i
LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của
nhiều tổ chức và cá nhân. Qua đây tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:
Trường Đại học Nha Trang, Khoa Nuôi trồng Thủy sản, phòng Bệnh và Môi
trường của Trung tâm Giống hải sản miền Trung thuộc Viện nghiên cứu Nuôi trồng
Thủy sản 3, phòng Công nghệ phôi của Viện công nghệ sinh học Hà Nội là những cơ
quan đã giúp đỡ về mặt vật chất và kỹ thuật để tôi hoàn thành đề tài này.
TS Nguyễn Chí Thuận - giáo viên hướng dẫn, người đã định hướng, giúp đỡ và
tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi thực hiện đề tài.
Cô Nguyễn Hoàng Uyên, các anh Phạm Ngọc Long, Nguyễn Quang Vinh,
Nguyễn Văn Giang, Đinh Quang Huy đã động viên và giúp đỡ tôi trong việc phân tích
mẫu cũng như hoàn thành khóa luận.
Và tất cả người thân, bạn bè đã luôn bên tôi, cổ vũ, động viên tinh thần để tôi có
nghị lực học, vượt qua mọi khó khăn trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận.
Xin chân thành cảm ơn!
Nha Trang, ngày 15 tháng 03 năm 2011
Học viên: Nguyễn Thị Thu Thủyii

MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn i
Mục lục ii
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt v
Danh mục các bảng vi
Danh mục các hình vii

2.2.4.1. Phương pháp tách chiết DNA của RLB 29
2.2.4.2. Thực hiện phản ứng PCR 30
2.2.5. Phương pháp PCR nhân đoạn gen 16S rRNA 32
2.2.6. Phương pháp làm sạch sản phẩm PCR 33
2.2.7. Phương pháp tách dòng và xác định trình tự gen 16S rRNA của RLB 34
2.2.7.1. Tách dòng gen 16S rRNA trong vector pCR TOPO 2.1 34
2.2.7.2. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào E.coli DH5α bằng phương pháp sốc
nhiệt 35
2.2.7.3. Tách plasmid DNA bằng Qiagen Miniprep Kit 35
2.2.7.4. Cắt kiểm tra DNA plasmid bằng EcoRI 36
2.2.7.5. Giải trình trình tự đoạn gen 16S rRNA 37
2.2.8. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 37
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39
3.1. Kết quả thu mẫu 39
3.1.1. Mẫu tôm hùm bông 39
3.1.2. Mẫu thức ăn 41
3.1.3. Mẫu sinh vật bám xung quanh lồng nuôi tôm hùm 45
3.2. Đặc điểm hình thái và trình tự gen 16S rRNA của chủng RLB trên tôm hùm
bông ở Việt Nam 46
3.2.1. Đặc điểm hình thái của chủng RLB trên tôm hùm bông ở Việt Nam 46
3.2.2. Trình tự gen 16S rRNA của chủng RLB trên tôm hùm bông ở Việt Nam 48
3.2.2.1. Tách chiết DNA tổng số 48
3.2.2.2. Kết quả nhân đoạn gen 16S rRNA của RLB bằng phương pháp PCR .48
3.2.2.3. Tinh sạch sản phẩm PCR chủng RLB1 và RLB2 49
3.2.2.4. Tách dòng gen 16S rRNA trong vector pCR TOPO 2.1 50
3.2.2.5. Xác định trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng RLB1 52
3.3. Kết quả khảo sát sự phân bố của RLB trên tôm hùm bông và một số loại thức
ăn nuôi tôm bằng phương pháp PCR 53
3.3.1. Kết quả khảo sát sự phân bố của RLB trên tôm hùm bông 53


SV : Sinh vật
TA : Thức ăn
TEM : Transmision electron microscopy
TH : Tôm hùm
X-gal : 5-bromo-4-chloro-3-indodyl- β galactosidase vi

