C¸n bé HDKH: TS. §µo Xu©n t©n
C¸n bé HDKH: TS. §µo Xu©n t©n
Häc viªn: §µo thÞ ngäc anh
Häc viªn: §µo thÞ ngäc anh
K11- Sinh häc thùc nghiÖm
K11- Sinh häc thùc nghiÖm

1.1 Cấu trúc phân tử insulin
1.1 Cấu trúc phân tử insulin
Insulin là một hoocmon protein do tế bào
Insulin là một hoocmon protein do tế bào
tuyến tụy sinh ra. Phân tử protein insulin có khối
tuyến tụy sinh ra. Phân tử protein insulin có khối
lượng khoảng 6000da. Cấu tạo bởi hai chuỗi
lượng khoảng 6000da. Cấu tạo bởi hai chuỗi
polypeptit A và B. Các chuỗi A và B liên kết với
polypeptit A và B. Các chuỗi A và B liên kết với
nhau bằng hai cầu nói đisulfua. Hầu hết các loài
nhau bằng hai cầu nói đisulfua. Hầu hết các loài
chuỗi A gồm 21aa; chuỗi B có 30aa
chuỗi A gồm 21aa; chuỗi B có 30aa

thụ thể - insulin làm phát tín hiệu truyền
thụ thể - insulin làm phát tín hiệu truyền
thông tin chuyển glucoz ra khỏi huyết
thông tin chuyển glucoz ra khỏi huyết
tương.
tương.H
H
ình 2:
ình 2:
Insulin gắn với thụ thể trên màng tế bào v
Insulin gắn với thụ thể trên màng tế bào v
à
à
tuần hoàn trong máu
tuần hoàn trong máu -
-Insulin thúc đẩy gan dự trữ glucoz ở dạng
Insulin thúc đẩy gan dự trữ glucoz ở dạng
glycogen. Glucoz bị photphoryl hoá nhờ enzym
glycogen. Glucoz bị photphoryl hoá nhờ enzym
hexokinase nhờ đó glucoz bị bẫy vào trong tế
hexokinase nhờ đó glucoz bị bẫy vào trong tế


1.2.2. Insulin và trao đổi lipit
1.2.2. Insulin và trao đổi lipit
a- Insulin thúc đẩy sinh tổng hợp các axit béo trong gan.
a- Insulin thúc đẩy sinh tổng hợp các axit béo trong gan.
Khi lượng glycogen trong gan quá cao (> 5% lượng thô của
Khi lượng glycogen trong gan quá cao (> 5% lượng thô của
gan) thì quá trình tổng hợp bị ức chế. Lượng glucoz hấp thụ vào tế
gan) thì quá trình tổng hợp bị ức chế. Lượng glucoz hấp thụ vào tế
bào gan chuyển sang tổng hợp axit béo và chuyển khỏi gan ở
bào gan chuyển sang tổng hợp axit béo và chuyển khỏi gan ở
dạng lipoprotein.
dạng lipoprotein.

Các lipoprotein đi vào vòng tuần hoàn, cung cấp các axit béo tự do
Các lipoprotein đi vào vòng tuần hoàn, cung cấp các axit béo tự do
cho các mô khác như mô mỡ để tổng hợp triglyxerit.
cho các mô khác như mô mỡ để tổng hợp triglyxerit.b- Insulin ức chế phân huỷ chất béo trong mô mỡ: bằng cách ức chế
b- Insulin ức chế phân huỷ chất béo trong mô mỡ: bằng cách ức chế
quá trình thuỷ phân triglyxerit thành glixerol và axit béo tự do.
quá trình thuỷ phân triglyxerit thành glixerol và axit béo tự do.Enzym nhạy cảm với hoocmon này trở nên hoạt động được khi
Enzym nhạy cảm với hoocmon này trở nên hoạt động được khi
photphoryl hoá. Insulin làm ngăn cản sự kết hợp với thụ thể trên màng tế
photphoryl hoá. Insulin làm ngăn cản sự kết hợp với thụ thể trên màng tế
1.3. Tổng hợp insulin trong cơ thể
1.3. Tổng hợp insulin trong cơ thể
Insulin được tổng hợp trong tế bào β của tuyến tụy.
Insulin được tổng hợp trong tế bào β của tuyến tụy.
Insulin được tạo ra từ một phần của một protein lớn hơn để
Insulin được tạo ra từ một phần của một protein lớn hơn để
đảm bảo sự gấp nếp đúng.
đảm bảo sự gấp nếp đúng.
mARN dịch mã protein preproinsulin. Preproinsulin
mARN dịch mã protein preproinsulin. Preproinsulin
gồm một trình tự đầu aa để tiền chất này đi qua lưới nội chất
gồm một trình tự đầu aa để tiền chất này đi qua lưới nội chất
tham gia vào quá trình sau dịch mã.
tham gia vào quá trình sau dịch mã.
Tại quá trình sau dịch mã preproinsulin bị thuỷ phân tạo
Tại quá trình sau dịch mã preproinsulin bị thuỷ phân tạo
thành dạng proinsulin. Sau khi hình thành 3 cầu đisulfua một
thành dạng proinsulin. Sau khi hình thành 3 cầu đisulfua một
số peptitdaza cắt proinsulin thành insulin hoàn chỉnh và hoạt
số peptitdaza cắt proinsulin thành insulin hoàn chỉnh và hoạt
động.
động.
Insulin được đóng gói và chứa trong các hạt tiết tích tụ
Insulin được đóng gói và chứa trong các hạt tiết tích tụ
trong tế bào chất đến khi được kích hoạt để giải phóng
trong tế bào chất đến khi được kích hoạt để giải phóng
.
.

