1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***************
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ TÁC DỤNG CỦA MỘT VÀI HỢP
CHẤT TỰ NHIÊN CHIẾT XUẤT TỪ THẢO MỘC TRONG
ĐIỀU TRỊ BỆNH PHÁT SÁNG DO Vibrio harveyi
TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon)
Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2001 – 2005
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ĐÌNH NGHI

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:
TS. LÝ THỊ THANH LOAN NGUYỄN ĐÌNH NGHI

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2005 iii
LỜI CẢM TẠ

Đầu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô trong trường Đại học Nông
Lâm đã trang bị cho tôi những kiến thức quý giá trong suốt bốn năm đại học giúp tôi

một mầm bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng ở tôm. Chúng thường gây ra tỷ lệ chết cao
đặc biệt là ở giai đoạn ấu trùng của tôm, có thể lên đến 100%. Trong nghiên cứu này,
chúng tôi sử dụng phương pháp làm kháng sinh đồ để sàng lọc, tìm ra một hợp chất
thảo dược có hiệu quả chống lại V. harveyi trong phòng thí nghiệm, kết hợp với việc
bố trí thí nghiệm để kiểm tra tính hiệu quả thực tế của các loại hợp chất thảo dược này
ngay trên tôm nuôi.
Những kết quả đạt được:
- Sàng lọc và chọn ra được một hợp chất có hiệu quả chống lại V. harveyi tốt
nhất trong bốn hợp chất thảo dược thử nghiệm (B
2
, L, L
2
và M) là M.
- Hợp chất M cho hiệu quả tốt kháng được V. harveyi và giúp giảm tỷ lệ chết
ở tôm khi cho tôm bệnh ăn thức ăn có trộn với hợp chất M ở nồng độ 500 và
750 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày. Quan sát kết quả bước đầu cho thấy
hợp chất này không ảnh hưởng xấu tới sự phát triển của tôm. v
ABSTRACT

NGUYEN DINH NGHI, Nong Lam University, Ho Chi Minh City, July/2005.
“EVALUATE THE EFFECT OF NATURAL SUBSTANCES EXTRACTED FROM
HERBS IN CURING VIBRIOSIS (Vibrio harveyi) ON BLACK TIGER SHRIMP
(Penaeus monodon).
Guiding council:

TÓM TẮT iv
ABSTRACT v
MỤC LỤC vi, vii, viii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ix
DANH SÁCH CÁC BẢNG x
DANH SÁCH CÁC HÌNH xi
Phần 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu đề tài 2
1.3. Nội dung 2
Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tình hình nuôi tôm 3
2.1.1. Tình hình nuôi tôm trên thế giới 3
2.1.2. Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam 6
2.1.3. Tình hình và thiệt hại của bệnh do Vibrio gây ra 9
ở tôm trên thế giới và tại Việt Nam
2.2. Bệnh phát sáng do Vibrio harveyi gây ra trên tôm 10
2.2.1. Đặc điểm của Vibrio harveyi 10
2.2.2. Dấu hiệu bệnh 13
2.2.3. Điều kiện phát sinh bệnh 14
2.2.4. Khu vực phân bố bệnh 14
2.3. Các phương pháp chẩn đoán bệnh phát sáng trên tôm 15
2.3.1. Phương pháp vi khuẩn học 15
2.3.2. Phương pháp mô học 15
2.3.3. Phương pháp miễn dịch học 15
2.3.4. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) .…… 15 vii
2.4. Một số loài thảo dược có tiềm năng trong việc điều trị 16

lý của nước nuôi

viii
3.3.2.5. Tiến hành thu mẫu và kiểm tra vi khuẩn 33
3.3.3. Phương pháp phân tích số liệu thống kê 34
Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả thử nghiệm trong phòng thí nghiệm 36
4.1.1 Kết quả phân lập dòng thuần Vibrio harveyi 36
4.1.2. Kết quả thí nghiệm kháng sinh đồ 37
4.1.3. Kết quả thử nghiệm hợp chất M 37
4.2. Kết quả thử nghiệm trong phòng Wet-lab 40
4.2.1. Kết quả kiểm tra tính chất hoá lý của nước nuôi 40
4.2.2. Kết quả bố trí thí nghiệm 40
Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận 43
5.2. Đề nghị 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO 45
PHỤ LỤC 50
ix
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT