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Phân tích các thành phần hóa học của tế bào theo hệ thống hóa học 24
Bảng 1.2: Các thành phần chính trong vectơ pCR TOPO 2.1 25
Bảng 2.1: Thành phần phản ứng PCR 31
Bảng 2.2: Chu trình phản ứng PCR 31
Bảng 2.3: Thành phần phản ứng PCR nhân đoạn gen 16S rRNA của RLB 33
Bảng 2.4: Chu trình phản ứng PCR nhân đoạn gen 16S rRNA của RLB 33
Bảng 2.5: Thành phần phản ứng tách dòng gen 16S rRNA bằng vector pCR TOPO 2.1 35
Bảng 3.6: Hỗn hợp phản ứng cắt EcoRI 36
Bảng 3.1: Danh sách mẫu tôm hùm bông thu theo thời gian và địa điểm nghiên cứu.39
Bảng 3.2: Số lượng mẫu thức ăn đã phân tích 43
Bảng 3.3: Số lượng mẫu sinh vật bám xung quanh lồng nuôi tôm hùm 45
Bảng 3.4: Mức độ tương đồng đoạn gen mã hóa 16S rRNA của chủng RLB1 với
một số chủng vi khuẩn khác 53
Bảng 3.5: Kết quả PCR phát hiện RLB trên tôm hùm bông 55

Hình 3.5: Kết quả nuôi cấy của dịch L-15 trên môi trường MA, BHI và TCBS sau 48 giờ 46
Hình 3.6: Ảnh RLB nhuộm Gram và quan sát KHV vật kính dầu 1000x 47
Hình 3.7: Hình kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) của RLB (A) và hình chụp
RLB trên kính hiển vi điện tử quét (SEM) (B) 47
Hình 3.8: Ảnh quá trình sinh sản của RLB chụp kính hiển vi điện tử quét (SEM) 47
Hình 3.9: Điện di đồ DNA mẫu RLB1 và RLB2. M: thang chuẩn; giếng 1, 2: DNA
của RLB1, RLB2 48
Hình 3.10: Điện di đồ sản phẩm PCR đoạn gen 16s rRNA của RLB1 và RLB2 49
Hình 3.11: Điện di đồ sản phẩm tinh sạch của phản ứng PCR chủng RLB1 và
RLB2. 49
Hình 3.12: Màu sắc khuẩn lạc sau khi biến nạp 50 viii

Hình 3.13: Điện di đồ kiểm tra sản phẩm cắt Enzyme giới hạn EcoRI của các DNA
plasmid 51
Hình 3.14: Điện di đồ DNA tổng số hemolymph của một số mẫu tôm hùm 53
Hình 3.15: Hình điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen 16S rRNA của
RLB trên hemolymph của 30 mẫu tôm hùm bông. 54
Hình 3.16: Kết quả điện di sản phẩm PCR trên agarose 1,5% 56
Hình 3.17: Phổ điện di DNA tổng số của các mẫu thức ăn tôm hùm. 57
Hình 3.18: Kết quả điện di sản phẩm PCR của thức ăn nuôi tôm hùm bông 58 1
MỞ ĐẦU
Tôm hùm bông (Panulirus ornatus Fabricius, 1798) là một trong những loài hải
đặc sản có giá trị kinh tế của Việt Nam, đặc biệt là các tỉnh miền Trung. Từ năm 1992,
nghề nuôi tôm hùm lồng thương phẩm đã góp phần làm thay da đổi thịt cho các vùng

