10DANH SÁCH CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ HÌNH TRANG
Hình 2.1. Nguyên lý của phản ứng PCR 13
Hình 2.2. Chu kỳ nhiệt độ của phản ứng PCR 14
Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm multiplex - PCR1 26
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm multiplex - PCR2 26

SƠ ĐỒ
Sơ đồ 3.1. Phân lập, xác định E. coli và phát hiện gen độc lực 22

BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 4.1. Tổng kết kết quả phát hiện các gen độc lực
của E. coli trên các mẫu khảo sát 40

Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Escherichia coli (E. coli) là vi khuẩn sống cộng sinh chiếm ưu thế trong hệ vi
sinh vật đường ruột của người và động vật. Tuy nhiên, khi có điều kiện thích hợp, một
số nhóm E. coli gây độc tăng sinh mạnh, trở thành nguyên nhân gây tiêu chảy nghiêm
trọng trên người và gia súc, đặc biệt là gia súc non. E. coli được xem là vi khuẩn chỉ
danh ô nhiễm thực phẩm và nước dựa vào số lượng của chúng. E. coli thải qua phân ra
môi trường bên ngoài. Nếu quá trình vệ sinh kém thì E. coli dễ vấy nhiễm vào thịt
tươi, nhất là trong quá trình giết mổ. Từ đó nếu việc bảo quản và chế biến thực phẩm
không thích hợp thì ngộ độc thực phẩm do E. coli hoàn toàn có thể xảy ra.
E. coli được chia thành nhiều nhóm như STEC, EPEC, ETEC, EAEC Trong
đó, nhóm STEC (Shiga Toxin Producing E. coli) mang nhiều gen độc lực như gen eae
chịu trách nhiệm sản sinh intimin giúp vi khuẩn bám dính vào niêm mạc ruột; gen hly
sản sinh độc tố gây dung giải hồng cầu; gen stx1, stx2 sản sinh các độc tố shiga gây hội
chứng viêm kết tràng xuất huyết (HC = hemorrhagic colitis) và hội chứng huyết niệu
(HUS = hemolytic uraemic syndrome) ở người, gen stx2e sản sinh độc tố vero gây
bệnh phùng thủng và tiêu chảy ở heo cai sữa. Trong khi đó, nhóm ETEC
(Enterotoxigenic E. coli ) mang gen lt sản sinh độc tố ruột kém chịu nhiệt (heat labile
toxin = LT) và gen st sản sinh độc tố ruột chịu nhiệt (heat stable toxin = ST) gây tiêu
chảy trên người và vật nuôi. Nhóm EPEC (Enteropathogenic E. coli) mang gen eae
sản sinh protein intimin, …
Trước đây, để phát hiện E. coli, người ta sử dụng phương pháp nuôi cấy truyền
thống. Phương pháp này gặp khó khăn là tốn thời gian, dịch bệnh đã lây lan rồi thì mới
có kết quả. Hơn nữa, E. coli là vi khuẩn bình thường ở đường ruột và cũng thường có

13
mặt trong thực phẩm nên việc phân lập được vi khuẩn E. coli trong phân để tìm
nguyên nhân gây bệnh hay xác định số lượng vi khuẩn trong thực phẩm hoàn toàn
không phản ánh được khả năng gây độc của chúng. Do vậy, việc phát hiện các gen gây

14

Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Vi khuẩn E. coli
2.1.1. Định nghĩa
- Vi khuẩn Escherichia coli là tên được đặt theo tên của nhà bác sĩ nhi khoa
người Đức Theodor Escherich (1857-1911), ông là người đầu tiên phân lập và mô tả vi
khuẩn này vào năm 1885.
- Vi khuẩn E. coli thuộc họ Enterobacteriaceae, giống Escherichia (Theo hệ
thống phân loại của Bergey).
- E. coli là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí tùy nghi, di động, kích thước khoảng
1,5

m x 0,5

m, không hình thành bào tử và có giáp mô (Trần Thanh Phong, 1996).
E. coli có mặt thường xuyên và chiếm ưu thế trong ruột của người và động vật máu
nóng, ở phần cuối của ruột non và ruột già. Nó vừa là vi khuẩn cộng sinh thường trực
ở đường tiêu hóa, vừa là vi khuẩn gây ra rất nhiều bệnh đường ruột và ở các cơ quan
khác.
2.1.2. Nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa
- Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 35 -37
o
C, pH thích hợp 6,4 – 7,5 (tối ưu là 7,2
– 7,4).
- E. coli có thể được phục hồi dễ dàng từ những mẫu có nguồn gốc khác nhau