Bảng 3.1. Thành phần dung dịch của các ống nghiệm trong thí 29
nghiệm Mc Farland
Bảng 4.1. Kết quả các phản ứng sinh hoá định danh Vibrio harveyi 36
Bảng 4.2. Kết quả tác dụng của các hợp chất ở các khoảng thời gian 37
Bảng 4.3. So sánh hiệu quả của hợp chất M qua các khoảng thời 38
gian ở từng nồng độ thử nghiệm
Bảng 4.4. So sánh hiệu quả giữa các nồng độ sau các khoảng thời 39
gian đối với V. harveyi
Bảng 4.5. Kết quả kiểm tra các tính chất hóa lý của nước nuôi tôm 40
Bảng 4.6. Tỷ lệ tôm chết (%) ở các lô thử nghiệm 41
Bảng 4.7. Kết quả kiểm tra mẫu nước và mẫu tôm của các bể thí 42
nghiệm
xi
DANH SÁCH CÁC HÌNH
TRANG
Hình 2.1. Khuẩn lạc V. harveyi phát sáng trong tối 11
Hình 2.2. Lá và hạt cây Neem 18
Hình 2.3. Cây sả 19
Hình 2.4. Cành và quả ổi 20
Hình 4.1. Kết quả kháng sinh đồ của hợp chất M 40
1

của bệnh phát sáng, người nuôi vẫn sử dụng các biện pháp phòng ngừa là chủ yếu.
Nhiều nghiên cứu để tìm ra các biện pháp mới ngăn chặn bệnh phát sáng đã
được tiến hành, trong đó người ta đã tìm ra được nhiều chất có nguồn gốc sinh học hứa
hẹn nhiều tiềm năng trong việc điều trị bệnh phát sáng trên tôm. Tuy nhiên các hợp
chất này vẫn đang còn trong giai đoạn nghiên cứu trong phòng thí nghiệm. Để có thể
đưa vào ứng dụng trong sản xuất cần phải tiến hành nhiều thí nghiệm kiểm tra hiệu
quả của chúng trong việc điều trị bệnh trên tôm. Hiện tại Viện Nghiên cứu Nuôi trồng
Thuỷ sản II, các cán bộ nghiên cứu đã tìm ra một số hợp chất chiết xuất từ thảo dược
có nhiều tiềm năng trong việc điều trị bệnh phát sáng trên tôm. Bước tiếp theo trong
nghiên cứu là đánh giá hiệu quả tác dụng của hợp chất đó trong việc điều trị trước khi
đưa ra ứng dụng thực tế trong sản xuất. Đây cũng chính là nội dung thực hiện đề tài
khóa luận, “ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ TÁC DỤNG CỦA MỘT VÀI HỢP CHẤT
THIÊN NHIÊN CHIẾT SUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH PHÁT
SÁNG DO Vibrio harveyi TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon).”
1.2. Mục tiêu đề tài
Đánh giá hiệu quả tác dụng của hợp chất chiết xuất từ thảo dược trong việc điều
trị bệnh nhiễm khuẩn do Vibrio harveyi gây ra trên tôm sú (Penaeus monodon).
1.3. Nội dung
- Phân lập dòng V. harveyi thuần trên mẫu tôm có dấu hiệu nhiễm khuẩn.
- Thử nghiệm tác dụng của các hợp chất chiết suất từ thảo dược đối với vi
khuẩn V. harveyi bằng phương pháp kháng sinh đồ.
- Bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu quả tác dụng của hợp chất thử nghiệm đối
với V. harveyi gây bệnh trên tôm.
3

Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU


trở thành nguồn cung cấp tôm chủ yếu cho thị trường xuất khẩu (Nguyễn Văn Hảo,
2000).
Trên thế giới có hai khu vực nuôi tôm lớn: Tây bán cầu gồm các nước châu Mỹ
La Tinh và ở Đông bán cầu gồm các nước Nam và Đông Nam Á. Năm 1997 khu vực
Tây bán cầu, Ecuador đạt 130.000 tấn (diện tích nuôi là 180.000 ha), chiếm 66% tổng
lượng tôm nuôi của khu vực. Cũng trong năm này, sản lượng tôm nuôi của khu vực
Đông bán cầu đạt 462.000 tấn chiếm 70% tôm nuôi trên thế giới. Thái Lan là nước
đứng đầu với sản lượng 150.000 tấn (diện tích nuôi 70.000 ha) chiếm 32,5% sản lượng
của khu vực, kế đến là Indonesia, Trung Quốc, Ấn Độ, Bangladesh và Việt Nam
(Nguyễn Văn Hảo, 2000).
Mặc dù bắt đầu muộn nhưng có thể nói nghề nuôi tôm đã phát triển khá nhanh
và dần dần đã trở thành một ngành kinh tế quan trọng ở vùng ven biển của nhiều quốc
gia. Nhìn chung, ở các quốc gia có nghề nuôi tôm phát triển, diện tích nuôi tôm ngày
càng được mở rộng. Một ví dụ điển hình là tại Trung Quốc, năm 1991, tổng diện tích
nuôi là 140.000 ha, năm 1997 diện tích nuôi tăng lên 160.000 ha (Nguyễn Văn Hảo,
2000) và đến năm 2001 diện tích nuôi của Trung Quốc là 230.000 ha (Shenzhen,
2002).
Theo số liệu của FAO, năm 2003 tổng sản lượng tôm nuôi của châu Á đạt 1,35
triệu tấn, chiếm khoảng 86% sản lượng toàn cầu, trong đó dẫn đầu là Trung Quốc với
sản lượng đạt 390.000 tấn. Điều này cho thấy châu Á là khu vực có nghề nuôi tôm
phát triển khá mạnh (Huỳnh Hữu Đức, 2004).
Nhìn chung sản lượng tôm nuôi trên toàn thế giới không tăng đáng kể trong
khoảng 10 năm qua từ 686.000 tấn vào năm 1993 lên 804.000 tấn vào năm 2000. Các số
liệu thống kê của FAO cho thấy có sự tăng giảm không theo qui luật về sản lượng tôm
nuôi trên toàn thế giới. Năm 1993 sản lượng giảm đến 24 % nhưng năm 1994 tăng đến
17%. Tuy nhiên, sản lượng tôm nuôi ở một số quốc gia lại tăng đáng kể. Việt Nam là
5

một ví dụ điển hình về sự gia tăng sản lượng nuôi, từ năm 2001 đến 2003 thì tăng xấp xỉ
2 lần trong khi diện tích nuôi chỉ tăng 1,5 lần. Những quốc gia đứng đầu về sản lượng

Bờ biển Việt Nam trải dài 3.260 km từ Quãng Ninh ở phía Bắc đến Kiên Giang ở
phía Nam, đây là tiềm năng to lớn cho nuôi trồng thủy sản nước mặn và nước lợ. Nghề
nuôi tôm ở nước ta đã có từ lâu đời nhưng trước đây chủ yếu nuôi theo hình thức dân gian
quãng canh nên năng suất đạt được không cao. Về sau nhờ áp dụng những kỹ thuật tiến
bộ, đặc biệt là những kỹ thuật về sản xuất giống, đã tạo ra cho nghề nuôi tôm ở nước ta có
những bước tiến mạnh mẽ (Nguyễn Văn Hảo, 2000).
Dựa vào điều kiện sinh thái và khí hậu có thể chia các tỉnh có thể nuôi tôm sú ở
nước ta thành 3 khu vực chính (Nguyễn Văn Hảo, 2000):
 Khu vực phía Bắc
Khu vực này có mùa đông lạnh kéo dài, nhiệt độ nước thấp (thấp hơn 20
0
C) nằm
ngoài khoảng thích nghi của tôm sú (22 – 35
0
C); cùng với sự biến động nhiệt độ lớn
giữa các mùa đã hạn chế sự phát triển nuôi tôm sú ở các tỉnh phía Bắc. Năm 2003, tổng
diện tích nuôi tôm của toàn khu vực là 41.372 ha (Bộ Thuỷ sản, 2004). Tại Hải Phòng,
tôm sú đã được nuôi thử nghiệm đầu tiên vào năm 1989 nhưng hiệu quả đạt rất thấp.
Năm 1991 – 1993 các mô hình thử nghiệm đã đạt hiệu quả nhất định và từ năm 1995
đến nay phong trào nuôi tôm sú ở Hải Phòng được nhân lên rộng rãi và mở ra triển vọng
trở thành nghề nuôi chính. Quãng Ninh là một vùng đất có tiềm năng lớn để phát triển
nghề nuôi tôm, với 22.300 ha diện tích mặt nước. Năm 2003, toàn tỉnh có 14.820 ha
diện tích nước mặt đã được sử dụng nuôi thuỷ sản nước lợ, trong đó nuôi tôm chiếm
10.440 ha. Sản lượng tôm nuôi năm 2003 của toàn tỉnh đạt 17.260 tấn (Đào Văn Trí,
2004).
 Khu vực miền Trung
Bờ biển miền Trung có mực nước ven bờ sâu, nền đáy cát và có ít sông lớn so
với miền Bắc và miền Nam, do đó nước biển trong và ít bị ô nhiễm hơn bởi các chất
thải công nghiệp, nông nghiệp và các loại khác. Tuy nhiên, hiện tượng bão lũ xảy ra
vào những tháng cuối năm (tháng 9 – tháng 12) là hạn chế lớn cho nuôi trồng thủy sản

