19
mô. Tổn thương này khác với dạng tổn thương do ETEC và Vibrio cholerae (ETEC và
V. cholerae bám theo kiểu không chặt, không gây bào mòn vi nhung mao). Gen cần
thiết cho việc tạo tổn thương A/E là gen eae mã hóa intimin. Protein này là yếu tố độc
lực cần thiết của EPEC (Donnerberg và ctv,1993). Theo Nataro và Kaper (1998), gen
eae hiện diện ở tất cả các chủng EPEC, EHEC, Clostridium rodentium và Hafnia
alvei, nhưng không hiện diện ở những dòng E. coli thuộc hệ vi khuẩn đường ruột
thông thường.
c. Dịch tễ của sự nhiễm EPEC
Cũng như những E. coli gây bệnh khác, sự truyền lây của EPEC qua đường
miệng, với sự vấy nhiễm qua tay, qua thực phẩm.
Điểm đáng chú ý nhất về mặt dịch tễ của bệnh do EPEC là sự phân bố lứa tuổi.
Bệnh thường biểu hiện cấp tính với tiêu chảy nghiêm trọng ở trẻ em. Người trưởng
thành và trẻ em lớn có phần đề kháng hơn với bệnh mà nguyên nhân có thể là do mất
các thụ thể đặc hiệu. Tuy nhiên, EPEC cũng có thể gây tiêu chảy ở người lớn nếu số
lượng vi khuẩn đủ cao.
2.1.5.3. Nhóm ETEC
a. Các yếu tố độc lực: ETEC có hai nhóm quyết định độc lực là độc tố ruột
(enterotoxin) và yếu tố định vị (colonization factor – CF)
 Độc tố ruột enterotoxin
Nhóm ETEC sản sinh độc tố ruột. Có hai loại: độc tố ruột chịu nhiệt (ST) và
độc tố ruột kém chịu nhiệt (LT).
(1) Độc tố kém chịu nhiệt (heat – labile toxin – LT):
Độc tố LT của E. coli là oligopeptide có liên hệ gần gũi về mặt cấu trúc và chức
năng với độc tố gây bệnh tả trên người (cholera toxin – CT) do Vibrio cholerae tiết ra.
LT và CT giống nhau nhiều đặc tính như cấu trúc, trình tự acid amin (giống nhau
khoảng 80%), tương đồng về thụ thể, hoạt tính enzyme, và kiểu tác động của nó trên
động vật hay trong nuôi cấy tế bào. LT có hai serogroup chính là LT-I và LT-II. LT-I
và LT-II không có phản ứng chéo về mặt miễn dịch.
- LT-I: Được tiết bởi những dòng E. coli gây bệnh trên người và thú. LT-I là

bệnh trên người và thú.
(2) Độc tố chịu nhiệt (heat – stable toxin – ST)
Ngược với LT, ST có trọng lượng phân tử nhỏ và những cầu nối disulfur của nó
giải thích cho khả năng chịu nhiệt của độc tố này. ST được chia thành hai nhóm là STa
và STb. Hai nhóm này khác nhau về cấu trúc và cơ chế hoạt động. Gen mã hóa cho cả
hai nhóm được tìm thấy chủ yếu trên plasmid và vài gen mã hóa ST cũng được tìm
thấy trên transposon. Độc tố STa (hay còn gọi là ST-I) do ETEC sản sinh và một vài vi
khuẩn Gram âm khác gồm Yersinia enterocolitica và V. cholerae không phải O1. ST
giống 50% trình tự acid amin với độc tố chịu nhiệt EAST1 của EAEC. Một số báo cáo
gần đây cho rằng một vài dòng thuộc nhóm ETEC ngoài việc sản sinh ra STa, còn có
thể sản sinh độc tố EAST1. Trong khi đó, STb chỉ được tìm thấy ở ETEC.
- STa: STa là một peptide gồm 18 – 19 acid amin với trọng lượng phân tử
khoảng 2 kDa. STa được chia thành hai loại là STp (ST porcine hoặc STIa) từ E. coli
phân lập được trên heo và STh (ST human hoặc STIb) của E. coli phân lập trên người.
Cả hai độc tố có thể được tìm thấy ở các dòng ETEC trên người.

