châu Á là khu vực có nghề nuôi tôm phát
triển khá mạnh (Huỳnh Hữu Đức, 2004).
Nhìn chung sản lượng tôm nuôi trên toàn thế giới không tăng đáng kể trong
khoảng 10 năm qua từ 686.000 tấn vào năm 1993 lên 804.000 tấn vào năm 2000. Các số
liệu thống kê của FAO cho thấy có sự tăng giảm không theo qui luật về sản lượng tôm
nuôi trên toàn thế giới. Năm 1993 sản lượng giảm đến 24 % nhưng năm 1994 tăng đến
17%. Tuy nhiên, sản lượng tôm nuôi ở một số quốc gia lại tăng đáng kể. Việt Nam là một
5
ví dụ điển hình về sự gia tăng sản lượng nuôi, từ năm 2001 đến 2003 thì tăng xấp xỉ 2 lần
trong khi diện tích nuôi chỉ tăng 1,5 lần. Những quốc gia đứng đầu về sản lượng tôm nuôi
là Thái Lan, Việt Nam, Ấn Độ, Ecuador, Indonesia và Trung Quốc. Những quốc gia này
chắc chắn sẽ giữ vị trí đầu trong nhiều năm tới bởi lẽ họ vẫn giữ tốc độ phát triển về nuôi
tôm. Tuy nhiên, cũng cần thấy rằng sản lượng tôm nuôi có thể bị biến động lớn vào bất kỳ
thời điểm nào mà yếu tố dịch bệnh chi phối lớn nhất (Nguyễn Thanh Phương, 2004).
Cho tới nay các loại giống tôm được đưa vào sản xuất ngày càng trở nên phong
phú. Nhưng nhìn chung các nhà nuôi tôm tập trung chủ yếu vào các giống tôm sú và
tôm thẻ chân trắng vì thị trường tiêu thụ các loại tôm này khá lớn. Tôm sú (P. monodon)
chiếm hơn 50 % tổng sản lượng. Ở một số quốc gia như Thái Lan thì sản lượng tôm sú
không tăng nhưng tôm thẻ chân trắng (P. vannamei) đang được đưa vào nuôi và sẽ đạt
sản lượng lớn trong những năm tới đây. Những đối tượng tôm khác cũng có sản lượng
đáng kể là tôm thẻ Trung Quốc (P. chinensis) và tôm thẻ Nhật Bản (P. japonicus)
(Nguyễn Thanh Phương, 2004).
C); cùng với sự biến động nhiệt độ lớn giữa
các mùa đã hạn chế sự phát triển nuôi tôm sú ở các tỉnh phía Bắc. Năm 2003, tổng diện
tích nuôi tôm của toàn khu vực là 41.372 ha (Bộ Thuỷ sản, 2004). Tại Hải Phòng, tôm sú
đã được nuôi thử nghiệm đầu tiên vào năm 1989 nhưng hiệu quả đạt rất thấp. Năm 1991 –
1993 các mô hình thử nghiệm đã đạt hiệu quả nhất định và từ năm 1995 đến nay phong
trào nuôi tôm sú ở Hải Phòng được nhân lên rộng rãi và mở ra triển vọng trở thành nghề
nuôi chính. Quãng Ninh là một vùng đất có tiềm năng lớn để phát triển nghề nuôi tôm,
với 22.300 ha diện tích mặt nước. Năm 2003, toàn tỉnh có 14.820 ha diện tích nước mặt
đã được sử dụng nuôi thuỷ sản nước lợ, trong đó nuôi tôm chiếm 10.440 ha. Sản lượng
tôm nuôi năm 2003 của toàn tỉnh đạt 17.260 tấn (Đào Văn Trí, 2004).
Khu vực miền Trung
Bờ biển miền Trung có mực nước ven bờ sâu, nền đáy cát và có ít sông lớn so
với miền Bắc và miền Nam, do đó nước biển trong và ít bị ô nhiễm hơn bởi các chất thải
công nghiệp, nông nghiệp và các loại khác. Tuy nhiên, hiện tượng bão lũ xảy ra vào
những tháng cuối năm (tháng 9 – tháng 12) là hạn chế lớn cho nuôi trồng thủy sản tại
vùng này.
Năm 1988 – 1990, phong trào nuôi tôm mới bước vào thời kỳ chuyển từ nuôi
quãng canh cải tiến đến nuôi bán công nghiệp. Miền trung là khu vực đi đầu trong lĩnh
7
vực phát triển công nghệ nuôi tôm ở nước ta. Năm 1995 năng suất tôm nuôi trung bình
mới đạt 415 - 1.144 kg/ha/năm. Năm 1996, một số mô hình nuôi công nghiệp ở Ninh
Hòa, Nha Trang và Cam Ranh đã được triển khai và đạt được năng suất trên 5 tấn/ha/vụ.