nước đã đạt 546.757 ha (Đào Văn Trí, 2004). Theo đó sản lượng hàng năm cũng có sự
8

gia tăng đáng kể, năm 2003 tổng sản lượng tôm nuôi Việt Nam đạt 224.000 tấn tăng
11% so với năm 2002 (Huỳnh Hữu Đức, 2004).
Hiện nay, về sản lượng các mặt hàng xuất khẩu, tôm chiếm khoảng 1/4, nhưng
về giá trị lại chiếm tới 50% (Thái Thị Thanh Dương, 2004). Rõ ràng trong kim ngạch
xuất khẩu của ngành thuỷ sản, tôm vẫn đang giữ một vị trí rất quan trọng. Và vì thế
nghề nuôi tôm vẫn là một nghề khá hấp dẫn mang lại giá trị kinh tế khá cao.
Năm 2004, xuất khẩu thuỷ sản Việt Nam đã gặp rất nhiều khó khăn, từ vụ kiện
chống bán phá giá tôm tại Mỹ đã tác động mạnh tới kim ngạch xuất khẩu chung của
toàn ngành cũng như đe dọa tới sự phát triển của nghề nuôi tôm ở nước ta vì thị trường
Mỹ chiếm tới 65% giá trị tôm xuất khẩu của Việt Nam. Bên cạnh đó, mặc dù Nhật Bản
có nhu cầu nhập khẩu thuỷ sản, nhưng giá tôm sú xuất sang thị trường này đang giảm
mạnh (Hà Yên, 2004).
Do vậy, các doanh nghiệp xuất khẩu thuỷ sản Việt Nam đã chuyển hướng sang
thị trường châu Âu, Trung Quốc. Hiện Anh và Bỉ là hai thị trường nhập khẩu tôm
chính của Việt Nam tại châu Âu, chiếm khoảng 40% tổng kim ngạch xuất khẩu sang
thị trường châu Âu. Việc mở rộng thị trường tại châu Âu về phía Đông không chỉ đơn
thuần gia tăng kim ngạch xuất khẩu của Việt Nam mà còn tạo ra thị trường mới cho
các mặt hàng thuỷ sản giá thấp. Thị trường này cũng được đánh giá là nơi tiêu thụ cá
nước ngọt tiềm năng. Tuy nhiên, hạn chế của thị trường mới là mức giá nhập khẩu
thấp (Hà Yên, 2004).
Bên cạnh khó khăn về thị trường tiêu thụ, đối với một quốc gia đang phát triển
nghề nuôi tôm như Việt Nam thì các đòi hỏi của thị trường về sản phẩm chất lượng
cao, phát triển bền vững, quản lý dịch bệnh, môi trường, giống chất lượng cao… sẽ là
những khó khăn gặp phải trong quá trình phát triển. Trong đó đáng lo là vấn đề dịch
bệnh lay lan đã kiềm hãm sự phát triển của nghề nuôi ở một số nơi trong nước.
Vấn đề kỹ thuật thuật nuôi trong đó quản lý dịch bệnh, quản lý môi trường theo
hướng sinh học, giống sạch bệnh hay giống kháng bệnh… là những hướng mà nghề

triển các phương thức chẩn đoán và phòng ngừa hữu hiệu đối với dịch bệnh. Hiện nay
bệnh truyền nhiễm do nhóm vi khuẩn phát sáng và nhóm virus MBV, YHV và WSSV
10

