BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐
Trần Thị Nhã Uyên NGHIÊN CỨU VÀ THU NHẬN ENZYM PROTEASE TỪ CÁC
CHỦNG NẤM SỢI Ở RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT.
Mã số: 604240 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
TS. TRẦN THANH THỦY TP. Hồ Chí Minh , tháng 7 – năm 2010
MỞ ĐẦU
Lí do chọn đề tài.
Enzyme là chất xúc tác sinh học không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng, sinh sản
của sinh vật mà còn có vai trò rất lớn trong công nghiệp chế biến thực phẩm, y học, kĩ thuật phân
các chủng NS ở RNM Cần Giờ”.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu: các chủng NS phân lập tại 5 xã Long Hòa, Lí Nhơn,
Tam Thôn Hiệp, An Thới Đông, Bình Khánh ở RNM Cần Giờ.
Địa điểm nghiên cứu: PTN Vi sinh-Trường Đại học Sư Phạm Thành Phố H
ồ Chí Minh.
Mục tiêu của đề tài: Tìm ra một số chủng NS có khả năng sinh protease mạnh từ RNM Cần
Giờ và nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy tối ưu để thu nhận protease.
Nhiệm vụ của đề tài:
Phân lập các chủng NS từ RNM Cần Giờ.
Tuyển chọn các chủng NS có khả năng sinh protease cao.
Nghiên cứu đặc điểm hình thái và một số đặc tính sinh học của các ch
ủng NS tuyển
chọn.
Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện MT đến ST và hoạt độ protease của các chủng
NS được tuyển chọn, từ đó tìm ra MT tối ưu để nuôi cấy NS thu protease.
Thu nhận các chế phẩm enzyme bán tinh khiết.
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. RNM Cần Giờ.
1.1.1. Đặc điểm của RNM Cần Giờ.
1.1.1.1. Vị trí địa lý, điều kiện tự nhiên.
Về vị trí địa lý: RNM Cần Giờ có tọa độ 10°22’ – 10°40’ vĩ độ Bắc và 106°46’ – 107°01’
kinh độ Đông. Tổng diện tích khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ là 75.740 ha, trong đó vùng lõi
4.721 ha, vùng đệm 41.139 ha và vùng chuyển tiếp 29.880 ha [43].
0
C, nhiệt độ
thấp nhất là 18,8
o
C, cao nhất là 35
o
C. Biên độ dao động nhiệt trong ngày từ 5-7
o
C [30]. Độ ẩm trung
bình từ 73% đến 85%. Lượng mưa trung bình hàng năm từ 1.000 – 1.402 mm [66]. Độ mặn dao
động từ 1,8%-3% [2]. Độ mặn cũng thay đổi tùy theo mùa. Vào mùa khô có độ mặn cao hơn vào
mùa mưa. Độ mặn có ảnh hưởng rất lớn đến sự phân bố khu hệ SV ở RNM nói chung và NS nói
riêng.
Chế độ thủy triều: Cần Giờ chịu tác động của chế độ bán nhật triều không đều của biển
Đông. M
ỗi tháng có khoảng 2 ngày nhật triều không đều xuất hiện 2-3 ngày trước, giữa và cuối
tháng âm lịch. Biên độ triều tương đối lớn từ 3- 4m. Thời gian có biên độ triều lớn từ tháng 6- 8.
Mực nước trung bình cao nhất thường xuất hiện vào tháng 10, 11 và thấp nhất vào tháng 6, 7 [9].
Đất đai: toàn bộ huyện Cần Giờ thuộc loại đất phèn mặn gồm hai loại: đất phèn mặn theo
mùa và đất phèn mặn thường xuyên. Đất phèn mặn theo mùa n
ằm ở phía Bắc huyện Cần Giờ. Đất
thịt, giàu mùn, chứa nhiều xác hữu cơ dưới môi truờng yếm khí, chất dinh dưỡng khá, phản ứng của
đất từ chua đến rất chua, pH ở độ sâu của tầng sinh phèn xuống tới 2,4-2,7. Tuy nhiên vào mùa lũ,
mặn được đẩy ra xa, nước được pha loãng trong thời gian dài 4-5 tháng. Đất phèn mặn thường
xuyên chiếm phần lớn diện tích Cần Giờ. Đất thịt trung bình, nhiều mùn nhão l
ẫn xác hữu cơ bán
phân giải, bị ngập triều thường ngày, giàu dinh dưỡng, độ pH từ 5,8-6,5 [66].
