i
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
VI
Ệ
N V
Ệ
SINH D
Ị
CH T
Ễ
TRUNG ƯƠNG
*
HOÀNG VŨ MAI PHƯƠNG
TÍNH KHÁNG THUỐC OSELTAMIVIR
CỦA VIRUT CÚM A LƯU HÀNH
TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM, 2001 – 2012 LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong
bất kỳ công trình nào khác.
NGHIÊN CỨU SINH Hoàng Vũ Mai Phương
iv
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, tôi xin trân trọng cảm ơn:
Khoa Đào tạo và Quản lý khoa học, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương.
Ban Giám đốc, Ban Chủ nhiệm Khoa Virút, Viện Vệ sinh Dịch tễ
Trung Ương.
Đã tạo điều khiện tốt nhất, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến GS.TS Đặng Đức Anh, người đã tạo điều kiện
cho tôi đến với chuyên ngành vi rút, cho tôi những lời khuyên hữu ích, sự động viên và
lòng nhiệt tình trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin gửi
lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Lê Thị Quỳnh Mai, người đã tận tình dìu dắt giúp
đỡ tôi từ những ngày đầu tiên bước chân vào lĩnh vực vi rút học, truyền đạt những
kinh nghiệm quý báu và luôn khuyến khích tôi bước về phía trước, tiếp cận với những
kiến thức nâng cao và mở rộng để tôi có thể hoàn thành luận văn này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Nguyễn Lê Khánh Hằng, Ths Nguyễn Cơ
Thạch, Ths Lê Thị Thanh, CN Phạm Thị Hiền cùng các bạn đồng nghiệp công tác
tại Phòng thí nghiệm Cúm - Khoa Vi rút - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương đã
nhiệt tình giúp đỡ và ủng hộ tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự tài trợ của Trung tâm Cúm thuộc Viện sức
1.2.3. Các thuốc kháng vi rút mới 23
1.3. Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm A với thuốc kháng vi rút 25
1.3.1. Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm với thuốc amantadine 25
1.3.2. Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm với thuốc oseltamivir 26
1.4. Kỹ thuật áp dụng trong quá trình xác định tính kháng thuốc của vi rút cúm A 27
vi
1.4.1. Nguyên nhân của hiện tượng kháng thuốc 27
1.4.2. Các kỹ thuật được áp dụng trong giám sát sự kháng thuốc thông qua sự
thay đổi vật liệu di truyền của vi rút cúm 28
1.4.3. Kỹ thuật xác định mức độ kháng oseltamivir dựa trên hoạt động của
neuraminidase 32
1.4.4. Giám sát sự kháng thuốc vi rút cúm 34
CHƯƠNG II - ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37
2.1. Đối tượng nghiên cứu 37
2.2. Phương pháp nghiên cứu 37
2.3. Vật liệu và kỹ thuật xét nghiệm 38
2.3.1. Vật liệu 38
2.3.2. Kỹ thuật xét nghiệm 42
2.4. Phân tích số liệu 51
CHƯƠNG III – KẾT QUẢ 53
3.1. Các vi rút cúm A thu thập trong giai đoạn từ 2001 – 2012 53
3.2. Xác định giá trị IC
50
ngưỡng của các phân típ vi rút cúm A 54
3.3. Sự tương tác của oseltamivir với các vi rút cúm A 60
3.4. Vị trí đột biến trên protein NA của các chủng cúm A liên quan đến kháng
thuốc oseltamivir 65
3.5. Tỉ lệ các chủng vi rút cúm A kháng oseltamivir tại miền Bắc Việt Nam,
2001-2012 69
APHL
Association of Public Health Laboratories
(Tổ chức của các PTN trong hệ thống Y tế Cộng đồng)
ATSH An Toàn Sinh Học
DNA Deoxiribonucleic Acid
GISRS
Global Influenza Surveillance and Response System
(Hệ thống phản ứng và giám sát cúm toàn cầu)
IC
50
Inhibition Concentration 50% (Nồng độ ức chế 50% vi rút)
IQR Interquartile Range (Khoảng liên tứ phân vị)
ISIRV-AVG
International Society for Influenza and other Respiratory
Virus Diseases – Antiviral Group (Hiệp hội quốc tế về