ạo ra các chuỗi riêng biệt, kết hợp hoá học hoặc tạo một tiền
ạo ra các chuỗi riêng biệt, kết hợp hoá học hoặc tạo một tiền
chất chuỗi đơn proinsulin người, sau đó phân cắt để tạo thành
chất chuỗi đơn proinsulin người, sau đó phân cắt để tạo thành
insulin hoàn chỉnh.
insulin hoàn chỉnh.

Bước 1
Bước 1
:
:
Bằng kỹ thuật tách gen sử dụng trong sinh học phân
Bằng kỹ thuật tách gen sử dụng trong sinh học phân
tử tách được gen mã hoá proinsulin người trên nhiễm sắc thể
tử tách được gen mã hoá proinsulin người trên nhiễm sắc thể
số 11.
số 11.

Tách mARN của gen tổng hợp proinsulin từ mẫu nghiền tuỵ
Tách mARN của gen tổng hợp proinsulin từ mẫu nghiền tuỵ
của người. Dùng phản ứng RT-PCR với mồi đặc hiệu để
của người. Dùng phản ứng RT-PCR với mồi đặc hiệu để
khuếch đại gen. Do hầu hết các mARN của người đều có đuôi
khuếch đại gen. Do hầu hết các mARN của người đều có đuôi
polyA nên sử dụng chuỗi polyT để bắt cặp với đuôi polyA đó.
polyA nên sử dụng chuỗi polyT để bắt cặp với đuôi polyA đó.

Sử dụng sắc kí ái lực với polyT giữ lại mARN cần thiết cho
Sử dụng sắc kí ái lực với polyT giữ lại mARN cần thiết cho
quá trình dịch mã; còn lại loại bỏ ADN và các ARN khác.

- Sao mARN tinh khiết thành cADN nhờ enzym phiên mã ngược và nhờ
- Sao mARN tinh khiết thành cADN nhờ enzym phiên mã ngược và nhờ
các dNTP (trong phản ứng RT - PCR)
các dNTP (trong phản ứng RT - PCR)
- Cài đoạn cADN mã hoá insulin hoàn chỉnh vào plasmit đứng sau một
- Cài đoạn cADN mã hoá insulin hoàn chỉnh vào plasmit đứng sau một
promoter mạnh. Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn
promoter mạnh. Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn
E.coli.
E.coli.
Bước 3:
Bước 3:
Biến nạp plasmit tái tổ hợp vào
Biến nạp plasmit tái tổ hợp vào
E.coli
E.coli
nhờ phương pháp trộn
nhờ phương pháp trộn
với dung dịch ion Ca hoặc tạo lỗ xung điện. Sau quá trình biến nạp, cần
với dung dịch ion Ca hoặc tạo lỗ xung điện. Sau quá trình biến nạp, cần
chọn lọc được những dòng vi khuẩn mang gen mong muốn.
chọn lọc được những dòng vi khuẩn mang gen mong muốn.Hình 8: Tách và biến nạp plasmit tái tổ hợp vào
Hình 8: Tách và biến nạp plasmit tái tổ hợp vào
E.coli
E.coli
Bước 5
Bước 5
:
:
Tiền tinh sạch
Tiền tinh sạch
Sau khi lên men cần
Sau khi lên men cần
tách tế bào và khử trùng
tách tế bào và khử trùng
nhiệt.
nhiệt.

Dùng enzym lizozyme
Dùng enzym lizozyme
phá vỡ màng tế bào, sau
phá vỡ màng tế bào, sau
đó dùng hỗn hợp chất
đó dùng hỗn hợp chất
tẩy rửa để tách lớp
tẩy rửa để tách lớp
màng lipit.
màng lipit.
Bằng phương pháp ly

Hỗn hợp tinh
Hỗn hợp tinh
sạch chỉ còn có insulin.
sạch chỉ còn có insulin.
Bằng phương pháp sắc
Bằng phương pháp sắc
ký, tách và phương pháp
ký, tách và phương pháp
miễn dịch gắn enzym.
miễn dịch gắn enzym.
Độ tinh sạch của insulin
Độ tinh sạch của insulin
được đánh giá qua mỗi
được đánh giá qua mỗi
giai đoạn trung gian của
giai đoạn trung gian của
quá trình sản xuất nhờ
quá trình sản xuất nhờ
phòng thí nghiệm chuyên
phòng thí nghiệm chuyên
hoá. Cuối cùng insulin
hoá. Cuối cùng insulin
được tinh thể hoá
được tinh thể hoá
.
.
Hình 12: Các tinh thể insulin

Có nhiều ưu điểm: tế bào nấm men tạo phân tử insulin người
gần như hoàn chỉnh với cấu trúc không gian hoàn hảo.
gần như hoàn chỉnh với cấu trúc không gian hoàn hảo.
Điều đó làm giảm tối đa tính phức tạp và giá thành của các
Điều đó làm giảm tối đa tính phức tạp và giá thành của các
giai đoạn tinh sạch.
giai đoạn tinh sạch.

Hình 13: Sản xuất insulin bằng cách tổng hợp riêng rẽ hai chuỗi A và B.
Hình 13: Sản xuất insulin bằng cách tổng hợp riêng rẽ hai chuỗi A và B.