gây bệnh sữa ở tôm hùm nuôi tại các tỉnh miền Trung là một loại vi khuẩn gram (-),
cong nhiều, kích thước 1,5 – 2,5 µm, ký sinh nội bào bắt buộc giống với Rickettsia
(Rickettsia-like Bacteria - RLB) [2]. RLB là vi sinh vật ký sinh nội bào bắt buộc, ký
sinh và nhân lên bên trong nguyên sinh chất của tế bào ký chủ. Hiện vẫn chưa nuôi cấy
được RLB trên các loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn nhân tạo thông thường nên việc
phát hiện chúng gặp nhiều khó khăn. Các loại thức ăn tươi sống nuôi tôm như cá,
nhuyễn thể và giáp xác bị nghi ngờ là các vật chủ mang mầm bệnh.
Xuất phát từ thực tế trên, bằng việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử,
chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu một vài đặc điểm sinh học của Rickettsia-like
Bacteria (RLB) ở tôm hùm bông (Panulirus ornatus Fabricius, 1798)”. Mục tiêu của
đề tài là nhằm xác định đặc điểm hình thái, kích thước của chủng RLB ở tôm hùm
bông và biết được sự phân bố của chúng trong thức ăn nuôi tôm. Nghiên cứu góp phần
làm rõ hơn về tác nhân gây bệnh sữa, vật mang bệnh và đường truyền lan của bệnh sữa
ở tôm hùm. Đây là việc làm mới có ý nghĩa khoa học và thực tế cần được triển khai
nghiên cứu.
Đề tài được thực hiện với các nội dung chính sau:
 Nghiên cứu đặc điểm hình thái và trình tự gen 16S rRNA của chủng RLB trên
tôm hùm bông nuôi ở Việt Nam.
 Điều tra sự phân bố của RLB trên tôm hùm bông nuôi ở Việt Nam và một số
loại thức ăn nuôi tôm.
3
4
(Callionymus lyra) ở vịnh Cardigan, Wales vào năm 1986. RLO được tìm thấy trong
mô của cá đàn lia trong nghiên cứu mô về bệnh do ký sinh trùng máu gây ra trên loài
cá này [26].
RLO được nghiên cứu nhiều từ năm 1989. Trong năm này, khoảng 1,5 triệu con
cá hồi bạc (Oncorhynchus kisutch) có khối lượng từ 200 g đến 2 kg ở Chile chết không
rõ nguyên nhân. Dịch bệnh này đã làm thất thoát hơn 10 triệu USD của người nuôi cá
hồi công nghiệp ở Chile [23]. Tỷ lệ hao hụt do bệnh này gây ra từ 60% cho đến 90%.
Bệnh thường xuất hiện ở cá hồi bạc (O. kisutch), cá hồi vân (O. mykiss) và cá hồi
Atlantic (Salmo salar) [31]. Do vậy, ban đầu bệnh do RLO gây ra được đặt tên là SRS
(Salmonid Rickettsial Septicaemia) [24].
Sau khi dịch bệnh bùng nổ, các nghiên cứu sâu hơn được tập trung nghiên cứu
như phân lập và xác định tác nhân gây bệnh, phát triển kỹ thuật chẩn đoán, kiểm tra
đáp ứng miễn dịch của cá và thử nghiệm với các loại kháng sinh trị bệnh [23].
Trong nghiên cứu về bệnh trên cá hồi bạc nuôi ở vùng biển Chile, RLO được
phân lập bằng cách sử dụng dòng tế bào cá để nuôi cấy. Cũng trong nghiên cứu này,
RLO đã được cảm nhiễm vào cá hồng bạc và được tái phân lập và định danh. Từ đó,
loài Piscirickettsia salmonis thuộc bộ Rickettsiales, họ Rickettsiaceae được xem là tác
nhân gây bệnh trên cá hồi ở Chile [31].
Sau khi phân lập RLO trên cá hồi bạc nuôi ở Chile, bệnh truyền nhiễm do
Rickettsia cũng được phát hiện trên cá hồi Atlantic nuôi ở vùng biển Colombia Anh
vào năm 1991. Dấu hiệu bệnh tích của bệnh trên cá hồi Atlantic rất giống với dấu hiệu
của bệnh trên cá hồi bạc ở Chile gây ra bởi RLO [15]. Bệnh cũng đã được báo cáo trên
cá hồi pink (Oncorhynchus gorbuscha) nuôi ở vùng biển Colombia Anh vào những
năm 1970, cá hồi Atlantic nuôi ở Phần Lan, Ireland và Scotland.
Đến năm 1994, RLO đã được tìm thấy trên tất cả các loài cá hồi nước mặn. Tuy
nhiên, tác nhân này đã được phát hiện trên cả các loài cá nước ngọt. Chern và Chao
(1994) đã báo cáo về bệnh do Rickettsia gây ra trên cá rô phi nuôi ở ao nuôi nước mặn