cúm và các vi rút gây bệnh đường hô hấp khác – Nhóm
nghiên cứu thuốc kháng vi rút)
Kb Kilobase
NAI Neuraminidase Inhibition (Ức chế neuraminidase)
NIID
National Institute of Infectious Diseases - Japan
(Viện các bệnh truyền nhiễm quốc gia – Nhật Bản)
PCR Polymerase Chain Reaction
pdm Pandemic
PTN Phòng Thí Nghiệm
RNA Ribonucleic Acid
RT-PCR Reverse transcription-polymerase chain reaction
SOP Standard Operating Procedure (Quy trình chuẩn)
TCYTTG Tổ chức Y tế Thế giới
3.4. Giá trị IC
50
của các chủng A/H1N1pdm09 kháng oseltamivir năm
2009 và 2011
61
3.5. Giá trị IC
50
của các chủng A/H3N2 từ năm 2003 đến 2012
62
3.6. Giá trị IC
50
của các chủng A/H5N1 năm 2005 và 2008
62
3.7. Kết quả phân loại mức độ giảm độ nhạy của vi rút cúm A với
oseltamivir
64
3.8. Mức độ giảm nhạy cảm của vi rút cúm với oseltamivir và các điểm
đột biến
70
3.9. Tỉ lệ kháng oseltamivir của các chủng vi rút cúm A trong nghiên cứu
dựa trên hai phương pháp (ức chế neuraminidase và giải trình tự gen)
71
x
2.1. Thang chỉ thị phân tử chuẩn 1 kb Invitrogen
50
3.1. Đột biến tại vị trí 275 trên protein NA của các chủng cúm A/H1N1
66
3.2. Đột biến tại vị trí 275 trên protein NA của các chủng cúm
A/H1N1pdm09
67
3.3. Đột biến tại vị trí 117 trên protein NA của các chủng cúm A/H5N1
68
3.4. Đột biến tại vị trí 275 trên protein NA của các chủng cúm A/H5N1
69
3.5. Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H1N1, 2001-2009
74
3.6. Cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa HA các chủng cúm A/H1N1 –
nhóm 2, 2001-2009
75
3.7. Cây gia hệ gen NA các chủng cúm A/H1N1, 2001-2009
76
3.8. Cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa NA các chủng cúm A/H1N1- nhóm
2, 2001-2009
77
3.1. Sự phân bố giá trị IC
50
của toàn bộ các chủng cúm A, 2001-2012
55
3.2. Độ tập trung của các giá trị IC
50
của các chủng A/H1N1 trong nghiên
cứu 57
3.3. Độ tập trung của các giá trị IC
50
của các chủng A/H1N1pdm09 trong
nghiên cứu 58
3.4. Độ tập trung của các giá trị IC
50
của các chủng A/H3N2 trong nghiên
cứu
58
3.5. Độ tập trung của các giá trị IC
50
của các chủng H5N1 trong nghiên
cứu
có thể gây ra thay đổi trong vật liệu di truyền của vi rút mà một trong những hệ
quả là xuất hiện vi rút kháng thuốc ở thế hệ sau. Hiện tượng kháng thuốc có thể
ảnh hưởng đến quá trình điều trị của bệnh nhân: thời gian điều trị kéo dài, khả
năng hồi phục sau điều trị chậm và tăng khả năng lây truyền chủng vi rút cúm
kháng thuốc ra cộng đồng, làm tăng thêm gánh nặng bệnh tật cho bản thân bệnh
nhân và xã hội [28, 81, 90, 121].
Việc tìm hiểu khả năng kháng thuốc, mức độ tiến hoá của vi rút có ý nghĩa lớn
cho việc điều chỉnh phác đồ điều trị, phối hợp thuốc, hạn chế ảnh hưởng và lan
2
truyền của hiện tượng kháng thuốc trong quần thể. Đặc tính kháng thuốc cũng như
mức độ tiến hoá của vi rút đã được tiến hành tại nhiều phòng thí nghiệm (PTN)
trên thế giới như Mỹ, Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan Các nghiên cứu tập
trung vào việc phát hiện, giám sát và theo dõi các trường hợp kháng thuốc đơn lẻ
hoặc theo nhóm, tìm hiểu các đột biến trên gen có liên quan đến khả năng kháng
thuốc của vi rút cúm trên người và trên gia cầm [8,11,12,26,51]. Số liệu từ các
nước Châu Âu, Úc, Mỹ và các nước khu vực Đông Nam Á cho thấy vi rút A/H1N1
lưu hành trước năm 2007 có tỉ lệ kháng oseltamivir thấp (0,3-2,2%), từ 2007 đến
2009 tỉ lệ kháng tăng dần (23% năm 2007, 43-60% năm 2008 và 95% năm 2009)
[27, 66, 110]; các vi rút A/H3N2 được xác định kháng hoàn toàn (100%) với
amantadine.