1.1.1.2. Khu hệ SV ở RNM Cần Giờ.
RNM Cần Giờ là HST trung gian giữa HST thủy vực với HST trên cạn, HST nước ngọt và
HST nước mặn. Rừng Cần Giờ nhận một lượng lớn phù sa từ sông Đồng Nai, cùng với ảnh hưởng
hợp chất cellulose và lignin bị phân hủy cuối cùng. Trong quá trình phân hủy, lượng đạm trên các
mẩu lá tăng 2 – 3 lần so với ban đầu (Kaushik và Hynes, 1971). Khi phân tích, so sánh các loại acid
amin có trong lá tươi và lá phân huỷ, Casagrade (1970) đã thấy sự tăng tổng số các acid amin trên
bề mặ
t lá và trong thành phần lá phân hủy cao hơn hẳn lá tươi. Một số acid amin như α –
aminobyturic, α, γ diaminnobutyric và α, ε diamino pimonic cùng các loại acid citruline, ortrithine,
cystein là các sản phẩm được tạo ra trong quá trình trao đổi chất của VSV [51].
Các nghiên cứu VSV trong RNM ven biển đồng bằng sông Hồng và Cần Giờ (2001-2003) đã
chứng minh được một điều: ở các hệ sinh thái RNM này có tới 83/199 chủng nấm có khả năng phân
giải dầu mỏ ở các mức độ khác nhau. Nghiên cứ
u về RNM ở Nam Định và Thái Bình của trung tâm
MERD cũng phân lập được 605 chủng NS [13].
Ở RNM Cần Giờ, tác giả Khưu Phương Yến Anh đã phân lập được 312 chủng NS, trong đó
bao gồm các loài nấm thuộc các chi Penicillum, Aspergilus, Mucor, Tricoderma (2007) [1]. Tác giả
Võ Thị Bích Viên đã phân lập được 476 chủng NS trong đó có 266 chủng thuộc chi Aspergillus và
Penicillium (2009) [32].
1.1.2. Vai trò của RNM Cần Giờ.
RNM Cần Giờ được mệnh danh là "lá phổi xanh" của TP.HCM với vai trò quan trọng trong
đ
iều hòa khí hậu. Nhờ những đặc trưng riêng như tầng tán dày, hệ thống rễ chằng chịt... RNM được
đánh giá là một “bức tường xanh” vững chắc chống gió bão, sóng thần, xói lở, làm sạch MT ven
biển, hạn chế xâm nhập mặn, bảo vệ nước ngầm, tích lũy cacbon, giảm khí CO
2
,...
[51].
RNM có vai trò trong vấn đề giảm ô nhiễm từ chất thải rắn. Trong những năm qua, Trung
tâm nghiên cứu hệ sinh thái RNM đã phát hiện nhiều VSV có khả năng phân giải các chất thải khó
phân hủy có trong nước, làm sạch nước và biến thành thức ăn cho tôm cá. Nhờ đó phát hiện thêm
khả năng ngăn ngừa ô nhiễm môi trường của RNM. Khi có rừng, dưới tán rừng nhiệt độ thấp, lá cây
Hình 1.2. Sợi nấm có vách ngăn [55] Hình 1.3. Sợi nấm không có vách ngăn [55]
Hệ sợi của NS một số ăn sâu vào cơ chất gọi là khuẩn ty cơ chất hay khuẩn ty dinh dưỡng,
một số mọc ra ngoài bề mặt cơ chất gọi là khuẩn ty khí sinh. Những khuẩn ty khí sinh là những lông
tơ màu trắng, mọc thành lớp sợi mềm và dần dần sẽ có một số sợi phát triển thành cơ quan sinh sản
đặc bi
ệt mang bào tử. Màu sắc bào tử sẽ đặc trưng cho màu sắc NS khi già [23].
1.2.2. Cấu tạo của tế bào NS
Thành tế bào NS
Thành tế bào NS có cấu tạo bản mỏng và cấu tạo sợi [7].
Thành tế bào NS dày khoảng 2
μm
, nhưng rất chắc chắn [7].