lồng nuôi. Khi bị bệnh cá có dấu hiệu bơi lội bất thường, tỷ lệ chết có thể lên đến 80%
trong những tháng mùa lạnh. Các thể vùi của RLO trong nguyên sinh chất của tế bào
ký chủ ở những vết thương tổn giống với loài P. salmonis [9].
Năm 2000, dịch bệnh bùng phát và gây chết cho cá vược giống (Atractoscion
nobilis) ở miền Nam California nước Mỹ với tác nhân là những vi sinh vật có nhiều
điểm tương đồng với loài P. salmonis. Mặc dù vi khuẩn phân lập được gây chết trên
80% cá hồi bạc trong vòng 10 ngày thí nghiệm nhưng lại phản ứng yếu với huyết
thanh kháng P. salmonis đa dòng [18].
Mauel và Miller (2002) đã báo cáo về sự hiện diện của vi sinh vật giống với P.
salmonis trong mẫu mô của cá rô phi bị bệnh tương tự bệnh Piscirickettsiosis. Chen và 6
cộng sự (2000) đã phát hiện thấy vi sinh vật giống với P. salmonis trên loài cá mú
Epinephelus melanostigma nuôi ở Đài Loan. Dấu hiệu bệnh tích và đặc điểm mô học
của bệnh giống với bệnh Piscirickettsiosis ở cá hồi và cá rô phi. Các loài này có hình
dạng, kích thước giống với P. salmonis và phản ứng với kháng thể đa dòng kháng P.
salmonis [18].
Mauel và cộng sự (2003) đã thông báo về dịch bệnh gây tỷ lệ chết cao trên hai
loài cá rô phi (Oreochromis mossambicus và Sarotherodon melanotheron) ở Oahu,
Hawaii, USA vào năm 1994. Tác giả không cho rằng P. salmonis là tác nhân gây bệnh
này mà ông khẳng định tác nhân gây bệnh chỉ là những vi sinh vật giống với P.
salmonis (Piscirickettsia-like organism - PLO). PLO không phản ứng với các kháng
thể P. salmonis đặc hiệu với phản ứng kháng thể huỳnh quang gián tiếp IFAT (Indirect
fluorescent antibody test) và không tạo ra sản phẩm khuếch đại với phản ứng PCR P.
salmonis đặc hiệu. Tuy vậy, PLO có nhiều điểm giống với P. salmonis như ký sinh nội
bào bắt buộc, dạng coccoit, sống tự do bên trong nguyên sinh chất và trong thể thực
bào sinh tan (phagolysosome). Cả PLO và P. salmonis đều có vách tế bào đôi nhưng
PLO có kích thước nhỏ hơn P. salmonis. Triệu chứng bệnh gây ra bởi hai loài này
giống nhau mặc dù PLO không gây ra các lỗ thương tổn trên gan cá bệnh như P.

nước Calligus spp., động vật chân đều và thân mềm là những đối tượng bị nghi là vật
chủ trung gian dẫn truyền bệnh. Trong môi trường nước mặn, P. salmonis có thể sống
sót trong vòng 14 ngày ở nhiệt độ 14
0
C, điều này cho phép P. salmonis lan truyền
trong nước mà không cần vật chủ trung gian. Tuy vậy, P. salmonis bị bất hoạt nhanh
trong môi trường nước ngọt nên con đường truyền lan của chúng bị giới hạn và điều
này cũng giải thích vì sao bệnh ít xảy ra ở nước ngọt [29].
Cvitanich và cộng sự (1991) đã thông báo về sự lan truyền bệnh theo trục ngang
giữa cá hồi bạc bị nhiễm và không nhiễm RLO nuôi trong bể nước ngọt và nước mặn ở
nhiệt độ nước 15
0
C [24]. Trong khi đó, Garcés và cộng sự (1991) không phát hiện thấy
bất kỳ sự truyền lan bệnh nào giữa những con cá hồi bạc có và không bị nhiễm bệnh
nuôi trong cùng một bể ở nhiệt độ nước 8
0
C [33]. Chern và Chao (1994) lại chứng
minh có sự lan truyền bệnh trực tiếp giữa những con cá rô phi bị nhiễm RLO và cá
khỏe mạnh bằng thí nghiệm nuôi chung chúng với nhau trong cùng một bể [19]. Mặc
dù sự lan truyền bệnh theo trục ngang chưa được chứng thực trong điều kiện nuôi
nhưng những dấu hiệu bệnh lý thể hiện trong ruột và các vết thương tổn trên mang của
những con cá bệnh cho thấy có đường dẫn truyền RLO vào cơ thể hoặc RLO phát tán
từ cá bệnh thông qua phân [52, 19].
Almendras và cộng sự (1997) đã thử nghiệm các con đường truyền bệnh bằng
cách tiêm P. salmonis vào xoang bụng, miệng và mang cá hồi Atlantic. Kết quả nghiên
cứu cho thấy P. salmonis có thể xâm nhập vào cá qua mang, da và đường miệng [6]. 8
Cvitanich và cộng sự (1991) đã phát hiện sự tồn tại của RLO trong dịch buồng trứng