Tại Việt Nam, quá trình này đã được thực hiện bước đầu từ năm 2005 dựa trên
chương trình Giám sát Cúm Quốc gia và đơn vị nghiên cứu lâm sàng trường đại
học Oxford thuộc bệnh viện Bệnh nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh [18,36,37].
Tại phòng thí nghiệm Cúm - viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, những trường hợp
nhiễm vi rút cúm có mang gen kháng thuốc đơn lẻ đã được xác định từ những năm
2001 [56, 58, 60]. Tuy nhiên, các nghiên cứu về vi rút cúm kháng thuốc mới chỉ
hoàn thành ở mức độ ca bệnh riêng lẻ hoặc theo dõi một chùm ca bệnh, chưa có
nghiên cứu hệ thống theo dõi quá trình kháng thuốc và sự tiến hoá theo thời gian
của chủng vi rút cúm A mang gen kháng thuốc.
Để tìm hiểu hiện tượng kháng thuốc oseltamivir của vi rút cúm về sự lưu hành,
và C, trong đó típ A và B thường
gây thành dịch, típ C gây bệnh
nhẹ và không lan thành dịch. Hệ
gen của vi rút cúm A là Axit
Ribonucleic (RNA) đơn âm, chia
8 phân đoạn mã hoá cho 11
protein. Về mặt cấu trúc,
nucleocapsid được bao bọc bởi
màng protein nền (M1), phía ngoài
màng lại được bao bọc bởi vỏ ngoài là
lớp lipit kép có nguồn gốc từ màng
sinh chất của tế bào chủ. Protein M2
đâm xuyên và nhô ra khỏi vỏ ngoài,
tạo thành các kênh ion, làm cho pH
trong endosome thay đổi, có vai trò
quan trọng trong việc hình thành hạt
vi rút mới. Trên phần vỏ có 2 loại
Hình 1.2. Hình ảnh vi rút cúm
Nguồn: www.nature.com
glycoprotein xuyên màng là heamagglutinin (HA) và neuraminidase (NA).
Heamagglutinin có cấu trúc hình trụ, được cấu tạo bởi hai phân tử riêng biệt HA1
và HA2 nối với nhau bằng cầu disulphua, các phân tử trên HA gắn vào màng lipid
bằng đầu kỵ nước. Glycoprotein quan trọng thứ hai trên bề mặt vi rút cúm là
neuraminidase (NA). Cấu trúc NA có dạng hình nấm, các phân tử NA ở phần thân
gắn với lớp màng qua các đầu kỵ nước. Phần lõi của vi rút bao gồm các phức hợp
5
ribonucleoprotein: các polymerase protein PB1 (polymerase basic 1), PB2
(polymerase basic 2) và PA (polymerase acidic); NP (nucleoprotein).
Nucleoprotein gắn với các đoạn RNA của vi rút tạo thành nucleocapsid. Tồn tại
Protein
được mã
hóa
Chiều dài protein
được mã hóa
(Axit amin)
Chức năng
1 2341 PB2 759 Polymerase khởi đầu phiên mã
2 2341
PB1 757
Kéo dài phiên mã, hoạt hóa
enzyme nội bào
PB1-F2 87
Thúc đẩy quá trình chết của tế
bào chủ
3 2233 PA 716 Kéo dài phiên mã
4 1778 HA 550
Ngưng kết hồng cầu, bám gắn
xâm nhập vào tế bào chủ
5 1565 NP 498
Bám gắn với RNA, điều khiển
quá trình nhân lên của vi rút.
6 1413 NA 454
Giải phóng vi rút khỏi tế bảo
chủ
7
1027
M1 252
Protein nền: Thành phần chính
ngưng kết giữa các hạt vi rút mới sau khi được giải phóng ra khỏi tế bào, đảm bảo
vi rút mới sau khi được giải phóng có khả năng gây nhiễm. Neuraminidase cũng
đóng vai trò quan trọng trong khả năng gây bệnh của vi rút cúm. Sự hoạt động của
neuraminidase làm tăng hoạt động của các cytokine, thúc đẩy nhanh quá trình chết
của tế bào chủ. Ngoài ra, các nhà khoa học đã chứng minh được vi khuẩn gây nhiễm
trùng thứ phát như viêm phổi đặc biệt nguy hiểm cho các bệnh nhân có bệnh mạn
tính, trẻ nhỏ, người già và phụ nữ có thai, có quan hệ chặt chẽ với những hoạt động
của neuraminidase như nhiễm Streptococcus pneumonia, có thể làm quá trình viêm
nhiễm đường hô hấp trầm trọng hơn [122].