Thành sợi nấm gồm nhiều bản mỏng chồng chất lên nhau nhờ đó mà vững và chịu được sức
ép các chất lỏng và rắn ở bên trong mà không bị rách hay nứt vỡ [7].
Mỗi bản mỏng gồm có phần nền không có cấu tạo đặc biệt, trên phần nền có các sợi nhỏ xếp
sát vào nhau và song song nhau. Điều đặc biệt là các sợi ở một bản m
ỏng song song với nhau nhưng
các sợi trên hai bản mỏng liên tiếp lại xếp chéo nhau, do đó làm cho vách sợi nấm rất mỏng nhưng
rất vững chắc [7].
Về thành phần hóa học, các hợp chất hóa học có chủ yếu ở vách sợi nấm cũng là những phân
tử có dạng sợi. Thảnh phần quan trọng ở vách sợi nấm là kitin. Một hợp chất gluxit khác cũng phổ
biến ở nhiều NS là glucan. Có th
ể coi kitin và glucan là khung của vách sợi nấm [7].
Vách sợi nấm không những che chở và bảo vệ, mà còn đảm đương một loạt các chức năng
khác: nhận thức ăn, chế biến thức ăn, thải chất bã, trao đổi khí,….
Để hoàn thành nhiệm vụ đó, ngoài kitin, glucan, còn có hàng rào lipit, protit và một loạt các
nấm ít hơn, ty thể dẹt hơn và gồ ghề hơn ở TV [7].
Không bào và các thể ẩn nhập.
Không bào thường có hình cầu, hình trứng. Ở
ngọn các sợi nấm hầu như không có không
bào, càng xa phần ngọn, số lượng không bào càng giảm nhưng kích thước càng lớn, ép chặt chất
nguyên sinh và nhân tế bào vào sát thành tế bào.
Dịch không bào thay đổi tùy theo tuổi và trạng thái sinh lý của tế bào. Dịch không bào chứa
các chất điện giải hòa tan: Na, K…một số chất hữu cơ ở trạng thái hòa tan hoặc trạng thái keo
(protein, glucid,….), các sắc tố và một số vật thể ẩn nhập [7].
Nhân tế bào NS
Nhân tế bào NS nói chung có kích thước rất nhỏ, phần lớn có đường kính 2-3
μm
, hình cầu
hoặc hình trứng [6].
Số lượng nhân trong tế bào không ổn định. Ở các sợi nấm ngăn vách số lượng nhân ở mỗi
đoạn sợi nấm giữa 2 vách ngăn có thể là 1,2 hoặc nhiều hơn. Số lượng nhân ở mỗi tế bào còn thay
đổi tùy điều kiện sống [7].
Nhân của tế bào NS là nhân thực. Nhân có vai trò chủ yếu là mang thông tin di truyền chứa
trong ADN, điều khiển tổng hợp các protein
đặc trưng ở mỗi loài, điều khiển tổng hợp enzyme, các
hoạt động của enzyme và nhiều hoạt động khác của tế bào [7].
1.2.3. Các hình thức sinh sản.
NS sinh sản dưới 2 hình thức: vô tính và hữu tính.
Sinh sản vô tính
Hình thức sinh sản vô tính đơn giản nhất là bằng mẩu sợi: một đoạn sợi nấm rơi vào cơ chất
mới gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành hệ sợi nấm mới [23].
Ngoài sinh sản vô tính bằng mẩu sợi, NS còn sinh sản bằng bào tử (bào tử kín, bào tử trần).
Đây là hình thức sinh sản vô tính phổ biến ở NS [23].
Có hai dạng bào tử vô tính là bào tử kín và bào tử
trần [23].
o
C và
nhiệt độ tối đa mà chúng có thể chịu đựng được là 35
o
C đến 40
o
C, cá biệt có một số loài có thể sống
sót ở 0
o
C và ở 60
o
C [55].
Để thu protease từ NS, nhiệt độ nuôi cấy được giữ ở 29-31
o
C trong khoảng thời gian 10-18
giờ, sau đó giảm nhiệt độ xuống 24 -25
o
C [21].
Với nhiệt độ trung bình là 25,8
o
C, RNM Cần Giờ có điều kiện nhiệt độ thuận lợi cho sự phát
triển của NS.
1.2.4.2. Độ ẩm.
Hình 1.4. Bào tử
kín [57]
Hình 1.5.