được xem là tác nhân gây bệnh đáng được quan tâm nhất làm ảnh hưởng đến sản
lượng tôm nuôi hàng năm (Nguyễn Văn Hảo, 2000).
Trước đây, nhóm Vibrio được xem là nhóm vi khuẩn cơ hội. Tuy nhiên gần đây
qua nhiều ổ dịch xảy ra trên tôm sú nuôi do vi khuẩn Vibrio gây ra cho thấy loài này
dường như được xem là vi khuẩn gây bệnh tiên phát thật sự chứ không phải là vi
khuẩn cơ hội. Vibrio gây chết ấu trùng tôm, tôm giống, tôm thương phẩm và kể cả tôm
trưởng thành. Dịch bệnh có thể gây chết 100% (Lightner và ctv, 1988).
Trong năm 2003, thiệt hại do V. harveyi gây ra cho nghề nuôi tôm của toàn thế
giới là 800 triệu USD, trong đó chỉ tính riêng ở Thái Lan, thiệt hại đã là 160 triệu USD
(Fraser, 2005).
Trong 30 chủng nghi ngờ thu được từ ấu trùng bị bệnh phát sáng tại Khánh
Hòa, người ta nhận thấy V. harveyi chiếm ưu thế với tần số bắt gặp là 14/30 (46,67%),
sau đó đến V. parahaemolyticus 6/30, chiếm 20%. Ngoài ra còn gặp V. vulnificus 3/30
(10%), đây cũng chính là những loài vi khuẩn đã được nhiều tài liệu thông báo là tác
nhân gây bệnh phát sáng ở tôm sú ấu trùng (Nguyễn Văn Hảo và ctv, 2002).
2.2. Bệnh phát sáng do Vibrio harveyi gây ra trên tôm
2.2.1. Đặc điểm của Vibrio harveyi
Nhóm Vibrio phát sáng là 1 phần của hệ vi sinh vật tự nhiên khu trú ở vùng biển
ven bờ, được tìm thấy trên bề mặt và cả bên trong ruột của các động vật sống ở biển. V.
harveyi và V. splendidus là 2 loài vi khuẩn phân lập được từ các mẫu tôm ấu trùng và
hậu ấu trùng bị bệnh phát sáng. Tuy nhiên V. harveyi mới được xem là loài vi khuẩn chủ
yếu gây bệnh phát sáng trên tôm (Lý Thị Thanh Loan, 1999).
V. harveyi thuộc giống Vibrio, họ Vibrionaceae. Đặc điểm chung của V.
harveyi là: vi khuẩn gram âm, hình que thẳng hoặc hơi uốn cong, kích thước
0,3 – 0,5 x 1,4 – 2,6 µm, gây ra hiện tượng phát sáng sinh học trên tôm trong
môi trường biển. V. harveyi không có mối quan hệ cộng sinh với bất kỳ sinh

Thử Oxydase +
Phát sáng +
Phát triển ở 4
0
C -
Phát triển ở 30
0
C +
Phát triển ở môi trường 0%NaCl -
Phát triển ở môi trường 3%NaCl +
Phát triển ở môi trường 7%NaCl +
Phát triển trên TCBS xanh
Thử O/F Glucose +/+
Thủy phân Arginine -
Thủy phân Lysine +
Thủy phân Orinithine -
Sử dụng Citrate -
Urease -
Khử Nitrate +
Indol +
Sinh H
2
S -
Methyl red +
Vosges – Proskauer -
Dịch hóa Gelatin +
Acid hóa Glucose +
Acid hóa Inositol -
Acid hóa Mannitol +
Acid hóa Sucrose -