Vi rút cúm A được chia thành các phân típ dựa trên hai kháng nguyên bề mặt
heamagglutinin (HA) và neuraminidase (NA) của vi rút. Sử dụng HA để xác định
phân nhóm của vi rút cúm A, các nhà khoa học đã xác định được 17 loại
hemagglutinin khác nhau, trong đó H17 được xác định từ vi rút phân lập từ dơi
8
[105]. Các phân típ NA chủ yếu gây bệnh trên người là N1 (H1N1, H5N1, H1N1
đại dịch), N2 (H3N2, H9N2) và gần đây là N9 (H7N9).
Dựa vào sự khác nhau về axit amin tại vùng đầu phía ngoài, neuraminidase của vi
rút cúm được chia làm 2 nhóm riêng biệt [109]:
Nhóm 1 gồm N1, N4, N5 và N8
Nhóm 2 gồm N2, N3, N6, N7 và N9.
Sự thay đổi axit amin tại vị trí 147-152 đã tạo nên vùng khác biệt về hình khối nằm
ngay cạnh vị trí hoạt động của N1 mà không xảy ra trên N2. Vùng khác biệt này có
thể được coi là vùng đích của thuốc kháng vi rút trong tương lai.
Thuốc kháng vi rút oseltaminvir, zanamivir gắn vào NA, ức chế khả năng giải
phóng của vi rút cúm dựa trên hiểu biết về hoạt động của neuraminidase, xúc tác
quá trình cắt đứt mối liên kết α2,3 hoặc α2,6 ketosidic giữa axit sialic và thụ thể
HA. Tuy nhiên, các đột biến về axit amin trên phân đoạn gen mã hóa NA tại các vị
trí bám gắn với thuốc là nguyên nhân của sự kháng thuốc của vi rút, cụ thể với N1
tại vị trí I117V, I222K, S246N, H275Y và N294S; với N2 tại các vị trí E119V,
Q136K, R292K và N294S.
cầm H5N1. Đột biến E627K (Glutamin chuyển thành Lysin) trên PB2 của vi rút
cúm gia cầm làm tăng khả năng thích nghi với điều kiện sống của vi rút trên vật chủ
mới - người (vi rút tồn tại và nhân lên trên gia cầm tại nhiết độ tối ưu là 37
o
C, khi
mang gen đột biến, vi rút có khả năng thích nghi và phát triển được trên tế bào
đường hô hấp trên của người – với nhiệt độ tối ưu là 33
o
C) [99]. Đột biến này đã
được xác định trên gen PB2 của chủng cúm gia cầm mới xuất hiện A/H7N9 [62,
63]. Một protein có kích thước nhỏ PB1-F2 (87 axit amin) có chức năng thúc đẩy
quá trình chết của tế bào chủ mà không tìm thấy dạng tương tự trong hệ gen của vi
rút cúm B và C [65, 122].
Nucleoprotein (NP): NP được mã hóa bởi phân đoạn thứ 5 trong bộ gen của vi
rút cúm có tính bảo tồn cao đóng vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên, tạo
thành hạt vi rút mới [43]. Chức năng chủ yếu của NP là tham gia vào quá trình tổng
hợp RNA của vi rút và quá trình tạo thành hạt vi rút mới. Ngoài ra, NP tương tác
10
với và các protein PB1 và PB2 nhưng không xảy ra với protein PA [85]. Các
enzyme này khi hoạt hóa sẽ tham gia vào quá trình nhân lên và phiên mã RNA của
vi rút cúm đồng thời hoạt động như một nuclease nội bào có liên hệ với
ribonucleoprotein (RNP). Hình 1.3. Sự tham gia của các polymerase vào quá trình sao mã của vi rút cúm Hình 1.4. Cấu trúc ribonucleoprotein của vi rút cúm
Nguồn: Paul Digard, Dept. Pathology, University of Cambridge.