9
bào biểu mô của ống tiêu hóa. Ở những cá thể bị bệnh nặng thường xuất hiện các thể
vùi trong các tế bào biểu mô của thận. Năm 1983, trong một nghiên cứu khác
Morrison và Shum cho rằng CLO là RLO vì nhóm vi sinh vật này không phát triển qua
các giai đoạn đặc trưng như Chlamydia [50].
Gulka và cộng sự (1983) đã thông báo về hiện tượng chết hàng loạt của loài
điệp biển Placopecten magellanicus ở vịnh Narragansett, đảo Rhode. Dấu hiệu của
bệnh là màng áo thụt vào và sẫm màu, cơ khép vỏ mềm nhũn, vỏ thường không bị
thương tổn. Bệnh xảy ra ở các giai đoạn khác nhau của điệp. Kết quả kiểm tra mô bệnh
học cho thấy có sự thoái hóa cơ khép vỏ và tồn tại các thể vùi ưa kiềm bên trong tế bào
biểu bì của mang và mặt ngoài của những cơ quan khác. Khi bị bệnh nặng, mô thường
mất cấu trúc bình thường, đặc biệt là mang. Nghiên cứu về cấu trúc cho thấy các tế bào
vi sinh vật không nhân ký sinh trên điệp có vách tế bào mỏng, kích thước 0,5 µm x 1,9
– 2,9 µm, được đặt tên là RLO. Có sự tương quan giữa mức độ nhiễm bệnh với sự
thoái hóa của cơ khép vỏ nên bệnh còn được gọi với một tên gọi khác là “bệnh xám cơ
khép vỏ” (“gray muscle disease”) [50].
Gulka và Chang (1984) đã bố thí nghiệm cảm nhiễm bằng cách chuyển điệp
Placopecten magellanicus khỏe mạnh vào nuôi tại các lồng ở vịnh Narragansett, đảo
Rhode. Trong vòng 2,5 – 3,5 tháng, có tới 53% số điệp chuyển đến bị nhiễm bệnh và
tỷ lệ nhiễm bệnh lên đến 100% sau 5 tháng nuôi. Tỷ lệ chết của điệp nuôi ở các lồng
cao hơn điệp nuôi trong phòng thí nghiệm. Thí nghiệm tiêm dịch mang điệp bệnh vào
điệp khỏe cho thấy điệp khỏe bị nhiễm bệnh trong vòng 20 – 25 ngày. Các thí nghiệm
cảm nhiễm tương tự lên vẹm xanh Mytilus edulis và loài ngao Mya arenaria đã không
thành công. Các kỹ thuật nuôi cấy cũng không đem lại kết quả [50].
Sự nhiễm RLO trên mang cũng được tìm thấy trên loài điệp P. magellanicus và
điệp Argopecten irradians bởi Leibovitz và cộng sự (1984). Nghiên cứu kết luận điệp
ở giai đoạn ấu trùng và điệp giống không bị ảnh hưởng bởi bệnh này. Tác nhân gây
bệnh được cho là nhóm vi sinh vật có hình thái giống với các vi sinh vật được tìm thấy
trên điệp P. magellanicus ở đảo Rhode và các vi sinh vật được tìm thấy bởi Comps