Tuy nhiên, tác động qua lại giữa cơ thể vật chủ và màng nhầy ruột thì đặc hiệu
cho mỗi loại (Nataro và Kaper, 1998).
2.1.5. Phân loại E. coli
Dựa trên đặc điểm gây bệnh (đặc tính độc lực, sự tác động khác nhau lên màng
nhày của ruột, hội chứng lâm sàng của bệnh và sự khác nhau về mặt dịch tễ của bệnh),
E. coli được chia thành 5 nhóm sau:
 STEC (Shiga toxin – producing E. coli) hoặc VTEC (Vero toxingenic E.
coli) và EHEC (Enterohaemorrhagic E. coli)
 EPEC (Enteropathogenic E. coli)
 EAEC (Enteroaggregative E. coli)
 ETEC (Enterotoxigenic E. coli)
 Những nhóm khác gây bệnh tiêu chảy:
- EIEC (Enteroinvasive E. coli)

16
- DAEC (Diffusely adherent E. coli)
2.1.5.1. Nhóm STEC/ VTEC/ EHEC
a. Danh pháp
Những hướng khác nhau trong nghiên cứu đã đưa ra những danh pháp khác
nhau để đặt tên cho nhóm E. coli này:
- Tên gọi Verotoxigenic E. coli hoặc Vero cytotoxin producing E. coli
(VTEC) được Konowalchuk và cộng sự đặt cho nhóm này khi phát hiện nhóm này sản
xuất độc tố gây độc cho dòng tế bào vero vào năm 1997. Tên gọi VTEC được sử dụng
rộng rãi ở Anh và nhiều tổ chức khoa học ở Châu Âu.
- Tên gọi Enterohaemorrhagic E. coli (EHEC) được đặt là do dòng này gây
viêm kết tràng xuất huyết (HC: haemorrhagic colitis) và hội chứng huyết niệu (HUS:
haemolytic uraemic syndrome) (Nataro và Kaper, 1998).
- Tên Shiga toxin - producing E. coli (STEC) (trước đây gọi là Shiga like
toxin - producing E. coli - SLTEC) chỉ rõ khả năng sinh độc tố gây độc tế bào giống
như độc tố Shiga (Calderwood và ctv, 1997). Tên gọi STEC được sử dụng nhiều trong

không phải O157. Ở Đức, gần 90% dòng STEC được phân lập từ bệnh nhân có gen mã
hóa Ehly (Beutin và ctv, 1994). Tuy nhiên, việc sản sinh Ehly như là một yếu tố độc
lực thì khó đánh giá, vì trong các nghiên cứu của tác giả này, E. coli có Stx âm tính và
Ehly dương tính là nguyên nhân làm hư hại tế bào vero, Hep-2 hoặc Hela in vitro
(Beutin và ctv, 1989). EAST1 đầu tiên được mô tả trong EAEC cũng được tìm thấy
trong nhiều dòng STEC. EAST1 trong mầm bệnh của STEC thì không được biết,
nhưng nó có thể liên quan đến một số bệnh tiêu chảy không có máu thường xuyên
được tìm thấy ở những người bị nhiễm STEC (Nataro và Kaper, 1998).
Yếu tố bám dính của STEC đóng vai trò quan trọng cho vi khuẩn định vị ở tế
bào ruột. Đó là intimin - một loại protein có trọng lượng phân tử 94 – 97 kDa. Protein
intimin được mã hóa bởi gen eae (E. coli attaching và effacing). Intimin gây tổn
thương dạng bám dính và phá hủy (attaching - and – effacing, A/E) ở ruột già do vi
khuẩn bám chặt vào tế bào biểu mô (Donnerberg và ctv, 1993). Gen eae này cũng
được tìm thấy ở nhóm EPEC. Gen eae là một trong số các gen nằm trong vùng gây
bệnh 35,5 kb (gọi là vùng gây hư hại tế bào ruột - locus of enterocyte effacement,
LEE). Vùng LEE của STEC chứa những gen mã hóa intimin, gen mã hóa thụ thể để
vận chuyển intimin là Tir (translocated intimin receptor) và một số gen khác. Vùng
LEE không chỉ là điều kiện cần mà là điều kiện đủ cho việc hình thành tổn thương
A/E. Tuy nhiên, không phải tất cả STEC đều có gen eae, nhưng tất cả EHEC đều có
gen eae (Nataro và Kaper, 1998). Bệnh tích A/E phụ thuộc vào tương tác giữa protein

18
màng ngoài vi khuẩn (protein intimin) và protein Tir. Protein Tir được tiết ra khỏi vi
khuẩn, chuyển vị vào màng của tế bào vật chủ (Kenny và ctv, 1997).
Hầu hết các ổ dịch do STEC gây ra bởi những dòng O157:H7, nên người ta cho
rằng có thể serotype này độc hơn và dễ lây truyền hơn những serotype khác. Dấu hiệu
sinh hóa duy nhất cho những dòng STEC O157:H7 là không thể lên men sorbitol hoặc
không tạo ra

- glucuronidase. Vì thế, ở nhiều quốc gia, chẩn đoán STEC chỉ dựa vào