Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 20
Homepage: http://lethuylinh.weebly.com

tuyệt đối, dung dịch B là 40% NaOH hay KOH. Trước tiên nhỏ 6 giọt dung dịch A, sau
đó nhỏ 2 giọt dung dịch B. Đọc kết quả sau 20 phút hoặc chậm nhất 4 giờ. Salmonella
cho phản ứng âm tính với thử nghiệm VP có hiện tượng không đổi màu trên bề mặt môi
trường. Thử nghiệm VP (+) khi có màu đỏ trên bề mặt môi trường.

Bài 4. Định lượng Bacillus cereus
4.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản
B. cereus là những trực khuẩn, gram dương, hiếu khí và kỵ khí tùy ý, di động, tạo
nội bào tử, lên men glucose sinh hơi, phản ứng VP (+), có khả năng sử dụng nitrate. Loài
này tăng trưởng được trong khoảng nhiệt độ từ 5
0
C – 50
0
C, tối ưu ở 35
0
C – 40
0
C; pH dao
động từ 4.5-9.3, dễ tạo bào tử và bào tử nảy mầm rất dễ dàng. Trên môi trường chọn lọc
loài này tạo khuẩn lạc rất lớn, mọc lan, rìa nhăn.
4.2 Quy trình định lượng Bacillus cereus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
-
2
, 10
-
3

Trãi 0.1ml mỗi độ pha loãng lên môi trường thạch
MYP,
ủ

ở

30
0
C, 24 gi
ờ

Chọn 5 khuẩn lạc có màu hồng eosin, lecithinase
dương tính (tủa lecithinase bao quanh khuẩn lạc)
cấy sang thạch nghiêng MYP, ủ ở 30
0
C, 24 giờ
Nhuộm Gram và thử nghiệm sinh hóa như: lên
men glucose, th
ử

nghi
ệ
m VP.


cất
pH 7.2 ± 0.2
Phân phối cho mỗi tổ 50ml
BPW trước khi khử trùng.
(buổi 4)
MYP
(Mannitol-Egg
Yolk-Polymycin)

Môi trường cơ bản
Cao thịt: 1g
Pepton: 10g
Mannitol: 10g
NaCl: 10g
Phenol red (1% trong
ethanol 90%): 2.5ml
Agar: 15g
Nước cất: 900 ml
Dung dịch Polymixin
0.1%
Hòa tan 500 000 đơn vị
polymixin B sulfate
trong 50ml nước cất.
Lọc vô trùng và cất
trong tối 4
0
C cho đến
khi dùng.
Egg yolk emulsion 50%
(sản phẩm thương mại)

10 g
NaCl: 5 g
Beef extract (optional):
1 g
Dextrose: 5 g
Phenol red (7.2 ml of
0.25% solution): 0.018 g
1000 ml nước
cất
pH 7.4 ± 0.2

Phân phối 30ml PRG cho
mỗi tổ (3ml/ống nghiệm)
(buổi 4)
MR-VP Both
(Glucose
Phosphate)
Môi trường 1:
Buffered peptone-water
powder: 7g
Glucose: 5g
K
2
HPO
4
: 5g
Môi trường 2:
Casein Pancreatic
Digest: 3.5g
Peptic digest of animal

Bước 3: Pha loãng mẫu
Cho 25g mẫu vào túi PE, bổ sung 225ml môi trường BPW đồng nhất để có độ pha
loãng 10
-1
, đồng nhất bằng Stomacher trong 1 phút. Mẫu tiếp tục pha loãng thành 10
-2
,
10
-3
.
Bước 4: Phát hiện bằng môi trường chọn lọc
Trãi 0.1ml mỗi độ pha loãng trên môi trường thạch MYP, ủ ở
30
0
C, 24 giờ. Do B. cereus không lên men mannitol, tạo lecithinase
và kháng polymycin nên trên môi trường này khuẩn lạc B. cereus có
màu hồng eosin, được bao quanh bởi vùng có tủa chứng tỏ
lecithinase được tạo thành. Chọn 5 khuẩn lạc (+) cấy sang thạch
nghiêng để chuẩn bị cho các phản ứng khẳng định.
Bước 5: Các thử nghiệm khẳng định
- Nhuộm Gram: nhỏ 1 giọt nước cất lên phiến kính sạch;
dùng que cấy vòng lấy 1 ít sinh khối vi khuẩn chuyển vào giọt
nước trên phiến kính, khuấy nhẹ. Cố định vệt bôi trên phiến kính
bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn. Nhỏ vài giọt methyl violet
lên vệt bôi, giữ yên 20 giây. Rửa sạch phẩm nhuộm bằng nước.
Nhỏ vài giọt dung dịch KI/I
2
lên vệt bôi, để yên 1 phút. Rửa
bằng cồn 95% đến vừa mất màu. Rửa lại bằng nước. Nhuộm bằng dung dịch
safranin 30 giây. Rửa sạch bằng nước. Thấm nước dư bằng giấy lọc. Quan sát vi

nấm mốc và nấm men là mầm để tạo nên một khuẩn lạc khi nuôi cấy trong môi trường.
Mầm có thể là một bào tử, một tế bào hay một đoạn của khuẩn ty. Trong thực phẩm, nấm
mốc và nấm men hiện diện có thể tăng trưởng làm thay đổi màu của thực phẩm, làm phát
sinh mùi hay vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cơ cấu của thực phẩm.
Hình 20: thử nghiệm lên men glucose. Ống
a: đối chứng. Ống b: không lên men
glucose. Ống c: lên men yếu. Ống d: lên
men m
ạ
nh.