ứng dụng kỹ thuật thu sinh khối RLO của Le Gall và Mialhe (1992) và qui trình tách
chiết DNA của loài Rickettsia Coxiella burnnetti trên động vật có xương sống (Samuel
và cộng sự, 1983, Vodkin và cộng sự, 1986), sau đó thực hiện phản ứng PCR để phát
hiện RLO.
RLO liên quan tới dịch bệnh vào tháng 4/1995 của loài trai ngọc Pinctada
maxima ở giai đoạn Umbo và hậu Umbo nuôi ở thành phố Sanya, tỉnh Hainan, Trung
Quốc. Tỷ lệ nhiễm RLO tỷ lệ thuận với tỷ lệ chết của ấu trùng loài trai này. Kết quả
quan sát dưới kính hiển vi điện tử (TEM) cho thấy RLO không xuất hiện trong noãn
bào, tế bào trứng đã thụ tinh và pha đầu (6h). Thể vùi của RLO bắt đầu xuất hiện ở ấu
trùng hình chữ D (ấu trùng Veliger) (24h) mặc dù ấu trùng giai đoạn này vẫn chưa sử 11

dụng thức ăn ngoài. RLO chưa gây chết ấu trùng ở giai đoạn ấu trùng chữ D mà ấu
trùng bắt đầu chết sau khi trứng được thụ tinh được 7 ngày với tỷ lệ chết là 21,8%.
Điều này cho thấy rằng RLO có thời kỳ ủ bệnh (từ giai đoạn ấu trùng chữ D) rồi mới
bắt đầu tấn công vật chủ và gây bệnh [54].
Bệnh do RLO gây ra cũng xuất hiện trên loài hàu Crassostrea ariakensis 2 - 3
năm tuổi nuôi ở vịnh Hailing, Yangxi County, tỉnh Guangdong, Trung Quốc từ tháng 2
đến tháng 5 và tháng 11,12 vào năm 2001, 2002, 2003. Kết quả phân tích cho thấy,
hàu ở giai đoạn này nhiễm nặng một loại vi sinh vật ký sinh nội bào bắt buộc được đặt
tên là RLO. Bằng phương pháp nhuộm mô và quan sát dưới kính hiển vi quang học đã
phát hiện thấy RLO nhiễm khoảng 87% (26/30) số lượng hàu thu thập. RLO được tìm
thấy ở lớp tế bào biểu bì và mô liên kết của mang, màng áo và ống tiêu hóa của hàu bị
nhiễm bệnh. Hình dạng, kích thước, màu sắc của RLO ở các mô khác nhau thì khác
nhau. RLO thường có dạng hình tròn, hình quả tạ (khi đang tiến hành phân cắt) hoặc
hình que. Kích thước khoảng 0,58 – 1,2 µm. RLO có cấu tạo tế bào gần với tế bào vi
khuẩn, màng tế bào gồm 3 lớp. RLO ký sinh bên trong các không bào nằm trong
nguyên sinh chất của tế bào ký chủ [36].

quản (PE) của loài bào ngư đỏ. Hình (b): Ảnh với độ phóng đại cao của một thể vùi của RLO
X. californiensis. Hình (c): Sự biến dạng của tuyến tiêu hóa của bào ngư đỏ; một ống tiêu hóa
nhỏ vẫn còn tồn tại (DGT); mũi tên chỉ các thể vùi của RLO; H: hồng cầu; nhuộm: H & E.
1.1.3. Tình hình nghiên cứu RLO trên giáp xác
Bệnh do các sinh vật giống Rickettsia (RLO) đã gây ra một số thiệt hại cho các
loài giáp xác có giá trị kinh tế như cua và tôm.
 RLO trên cua
Nghiên cứu đầu tiên về RLO trên cua biển là nghiên cứu của Bonami và
Rapparado (1980). Theo kết quả nghiên cứu, RLO nằm trong nguyên sinh chất của các
tế bào mô liên kết của gan tụy, ruột, mang và tuyến sinh dục của loài cua biển
Carcinus mediterraneus. Chúng là vi sinh vật gram (-), hình que, kích thước tế bào 13

0,7 µm x 2 µm, không có khả năng di động và không nuôi cấy được trên môi trường
nuôi cấy vi khuẩn thông thường. Hình chụp kính hiển vi điện tử cho thấy RLO có thể
nhân lên trong các không bào trong nguyên sinh chất của tế bào ký chủ (Hình 1.3) [10].

