50

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
************

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP NHẬN DIỆN VÀ PHÂN
TÍCH TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA 21 DÒNG
CACAO (THEOBROMA CACAO L.) BẰNG KỸ THUẬT
MICROSATELLITE

and analysis of genetic diversity using Microsatellites.

ABSTRACT-The objective of this thesis is to study the genetic identification
of accessions of Theobroma cacao L. from the cocoa collection of Nong Lam
University, based on microsatellite markers. Five pairs of primers were used. The
amplification products are separated on an ABI 3100 automated DNA sequencing
apparatus. The results of this work will help to identify and analyse genetically
diversity of cocoa cultivar of the cocoa collection of Nong Lam University.

OBJECTIVE
1- Establish Nong lam university cocoa microsatellite database of 21
clones.
2- Study the genetic diversity of 21 clones.
3- Perform multiplex PCR to reduce the cost.
4- Validate a methodology to compare fingerprinting of cocoa accessions.

METHOD
- Five primers mTcCIR7, mTcCIR8, mTcCIR11, mTcCIR15 and mTcCIR18
were used to find specific microsatellite sequences of 21 cocoa cultivars.
- Software Gene Mapper was used to analyse microsatellite database on
sequencer ABI 3100.
- Software Genetix was used to analyse genetic diversity of 21 cocoa
cultivars.

CONCLUSION
Five microsatellites are enough to compare the identity of all samples. We
could use those markers to establish the methodology to perform genetic
comparisons in Vietnam.
This cacao fingerprint database would be useful in evaluating labeling
consistency and mistakes in Vietnamese clonal gardens, and in validation of the

tâm Phân tích Thí nghiệm đã nhiệt tình giúp đỡ và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình
thực hiện đề tài, nhất là những lúc khó khăn.

TP Hồ Chí Minh tháng 8/2005
Nguyễn Thị Phương Dung

53

TÓM TẮT KHÓA LUẬN

 Tên đề tài: Xây dựng phương pháp nhận diện và phân tích tính đa dạng di
truyền của 21 dòng cacao (Theobroma cacao L.) bằng kỹ thuật Microsatellite.
 Thời gian nghiên cứu: từ tháng 3/2005 đến tháng 8/2005.
 Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Trường Đại Học
Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.
 Cơ sở nghiên cứu: Sử dụng marker phân tử Microsatellite trên cở sở
phương pháp PCR và phân tích trình tự tự động để xây dựng phương pháp nhận
diện hiệu quả và phân tích tính đa dạng di truyền của một số dòng cacao.
 Mục đích nghiên cứu:
- Xây dựng phương pháp nhận diện 21 dòng cacao bằng kỹ thuật
microsatellite với độ chính xác và ổn định cao.
- Tối ưu hoá phương pháp bằng kỹ thuật multiplex PCR.
- Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của 21 dòng cacao, làm cơ sở để
đánh giá, phân loại và chọn lọc các giống có định hướng.

55

Phần 1
Mở đầu

1.Đặt vấn đề
Cacao có tên khoa học là Theobroma cacao L., một loại cây nhiệt đới được
người Maya trồng cách đây hơn hai ngàn năm. Theobroma cacao L. có nguồn gốc
từ Trung Mỹ, ngày nay được trồng phổ biến ở Brazil, Ghana, Indonesia, Malaysia
và một số nước ở lưu vực sông Amazone (Juan Carlos Motamayor, 1999).
Những giống cacao có nguồn gốc từ các nước nhiệt đới trên được trồng tại
nhiều quốc gia nhưng sau một thời gian lai tạo, tên giống có thể bị nhầm lẫn là một
vấn đề thường gặp phải, điều này sẽ ảnh hưởng đến công tác lai tạo giống, tạo
những cây có năng suất thấp và kém hiệu quả kinh tế. Do đó cần phải xây dựng một
phương pháp định danh chính xác hay đánh giá đúng tính đồng nhất di truyền trong
việc lưu trữ bộ giống, từ đó sẽ cải thiện tính chính xác và tăng hiệu quả trong công
tác chọn giống.
Microsatellite là một công cụ đắc lực để giải quyết vấn đề như định danh và
phát hiện những cây bị mất lai lịch đồng thời cũng đánh giá mức độ đa dạng di
truyền của cây. Mức độ đa dạng di truyền là một chỉ tiêu quan trọng trong quá trình
chọn tạo giống vì khi các cặp cha mẹ có độ đồng nhất di truyền cao sẽ làm mất tính
ưu thế lai. Sự phối hợp các primer microsatellite được đánh dấu huỳnh quang trong
phản ứng PCR và tiến hành phân tích microsatellite bằng máy giải trình tự sẽ cung
cấp dữ liệu giúp cho việc nhận diện chính xác các giống cacao bằng đặc trưng phân
tử.
Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
“Xây dựng phương pháp nhận diện và phân tích tính đa dạng di truyền
của 21 dòng cacao (Theobroma cacao L.) bằng kỹ thuật Microsatellite”
Đề tài được thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS. Bùi Minh Trí,
TS. Phạm Hồng Đức Phước và TS. Juan Carlos Motamayor, chuyên gia về
57