Bào tử trần
Hình 1.6. Quá trình
tiếp hợp [57]
Mỗi loài NS thích ứng với một khoảng độ ẩm tương đối [6].
Nguồn C có vai trò quan trọng đối với VSV và là cơ chất cần thiết cho quá trình trao
đổi chất
sơ cấp và thứ cấp [18].
NS có khả năng đồng hóa nhiều nguồn C khác nhau: các hidrat cacbon, các acid hữu cơ,
lipit…Nhiều loại NS còn có khả năng đồng hóa các chất hữu cơ rất bền hoặc chất độc đối với nhiều
SV khác [6].
Các loài NS thường không có những đòi hỏi nghiêm ngặt về các loại thức ăn cacbon. Tuy
nhiên, có thể là loại hợp chất này đồng hóa tốt hơn loại hợp ch
ất khác.
Nhiều loài NS thuộc bộ Mucorales chỉ đồng hóa được sacarose sau khi đã thủy phân nó
thành glucose. Trong khi đó, Chaethocladium hesseltinum lại có thể đồng hóa trực tiếp sacarose mà
không cần thủy phân trước [6].
Nguồn C tự nhiên thường được dùng trong nuôi cấy NS là bột mì, bột đậu tương, cám và
nước chiết của chúng. Nồng độ gluxit thích hợp cho quá trình tổng hợp protease cũng thay đổi tùy
loài VSV.
Có nhiều chất hydratcacbon và các hợp chất khác là nguồn C thích hợp đối với NS sinh
protease có hoạ
t lực cao [64]. Các nguồn C có tác dụng đến sự tổng hợp protease của NS có thể theo
thứ tự:
Đối với A. flavus: fructose→ glucose→ sacarose→ ramnose→ manose→ galactose→
arabinora→ lactose.
Đối với A. awamori: fructose→ manit→ sacarose→ arabinose→ manose→ galactose→
lactose.
Đối với A. oryzae: fructose→ sacarose→ maltose→ glucose→ manit→ arabinose→
galactose.
Thảm thực vật dày đặc là nguồn cacbon chủ yếu cho khu hệ NS ở RNM C
ần Giờ. Theo
Snedaker (1978), lượng lá rơi của cây RNM ở nam Florida là 10.000 – 14.000 kg khô/ha/năm. Kết
quả nghiên cứu ở rừng đước Cà Mau cho thấy lượng rơi là 9.719,9 kg/ha/năm, riêng lá chiếm
79,71%. Hàng năm rừng đước Cà Mau cung cấp cho hệ sinh thái RNM ở đây 8.400 – 12.000 kg
hoá học của lá mấm lưỡi đòng (
Avicennia officilalis) từ khi còn non cho tới khi lá bị phân huỷ, thấy
hàm lượng protein tăng lên rất cao [13].
+Ảnh hưởng của các nguyên tố khoáng [6].
Photpho: thường chiếm tỉ lệ cao nhất trong thành phần khoáng của NS. Nguyên tố photpho
tham gia vào cấu tạo của nhiều chất hữu cơ quan trọng trong tế bào NS: nucleotit,
nucleoprotein…..Photpho còn có mặt trong nhiều coenzyme quan trọng như ADP, ATP, NAD,
FAD…
Lưu huỳnh: tham gia vào thành phần một số acid amin (cystin, cystein….), lưu huỳnh cũng
có mặt trong nhiều coenzyme quan trọng như
CoA, biotin…
Kali: tham gia vào quá trình trao đổi glucid và ảnh hưởng đến nhiều quá trình trao đổi khác.
Magie: mang tính chất là một cofacto đối với nhiều enzyme. Magie tham gia vào quá trình
hoạt hóa khoảng 80 enzyme trong tế bào.
Canxi: đóng vai trò là cầu nối trung gian giữa nhiều thành phần quan trọng trong tế bào.
Canxi còn ảnh hưởng đến sự hình thành cấu trúc không gian ổn định của ribosom, nhân.
Sắt: tham gia vào kết cấu porphirin của các hệ thống enzyme chuyển vận electron.