Protein không cấu trúc (NS1-NS2): NS1 và NS2 được mã hóa bởi đoạn RNA
Sự tổng hợp RNA, các protein và sự giải phóng của vi rút
Khác với các vi rút mang RNA sợi đơn âm, RNA của vi rút cúm được tổng hợp
và nhân lên tại nhân tế bào. Các RNP được chuyển vào nhân tế bào, phức hợp
polymerase gắn vào RNA của vi rút, đồng thời cắt mRNA của tế bào chủ bằng hoạt
động của nuclease nội bào. Nuclease nội bào của vi rút cắt đầu 5’ đã được gắn mũ
và metyl hóa của mRNA của tế bào chủ với độ dài khoảng 13 đến 15 ba-zơ và dùng
đoạn này làm mồi để tổng hợp mRNA của vi rút. Enzyme RNA polymerase của vi
12
rút thực hiện quá trình tổng hợp sợi mRNA bổ sung với RNA đơn âm. Phần intron
(vùng câm) của mRNA vi rút bị cắt bởi các enzyme của tế bào để các protein M1
hay NS1 được tổng hợp mà không cần thêm một sự phân cắt nào. Một số protein
mới được tổng hợp quay trở lại nhân tế bào gắn vào RNA để hình thành RNP. Các
protein còn lại di chuyển tới lưới nội bào và thể Golgi thực hiện quá trình glucosyl
hóa sau đó tiếp tục tới màng tế bào và gắn vào lớp lipid kép của màng. Khi quá
trình gắn của các protein vào màng hoàn chỉnh, các RNP và M1 liên kết các thành
phần lại để tạo nên hạt vi rút. Cuối cùng, hạt vi rút nảy chồi ra phía ngoài màng tế
bào chủ rồi được tách ra khỏi tế bào nhờ hoạt động của neuraminidase (Hình 1.5). Hình 1.5. Cơ chế nhân lên của vi rút và cơ chế tác dụng của thuốc kháng vi rút
Nguồn: Nature Review – Drug Discovery 13
1.1.3. Thay đổi nhỏ và thay đổi lớn trong hệ gen của vi rút cúm A
Những thay đổi nhỏ trên gen
Polymerase của vi rút cúm và các vi rút mang RNA nói chung không có chức
năng sửa chữa sai sót trong quá trình kéo dài chuỗi sau mỗi lần nhân lên (khoảng
một lỗi sai sau mỗi lần nhân lên) và đã tạo ra các biến đổi trong RNA thế hệ mới.
Những biến đổi này xuất hiện một cách tự nhiên trên các phân đoạn gen của vi rút
kháng NA, tạo nên một dòng kháng thể mới khác biệt so với dòng kháng thể thu
được trước đây khi chưa xuất hiện đột biến [92]. Tuy nhiên, chỉ miễn dịch thu được
khi tác dụng với phần bảo tồn của NA mới mang tính bảo vệ.
*Những thay đổi nhỏ trên gen M
Tìm hiểu về tiến hóa của gen M cho thấy M1 có sự thay đổi axit amin ở mức
26,4% và M2 có sự thay đổi 48,5% axit amin. Sự khác biệt này là do gen M2 chịu
áp lực chọn lọc của kháng thể bảo vệ cao hơn M1. Tuy nhiên, sự thay đổi nhiều trên
gen M2 chỉ quan sát thấy trên các vi rút cúm người và cúm lợn, hầu như không xảy
ra với các chủng cúm gia cầm. Quan sát gen M1, hầu hết các thay đổi trên gen đều
không dẫn đến thay đổi axit amin, ngoài ra, so sánh tần suất đột biến theo năm trên
M1 và M2 và các gen còn lại của vi rút cho thấy tần suất này thấp hơn tần suất đột
biến của gen còn lại, do vậy có thể coi gen M là gen có tính bảo tồn cao [29].
Những thay đổi lớn trên gen liên quan đến sự thay đổi về mặt kháng nguyên
Những nghiên cứu trong phòng thí nghiệm so sánh các vi rút phân lập được từ
những vụ dịch những năm 1918, 1947-1956, 1957-1967, 1968 cho thấy những vụ
dịch này cùng có một nguyên nhân là cúm A phân típ H1N1 nhưng có sự biến đổi
lớn về mặt di truyền học và đặc tính kháng nguyên (không có hoặc có kết quả phản
ứng chéo với hiệu giá không cao khi thực hiện phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu
giữa vi rút mới xuất hiện và các kháng thể tồn lưu tạo ra bởi các phân típ vi rút cũ).
Copyright: Tài liệu đại học ©