Năm 1997, mô hình nuôi công nghiệp của Thái Lan cũng đã được thử nghiệm thành công
tại Ninh Thuận, Bình Thuận và đang có xu hướng nhân rộng ở khu vực miền Trung. Nuôi
tôm sú bán công nghiệp đã được hầu hết các hộ nuôi tôm áp dụng góp phần tăng nhanh
năng suất bình quân của khu vực.
Khu vực phía Nam
Đây là khu vực có vị trí địa lý, điều kiện thời tiết khí hậu và thổ nhưỡng thuận lợi
cho phát triển nông nghiệp nói chung và cho nuôi trồng, khai thác thủy sản nói riêng.
Thực tế khu vực phía Nam đã đóng góp hơn 80% vào sản phẩm thủy sản chung của toàn
của Việt Nam tại châu Âu, chiếm khoảng 40% tổng kim ngạch xuất khẩu sang thị
trường châu Âu. Việc mở rộng thị trường tại châu Âu về phía Đông không chỉ đơn
thuần gia tăng kim ngạch xuất khẩu của Việt Nam mà còn tạo ra thị trường mới cho các
mặt hàng thuỷ sản giá thấp. Thị trường này cũng được đánh giá là nơi tiêu thụ cá nước
ngọt tiềm năng. Tuy nhiên, hạn chế của thị trường mới là mức giá nhập khẩu thấp (Hà
Yên, 2004).
Bên cạnh khó khăn về thị trường tiêu thụ, đối với một quốc gia đang phát triển
nghề nuôi tôm như Việt Nam thì các đòi hỏi của thị trường về sản phẩm chất lượng cao,
phát triển bền vững, quản lý dịch bệnh, môi trường, giống chất lượng cao… sẽ là những
khó khăn gặp phải trong quá trình phát triển. Trong đó đáng lo là vấn đề dịch bệnh lay
lan đã kiềm hãm sự phát triển của nghề nuôi ở một số nơi trong nước.
Vấn đề kỹ thuật thuật nuôi trong đó quản lý dịch bệnh, quản lý môi trường theo
hướng sinh học, giống sạch bệnh hay giống kháng bệnh… là những hướng mà nghề
nuôi tôm nước ta sẽ phải thực hiện trong tương lai.
Việc giải quyết hiệu quả các vấn đề này đòi hỏi cần phải có thời gian cùng với
những biện pháp chiến lược đúng đắn của nhà nước. Trong xu thế phát triển nghề nuôi
tôm bền vững trong tương lai thì vấn đề chất lượng tôm sạch sẽ đặt lên hàng đầu. Việc
9
đầu tư nghiên cứu và áp dụng các kỹ thuật tiến bộ đặc biệt là các thành tựu trong lĩnh
vực công nghệ sinh học nên cần được tiến hành một cách hợp lý để góp phần ổn định sự
phát triển của nghề nuôi tôm nhằm nâng cao chất lượng và sản lượng của tôm nuôi ở
nước ta.
2.1.3. Tình hình và thiệt hại của bệnh do Vibrio gây ra ở tôm trên thế giới
và tại Việt Nam
Nghề nuôi tôm ngày nay đã trở thành một ngành kinh tế quan trọng đem lại thu
nhập khá cao cho nông dân. Có thể nói diện tích nuôi tôm hàng năm càng gia tăng, tuy
nhiên khi diện tích nuôi càng mở rộng thì rủi ro trong nghành nuôi tôm càng gia tăng,
điển hình là sự gia tăng của các mầm bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng đến sản xuất.
Các số liệu thống kê cho thấy sản lượng tôm nuôi trên thế giới giảm dần từ
733.000 tấn năm 1994 còn 712.000 tấn năm 1995, rồi 693.000 tấn năm 1996 và đến năm
2.2. Bệnh phát sáng do Vibrio harveyi gây ra trên tôm
2.2.1. Đặc điểm của Vibrio harveyi
Nhóm Vibrio phát sáng là 1 phần của hệ vi sinh vật tự nhiên khu trú ở vùng biển
ven bờ, được tìm thấy trên bề mặt và cả bên trong ruột của các động vật sống ở biển. V.
harveyi và V. splendidus là 2 loài vi khuẩn phân lập được từ các mẫu tôm ấu trùng và hậu
ấu trùng bị bệnh phát sáng. Tuy nhiên V. harveyi mới được xem là loài vi khuẩn chủ yếu
gây bệnh phát sáng trên tôm (Lý Thị Thanh Loan, 1999).