1.2.5. Các phương pháp nuôi cấy NS thu nhận protease [19, 25, 64]
1.2.5.1. Nuôi cấy bề mặt.
Phương pháp này rấ
t thích hợp để nuôi cấy các loại NS thu nhận enzyme do khả năng phát
triển nhanh, mạnh của NS nên ít bị tạp nhiễm. Trong MT này, NS phát triển bao phủ bề mặt hạt chất
dinh dưỡng rắn, các khuẩn ty cũng phát triển đâm sâu vào lòng MT đã được tiệt trùng, làm ẩm.
Người ta thường dùng cám mì, cám gạo, ngô mảnh… có chất phụ gia là trấu. Cám, trấu, có
bề mặt tiếp xúc lớn, tạo được độ xốp nhiều, không có những chất gây
ảnh hưởng xấu đến sự phát
triển của NS. Tỉ lệ các chất phụ gia phải bảo đảm sao cho hàm lượng tinh bột trong khối nguyên liệu
không được thấp hơn 20%. Có thể bổ sung thêm nguồn N vô cơ, N hữu cơ và các chất kích thích ST
như malt, nước chiết ngô, nước lọc bã rượu.
+ Ưu điểm: chế phẩm dễ dàng sấy khô mà không làm giảm đáng kể hoạt tính enzyme, chế
khuấy đều, lắc trên máy lắc trong một thời gian xác định, lọc hoặc ly tâm thu lấy dịch trong. Trong
sản xuất thường dung nước máy để chiết rút với thể tích gấp hai lần thể tích MT, tiến hành chiết rút
enzyme trong một giờ. Tiến hành theo phương pháp này cho kết quả rất tốt.
Trong trường hợp nuôi cấy theo phương pháp bề sâu, trước hết cần làm lắng t
ế bào VSV
hoặc ly tâm để tách sinh khối khỏi dung dịch enzyme. Quá trình này là một giai đoạn quan trọng
nhất và khó nhất trong kĩ thuật sản xuất chế phẩm enzyme.
1.3. Protein và protease
1.3.1. Protein.
1.3.1.1. Khái niệm.
Protein là những đại phân tử được cấu tạo theo nguyên tắc đa phân mà các đơn phân là axít
amin. Chúng kết hợp với nhau thành một mạch dài nhờ các liên kết peptide. Các chuỗi này có thể
xoắn cuộn hoặc gấp theo nhiều cách để tạo thành các bậc cấu trúc không gian khác nhau của protein
[63].
Hình 1.7. Hình mô phỏng cấu trúc không gian của myoglobin [63]
1.3.1.2. Cấu trúc của protein
Protein là một hợp chất đại phân tử được tạo thành từ rất nhiều các đơn phân là các acid
amin. Acid amin được cấu tạo bởi ba thành phần: một là nhóm amin (-NH
2
), hai là nhóm cacboxyl
(-COOH) và cuối cùng là nhóm R quyết định tính chất của acid amin [15].
Dưới tác dụng của các tác nhân vật lý như tia cực tím, sóng siêu âm, khuấy cơ học... hay tác
nhân hóa học như acid, kiềm mạnh, muối kim loại nặng,... các cấu trúc bậc hai, ba và bậc bốn của
protein bị biến đổi nhưng không phá vỡ cấu trúc bậc một của nó, kèm theo đó là sự thay đổi các tính
chất của protein so với ban
đầu. Đó là hiện tượng biến tính protein. Sau khi bị biến tính, protein
thường có các tính chất sau:
- Độ hòa tan giảm do làm lộ các nhóm kỵ nước vốn đã chui vào bên trong phân tử protein
- Khả năng giữ nước giảm
- Mất hoạt tính sinh học ban đầu
- Tăng độ nhạy đối với sự tấn công của enzyme protease do làm xuất hiện các liên kết
peptide ứng với trung tâm hoạt động của protease.
- Tă
ng độ nhớt nội tại
- Mất khả năng kết tinh.
1.3.2. Protease.
1.3.2.1. Khái niệm.
Protease là loại enzyme tham gia phân giải protein để tạo thành các peptit ngắn và cuối cùng
tạo các acid amin và NH
3
[20].
protease
Hình 1.10.Cấu trúc một số loại protease [58]
H
2
N- CH- CO- NH- CH- CO- …- NH- CH- COOH
R1 R2 RX
H
2
N- CH- COOH + H
2
N- CH- CO … NH- CH- COOH + H
2
O
R1 R2 RX
b. Cơ chế hoạt động của protease [20, 64].