21
Thụ thể chính của STa là enzyme xuyên màng guanylate cyclase C (GC-C).
STa kết hợp với thụ thể GC-C gây hoạt hóa GC, dẫn đến việc gia tăng lượng cGMP
nội bào. Hoạt động này cuối cùng dẫn đến sự gia tăng tiết Cl
-
và / hoặc ngăn cản sự
hấp thu NaCl, dẫn đến tăng lượng tiết chất lỏng trong ruột, gây tiêu chảy.
- STb: STb chủ yếu được tạo ra bởi những dòng ETEC được phân lập từ heo,
vài chủng ETEC được phân lập từ người cũng sản sinh STb. Không như STa, STb gây
ra những tổn thương về mặt mô học trên lớp biểu mô ruột như mất tế bào nhung mao
của lớp biểu mô ruột và teo nhung mao một phần. Thụ thể của STb chưa được biết rõ
mặc dù gần đây người ta cho rằng độc tố kết hợp không đặc hiệu với màng tế bào chất
trước khi vào bên trong tế bào. Không gây ra sự tiết Cl
-

trong môi trường ở những vùng có dịch và hầu hết trẻ em trong vùng này sẽ đương đầu
với ETEC trong thời kì thôi bú. Trẻ em đã ở tuổi đến trường và người lớn có nguy cơ
tiêu chảy do ETEC rất thấp. Dòng ETEC sản sinh ST là nguyên nhân của hầu hết các
trường hợp bệnh.
Các nghiên cứu dịch tễ học cho thấy rằng, thức ăn và nước bị ô nhiễm là những
phương tiện chủ yếu gây nhiễm ETEC (Black và ctv, 1981). Sự nhiễm ETEC, ở những
vùng dịch thường tập trung chủ yếu vào những tháng nóng và ẩm; khi đó, sự nhân lên
mạnh mẽ của ETEC trong thực phẩm và nước.
Mặc dù sự nhiễm ETEC xảy ra chủ yếu trên trẻ em, nhưng những người trưởng
thành chưa có miễn dịch cũng dễ bị nhiễm. Thật vậy, ETEC là nguyên nhân chính gây
tiêu chảy trên du khách trưởng thành từ những nước đã phát triển đến thăm những
vùng có dịch ETEC. Nhiều nghiên cứu cho rằng 20 - 60% số du khách này có triệu
chứng tiêu chảy và 20 - 40% các trường hợp là do ETEC. Tiêu chảy trên du khách
thường xảy ra ở những du khách lần đầu tiên đến thăm những nước đang phát triển.
Tiêu chảy trên du khách thường là do thức ăn và nước uống bị ô nhiễm.
c. Khía cạnh lâm sàng
Triệu chứng bệnh thường xảy ra đột ngột với thời gian nung bệnh ngắn (14 – 50
giờ). Bệnh nhân tiêu chảy toàn nước, thường không có máu; một vài bệnh nhân có
hiện tượng sốt và ói mửa. Tiêu chảy do ETEC có thể nhẹ, ngắn và tự bớt dần nhưng
cũng có thể gây ra tiêu chảy nghiêm trọng giống như nhiễm Vibrio cholerae.
Hầu hết các trường hợp nhiễm ETEC nguy hiểm đến tính mạng xảy ra trên trẻ
em thôi bú ở những nước đang phát triển. Mặc dù việc sử dụng kháng sinh nhạy cảm
cũng làm giảm mức độ tiêu chảy, nhưng những thuốc trị có hiệu quả thì không sẵn có
ở những vùng nguy cơ cao; ngoài ra sự đề kháng kháng sinh của dòng ETEC cũng là
vấn đề đáng quan tâm. Do đó cần phải lưu ý rằng cơ sở của việc chăm sóc bệnh nhân
nhiễm ETEC là duy trì đủ lượng nước trong cơ thể nếu có triệu chứng tiêu chảy.
d. Phát hiện và chẩn đoán
Việc phát hiện nhóm ETEC dựa vào sự phát hiện độc tố LT và/hoặc ST. Có
nhiều phương pháp phát hiện ETEC như: radioimmunoassay, enzyme linked
immunosorbent assay (ELISA), DNA-probe, PCR…

Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các primer) cho phép các primer bắt cặp
với khuôn, trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động khoảng 40 – 60
0
C tuỳ thuộc Tm
của các primer sử dụng và kéo dài từ 30 giây dến 1 phút.
 Giai đoạn 3: Giai đoạn kéo dài (elongation hay extension)
Nhiệt độ giai đoạn này được tăng lên 72
0
C giúp DNA polymerase hoạt động tổng
hợp DNA tốt nhất với sự hiện diện của 4 deoxyribonucleotide triphosphate. Đoạn
DNA nằm giữa hai primer được tổng hợp tạo thành chuỗi DNA.