V. harveyi thuộc giống Vibrio, họ Vibrionaceae. Đặc điểm chung của V.
harveyi là: vi khuẩn gram âm, hình que thẳng hoặc hơi uốn cong, kích thước 0,3
– 0,5 x 1,4 – 2,6 µm, gây ra hiện tượng phát sáng sinh học trên tôm trong môi
trường biển. V. harveyi không có mối quan hệ cộng sinh với bất kỳ sinh vật biển
nào, nó di chuyển bằng roi (Sung và ctv, 2001).
Quan sát trong bóng tối các đĩa cấy V. harveyi trên môi trường BHIA thấy khuẩn
lạc phát ra các ánh sáng xanh nhạt.
11
Hình 2.1. Khuẩn lạc V. harveyi phát sáng trong tối (Zhang, 2001)
V. harveyi có khả năng kháng chịu rất nhiều loại kháng sinh thông thường như
erythromycin, penicillin, streptomycin và sulfadiazine (Nguyễn Phương Lan, 1992).
V. harveyi có khả năng tổng hợp enzyme catalase nên không bị tiêu diệt bởi H
2
O
2
(Vattanaviboon và Mongkolsuk, 2001). Các đặc điểm sinh hóa học của V. harveyi được
trình bày trong bảng sau:
Bảng 2.1. Đặc điểm sinh hóa học của V. harveyi (John và ctv, 1994)
Đặc điểm V. harveyi
Nhuộm gram -
12
Di động +
Thử Oxydase +
rằng protease, phospholipase hoặc hemolysin có thể giữ vai trò quan trọng trong việc
gây bệnh, trong đó protease cystein giữ vai trò là ngoại độc tố chính đối với tôm.
Montero và Austin (1999 ) cho rằng lipopolysaccharide có thể hình thành nên độc tố gây
chết của V. harveyi dòng E2 đối với tôm.
Nhìn chung hemolysin của vi khuẩn đã được coi là yếu tố quan trọng của các
Vibrio gây bệnh bằng cách gây nhiễm trùng máu và tiêu chảy ở vật chủ (Zhang, 2001).
2.2.2. Dấu hiệu bệnh
Cần phân biệt rõ sự phát triển bệnh trên tôm. Nếu trong bể tôm có các đốm sáng
lớn trên những con tôm chết, đó là do các tập đoàn Coccobacilli tấn công vào các con
gây chết phát sáng, hiện tượng lâm sàng này không quan trọng. Khi nước biển xử lý
không tốt sẽ thường gặp hiện tượng này. Nếu phát sáng trên các con sống, đốm sáng rất
13
nhỏ bên trong cơ thể của tôm thì đó là bệnh do V. harveyi và V. splendidus gây nên
(Phạm Văn Tình, 2000).
Dầu hiệu bên ngoài
Dấu hiệu để nhận biết tôm bị bệnh phát sáng là: tôm yếu lờ đờ, kém bắt mồi hoặc
bỏ ăn, có màu sậm hoặc trắng đục. Màu sắc cơ thể đôi khi chuyển sang màu hồng.
Tôm bơi nổi, tấp mé, phát sáng phần đầu ngực hay toàn thân (quan sát đuợc trong bóng
tối), có thể nhiễm 100% đàn tôm. Tôm bệnh có thể bị đóng rong ở mang và vỏ, gan tôm
bị teo lại, sẫm màu, tôm chậm lớn. Tôm có thể bị chết rải rác (10 – 20%) và có thể tăng
lên nếu trong giai đoạn 45 ngày nuôi đầu tiên (Đỗ Thị Hòa và ctv, 2001).
Khi tôm nhiễm khuẩn toàn thân, thì tỷ lệ chết có thể lên đến 100% (Lý Thị
Thanh Loan, 1999). Ấu trùng có thể chết từ rải rác tới hàng loạt đặc biệt ở giai đoạn tiền
ấu trùng (Zoae, Mysis) (Đỗ Thị Hòa và ctv, 2001).
Dấu hiệu mô học
Tôm bị bệnh nặng, soi dưới kính hiển vi mẫu xoang bạch huyết và mẫu ruột thấy
dày đặc những vi khuẩn di động, cơ quan chủ yếu nhiễm khuẩn là gan tụy (Lý Thị
Thanh Loan, 1999).
Tôm giống dưới 45 ngày nuôi bị nhiễm bệnh phát sáng có biểu hiện tế bào ống
bên trong gan tụy bị phá hủy. Chỗ lõm giữa các tế bào hình ống bị bịt kín bởi các bạch
các khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường BHIA, sau đó định danh vi khuẩn bằng các phản
ứng sinh hóa theo khóa phân loại Bergey (Jonh và ctv, 1994).
Phương pháp này có ưu điểm là đơn giản, dễ thực hiện và ít tốn kém. Tuy nhiên
nó có nhược điểm là mất nhiều thời gian để thực hiện.
2.3.2. Phương pháp mô học
Copyright: Tài liệu đại học ©