Các protease xúc tác phản ứng theo cơ chế chung:
E + S → E-S →E-S’ + P1 → E+P2
E: enzyme, S: cơ chất, E-S: phức chất enzyme-cơ chất, P: sản phẩm.
Theo các tác giả, cơ chế tác dụng của protease của VSV cũng giống với protease serine động
vật, đều tiến hành theo kiểu xúc tác acid- bazơ.
Nhóm serine protease là nhóm peptidase lớn nhất. Những enzyme này đều có chung một cơ
chế xúc tác phản ứng thủy phân thông qua hai bước chính (Barrett, 1994):
B
ước 1, acyl hóa: hình thành liên kết cộng hóa trị giữa nhóm -OH của serine với nguyên tử
C trong nhóm cacboxyl của phân tử cơ chất nhờ có hỗ trợ của nhóm imidazole từ histidine.
Bước 2, khử acyl hóa: phức hệ acyl - enzyme bị thủy phân bởi phân tử H
2
O theo chiều
ngược lại của bước một. Trong đó, nhóm imidazole chuyển proton của gốc -OH từ serine cho nhóm
chất xúc tác sinh học. Chính vì vậy, các nghiên cứu về enzyme đã thu hút sự quan tâm của các nhà
hóa sinh học, sinh học thực nghiệm và nhiều nhà nghiên cứu ở các lĩnh vực liên quan khác. Các
nghiên cứu nhằm theo hướng tách, tinh sạch enzyme, tạo các chế phẩm có độ sạch khác nhau,
nghiên c
ứu cấu trúc, mối liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của enzyme, khả năng ứng
dụng enzyme trong thực tế [64].
Đã có nhiều công trình nghiên cứu về protease của NS. Các tác giả M. Kalpana Devi, A.
Rasheedha Banu, G.R. Gnanaprabhal, B.V. Pradeep và M. Palaniswamy đã xác định đặc điểm
protease của Aspergillus niger (2008), Hajji M, Kanoun S, Nasri M và Gharsallah N khảo sát
protease của Aspergillus clavatus (2007), Agarwal D, Patidar P, Banerjee T nghiên cứu khả năng
sinh protease của Penicillium sp.
Từ 1950, khoa học bắt đầu quan tâm nghiên cứu NS ở RNM. Ở Macau và Hồng Kông tìm
được 45 loài nấm mớ
i từ RNM (1994). D. M. Alongi, B. F. Clough, A. I. Robertson đã khảo sát khu
hệ NS ở RNM miền Tây Úc (2005).
Chưa có nhiều nghiên cứu về protease từ NS ở RNM. Trên thế giới có công trình nghiên cứu
của G.L. Maria, K.R. Sridhar và N.S. Raviraja về khả năng sinh enzyme ngoại bào của một số loại
NS (Aspergillus sp, Fusarium sp, Penicillium sp, Trichoderma sp) ở RNM vùng Tây Nam Ấn Độ
(2005), công trình nghiên cứu của K. Kathiresan cũng chứng tỏ khu hệ VSV ở RNM Pichavaram
(thuộc miền Đông Nam Ấn Độ) có khả năng sinh nhiều loại enzyme ngoại bào như
kitinase, L-
asparaginase, cellulase, protease, phosphatase (2000).
Ở Việt Nam, nghiên cứu và thu nhận protease từ NS ở RNM là một vấn đề còn bỏ ngỏ. Theo
các công trình nghiên cứu của MERD về các chủng NS ở RNM Nam Định và Thái Bình cho thấy
60% các chủng NS có khả năng sinh protease, trong đó có 21 chủng có hoạt tính protease rất mạnh
được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu và ứng dụng [13].
Riêng ở RNM Cần Giờ, kết quả nghiên cứu trên hai chủng Penicillium và Aspergillus của tác
giả Võ Thị
Bích Viên cho thấy trong cả ba đợt thu mẫu vào ba thời điểm khác nhau, trên 80% số NS
có khả năng sinh protease [32].
V.
Hiện nay, việc đưa các protease tách từ VK (B. mesentericus, B. subtilis), NS (A. oryzae, A. flavus)
và xạ khuẩn (S. fradiae, S. griseus, S. rimosus...) vào công nghiệp thuộc da đã đem lại nhiều kết quả
và dần dần chiếm một vị trí quan trọng .