Phần 2
Tổng quan tài liệu

2.1.Giới thiệu tổng quan về cây cacao
Cây cacao có tên khoa học là Theobroma cacao L. (2n = 20), thuộc họ
Sterculiacea, là cây duy nhất trong số 22 loài của thứ Theobroma được trồng sản
xuất.
Hiện nay có 3 vùng chính trên thế giới trồng cacao:
- Nam Mỹ: Brazil, Ecuador.
- Tây Phi: Bờ Biển Ngà, Ghana, Cameroon, Nigeria.
- Đông Nam Á: Indonesia, Malaysia, Việt Nam.

2.1.1.Nguồn gốc cây cacao
Cacao là một loại cây trồng bản địa của các nước nhiệt đới ẩm và được
người Maya trồng ở Châu Mỹ từ rất lâu, trước khi người Châu Âu có mặt. Từ
“cacao” từ tiếng Maya mà ra, và cho đến ngày nay, khắp nơi đều dùng từ này.
Cacao xuất hiện lần đầu tiên trong danh mục từ thực vật từ năm 1605.

được từ 4-5 tháng, sau đó đi vào giai đoạn lão suy và rụng.
Hoa: Hoa cacao xuất hiện trên sẹo lá của thân, cành. Hằng năm, hoa xuất
hiện trên cùng một chỗ ở vết sẹo lá, lâu ngày chỗ ra hoa phình to và nhô lên thành
đệm hoa. Hoa có cuống dài 1-3 cm, có 5 cánh đều đặn xen kẽ với 5 cánh đài. Hoa
nở từ 3 giờ chiều đến 9 giờ sáng hôm sau.
Quả: Những đặc tính về màu sắc, kích thước và hình dạng quả thay đổi rất
nhiều tùy thuộc vào giống.
+ Màu sắc: Quả chưa chín có thể có màu xanh, đỏ tím hoặc xanh điểm sắc đỏ
tím…Khi quả đạt độ chín, màu xanh chuyển qua vàng, màu đỏ tím thường chuyển
qua màu da cam.
+ Hình dạng, kích thước: Hình dạng quả thay đổi từ hình cầu, hình oval đến
hơi dài, nhọn hoặc hình trứng. Thường quả có chiều dài 7-30 cm, rộng 7-9 cm.
Hạt: Hạt cacao không có nhân, mập, dài 2-3 cm và có cùi nhớt màu trắng, có
vị hơi chua bao bên ngoài. Kế lớp cùi nhớt là lớp vỏ mỏng, nhiều đường gân bao
bọc lấy hạt ở bên trong. Hạt chứa tử diệp màu tím (màu trắng ngà hoặc vàng nhạt
đối với giống Criollo) và hóa nâu sau khi lên men. Kích thước hạt có thể thay đổi
tùy theo giống và mùa vụ. Mỗi quả cacao có từ 30-40 hạt. 59

2.1.3.Yêu cầu sinh thái
Khí hậu: Cacao thường được trồng ở các vùng có độ cao 800 m so với
mực nước biển, trên các vùng có lượng mưa khoảng 1500-2000 mm/năm. Cây
cacao thích nghi tốt ở nhiệt độ tối đa là 30-32
o
C và nhiệt độ tối thiểu là 18-21