24
* Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn trên sẽ được lặp lại nhiều lần và mỗi lần làm tăng
đôi lượng DNA mẫu của lần trước. Tổng DNA khuếch đại được tính theo công thức:
Tổng DNA khuếch đại = m*2
n

Với n: Số chu kỳ; m: Số bản sao của chuỗi mã hóa
* Sản phẩm kéo dài ở chu kỳ đầu tiên có chiều dài không xác định vì DNA
polymerase sẽ tiếp tục tổng hợp DNA mới đến khi nó dừng lại hoặc bị phá hủy bởi chu
kỳ tiếp theo.Sản phẩm kéo dài ở chu kỳ thứ hai cũng không xác định. Tuy nhiên, ở chu
kỳ thứ 3, đoạn DNA mong muốn (DNA đích) được tổng hợp có chiều dài xác định. Từ
chu kỳ thứ 4 trở đi, trình tự đoạn DNA đích được khuếch đại. Vì thế số copy cuối cùng
của trình tự đích được tính theo công thức:
Số copy cuối cùng của trình tự đích = (2
n
– 2n) * x
n : Số chu kỳ
2n: Sản phẩm có chiều dài không xác định sau chu kỳ 1 và 2

(elongation hay
exten
s
ion)25
Hình 2.1 Ngun lý của phản ứng PCR
Hình 2.2 Chu kỳ nhiệt độ của phản ứng PCR
2.2.3. Các thành phần của một phản ứng PCR
- DNA mẫu: là thành phần cần khuếch đại.
- Primer: Primer là những đoạn oligonucleotide mạch đơn, có trình tự bổ sung
với trình thự base của hai đầu mạch khn để khởi đầu q trình tổng hợp DNA. Việc
chọn primer là giai đoạn quyết định của phản ứng PCR. Các primer được chọn phải
đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, khơng trùng với các trình tự lặp lại trên
gen, khơng có sự bắt cặp bổ sung giữa primer xi và primer ngược và cũng khơng có
những cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp bổ sung trong cùng một primer. Chiều dài các
primer tối thiểu cho hầu hết các ứng dụng PCR là 18 nucleotide (thường là 18 – 24
nucleotide). Trình tự nằm giữa hai primer xi và ngược khơng q lớn, phản ứng
PCR sẽ tối ưu trên những trình tự nhỏ hơn 1kb.
- Taq polymerase: Taq polymerase là một DNA polymerase chịu nhiệt, được
chiết tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus ở suối nước nóng. Taq DNA polymerase
khơng bị phá hủy ở nhiệt độ cao và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối q trình phản
Biến tính
94-95
0
C

2+
(thường được sử
dụng ở dạng MgCl
2
) là một yếu tố ảnh hưởng mạnh đến hiệu quả và tính đặc hiệu của
phản ứng PCR. Ngoài ra nồng độ MgCl
2
có thể ảnh hưởng đến quá trình bắt cặp của
primer, nhiệt độ để biến tính DNA thành dây đơn, hoạt động của enzyme và sự trung
thực của kết quả. Nồng độ Mg
2+
phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử
nghiệm. Nồng độ MgCl
2
trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng thường biến thiên từ 0,5 –
5mM (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998).
2.2.4. Phân tích kết quả PCR
Sản phẩm của phản ứng PCR (đoạn DNA được khuếch đại) sẽ được phát hiện
bằng phương pháp điện di.
Nguyên tắc của phương pháp điện di là dựa vào đặc tính cấu trúc của các
DNA. DNA là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác
động của một điện trường, chúng sẽ di chuyển về điện cực dương của điện trường. Sự
di chuyển của phân tử trong bản gel dưới tác động của một điện trường phụ thuộc vào
khối lượng của các phân tử (tức là số nucleotide), nồng độ các thành phần của gel và
điện thế.
Điện di được thực hiện theo phương nằm ngang hoặc đứng. Các DNA trong gel
agarose được hiện ra dưới tia tử ngoại (UV) nhờ ethidium bromide. Chất này có khả
năng gắn xen giữa các base của acid nucleic và phát huỳnh quang dưới tác dụng của
tia UV (bước sóng


PCR cũng được ứng dụng trong chẩn đoán các tác nhân gây bệnh. Ví dụ:
Khuếch đại DNA của các vi khuẩn, virus trong các mẫu bệnh phẩm trước khi các triệu
chứng bệnh bắt đầu xuất hiện nhiều ngày, nhiều tuần, thậm chí nhiều tháng. Từ đó ta
có thể đề ra cách chữa trị thích hợp và ngăn chặn được thiệt hại.
2.2.5.3. PCR được dùng để khuếch đại RNA
PCR không chỉ khuếch đại các khuôn mẫu DNA, các khuôn mẫu RNA cũng
được khuếch đại nếu ban đầu chúng được biến đổi thành DNA tái tổ hợp (cDNA) nhờ
enzyme reverse transcriptase.
Một ứng dụng có ích của RT – PCR là xác định số lượng tương đối của một
mRNA trong các mô khác nhau hay trong cùng một mô nhưng tại các thời điểm khác