Trong công nghiệp dệt: protease VSV được sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo để
sợi được được bóng, dễ nhuộm. Ngoài ra, protease còn được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều
ngành khác nh
ư:
- Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực phẩm và
sản xuất một số thức ăn kiêng.
- Protease của NS và VK phối hợp với amylase tạo thành hỗn hợp enzyme dùng làm thức ăn
gia súc có độ tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn trong chăn nuôi gia súc và gia cầm.
- Điều chế MT dinh dưỡng của VSV để sản xuất vacxin, KS,…
- Sản xuất chất giặt tổng hợp, sản xuất mỹ phẩm,…
1.3.2.5. Một số chế phẩm của protease [19,21, 23].
Pepsin
Pepsin được thu nhận từ màng nhầy dạ con của heo và bê. Pepsin thường được sử dụng
chung với rennet trong sản xuất phomai và làm thuốc tiêu hóa. Hỗn hợp này hoạt động mạnh ở pH
2-4 và nhiệt độ 50
o
C.
Rennet
Thường được sản xuất từ bao tử của cừu, bê, người ta thường phối hợp với pepsin để sử dụng
trong công nghiệp chế biến sữa.
Papain
Papain được thu nhận bằng cách sấy khô mủ cây đu đủ carica papaya. Trong mủ cây đu đủ
có chứa papain, chymopapain, và một lượng nhỏ protease khác.
Papain được ứng dụng nhiều trong sản xuất bánh và công nghiệp chế biến thịt. Ngoài ra,
papain còn
ứng dụng trong y học để làm lành các vết thương ngoài da.
Protease acid Protease acid và kiềm Nhiều loại nấm sợi có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng dụng trong công
nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A. terricola, A. fumigatus, A. saitoi, Penicillium
chysogenum… Các loại NS này có khả năng tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung tính.
Các loại NS đen tổng hợp chủ yếu các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5-3.
Một số NS khác như A. candidatus, P. cameberti, P. roqueforti… cũng có khả năng tổng hợp
protease có khả
năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất phomát.
Protease từ NS gồm cả protease acid, kiềm và trung tính. Các protease acid và trung tính
được ứng dụng để sản xuất bia và công nghiệp bánh kẹo. Protease kiềm được ứng dụng trong công
nghệ thuộc da.
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Kính hiển vi Olympus CHL (Nhật Bản).
Tủ
lạnh Hytachi (Nhật Bản).
Máy đo pH Hana (Nhật Bản).
Máy ly tâm Heraeus (Nhật Bản).
Cân phân tích điện tử Scientech (Mỹ).
Máy đo quang phổ UV (Đức).
Máy chụp hình kĩ thuật số Olympus 5.1 (Nhật Bản).
Dụng cụ thí nghiệm: que cấy móc, qua cấy vòng, bình tam giác, ống nghiệm, ống đong, đèn
cồn, que trang, đĩa petri, thước đo, giấy lọc, bông mỡ, bông thấm nước, giấy lọc, khăn lọc, lame,
lammel,…..
2.4. Các MT sử dụ
ng trong thí nghiệm.
- MT phân lập, nuôi cấy, giữ giống và định danh NS
MT1-MT Czapek_Dox cải tiến [19]
NaNO
3
: 3,5g.
K
2
HPO
4
: 1,5g.
MgSO
4
.7H
2
O: 0.5g.
KCl: 0.5g.
FeSO
Khử trùng 1atm, 30 phút.
- MT thử hoạt tính enzyme ngoại bào.
MT5- MT thử hoạt tính amylase [5]
NaNO
3
: 3,5g.
K
2
HPO
4
: 1,5g.
MgSO
4
.7H
2
O: 0.5g.
KCl: 0.5g.
FeSO
4
.7H2O: 0.01g.
Tinh bột tan: 15g.
Agar: 20g.
Nước biển: 1000ml.
pH: 6.5.
Khử trùng 1atm/30phút
MT6- MT thử hoạt tính protease [5]
K
2
HPO
4
FeSO
4
.7H2O: 0.01g.
CMC: 10g.
Agar: 20g.
Nước biển: 1000ml.
pH: 6.5.
Khử trùng 1atm/30phút
Copyright: Tài liệu đại học ©