Hình 1.3: Các khuẩn lạc của RLO bên trong tế bào mô liên kết của loài cua biển
C. mediterraneus (v: màng của không bào, n: nhân, r: giai đoạn sinh dưỡng của RLO).
Fiona Eddy và cộng sự (2007), lần đầu tiên thông báo về một bệnh lạ, mới bùng
phát ở loài cua châu Âu (Carcinus maenas) có tên gọi là bệnh sữa (milky disease).
Dấu hiệu bên ngoài của cua bệnh là máu chảy ra có màu trắng đục như sữa và không
đông; cua bị bệnh nặng thường bỏ ăn, lỏng khớp, các phần phụ và thân chuyển hồng.
Dấu hiệu bên trong gồm cơ nhão và trắng đục do hoại tử, khi nấu chín có dịch trắng
đục như sữa, vị đắng; mang có thể chuyển màu trắng [28].
Bệnh khá phổ biến vào các tháng mùa hè khi nhiệt độ nước nuôi cua dao động
từ 19 - 26
0

(mũi tên), thước 200 nm. Hình (E): Ảnh với độ phóng đại thấp chỉ vùng được vây
quanh bởi màng (mũi tên) gần các vi khuẩn và các vết tích của thực bào cố định với vi
khuẩn (R), thước 2 mm. Hình (F): Ảnh có độ phóng đại cao chỉ sự vận động của vi
khuẩn xuyên qua khe hở của màng tế bào (BM) xung quanh các thực bào cố định bị
nhiễm bệnh, thước 200 nm [28].
 RLO trên tôm
RLO đã được thông báo trên loài tôm nước ngọt Cherax quadricarinatus và
được mô tả bởi Ketterer và cộng sự (1992), Owens và cộng sự (1992). Bệnh do RLO
gây ra cũng xuất hiện trên tôm C. quadricarinatus nuôi ở Queensland, Australia. Theo
Edgerton và Prior (1999), RLO trên loài tôm này là vi sinh vật ưa kiềm, gram (-), hình
que, có chiều dài 0,2 – 0,4 µm; các khuẩn lạc của RLO tồn tại trong không bào của các
tế bào ở lớp biểu mô của ống gan tụy [27].
Ở tôm biển, RLO được tìm thấy trên tôm he hoang dã ở Hawaii, tôm nuôi ở
Mexico và ở các nước Đông Nam Á. Các loài thuộc họ tôm he thường dễ bị nhiễm
15

RLO là: các loài tôm hoang dã như Penaeus marginatus, P. stylirostris, P. merguiensis
và tôm nuôi gồm tôm thẻ chân trắng (P. vannamei), tôm sú (P. monodon). Các triệu
chứng của tôm nhiễm RLO trên cơ quan gan tụy: nhẹ không có dấu hiệu bệnh lý rõ
ràng; nặng tôm sẽ hôn mê, bỏ ăn kèm theo dấu hiệu teo và mất sắc tố của gan tụy, gan
tụy mềm, trung tâm gan chứa đầy nước.
RLO nhiễm trên các loài tôm he với kích cỡ 0,2 - 0,7 µm x 0,8 - 1,6 µm. Các
loài này chưa phân lập và nuôi cấy được trên môi trường nhân tạo cũng như chưa được
mô tả và định danh một cách chính thức. Chúng được xếp vào bộ Rickettsiales, họ
Rickettsiaceae. Chẩn đoán RLO bằng cách nhuộm H & E hoặc nhuộm gram rồi quan
sát dưới kính hiển vi quang học (độ phóng đại 400x) có thể phát hiện thấy sự tồn tại
của RLO như những hạt lớn nằm trong các không bào trong nguyên sinh chất của tế

Như vậy, một số loài của cả ba nhóm động vật thủy sản gồm cá, nhuyễn thể và
giáp xác đều có khả năng bị nhiễm RLB và đây cũng là một trong các bệnh nghiêm
trọng, gây tỷ lệ chết cao cho các đối tượng này. Điều này cho thấy, các loại thức ăn
tươi sống sử dụng trong nuôi tôm hùm như tôm, cá tạp và động vật thân mềm có thể là
một trong những mối nguy mang mầm bệnh.
Bên cạnh đó, theo các nghiên cứu trên, RLB thường khu trú nhiều ở các cơ
quan như gan, tụy của cá; mang, màng áo và tuyến tiêu hóa của nhuyễn thể; mang, cơ
quan gan tụy của giáp xác. Do vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành lấy mẫu
của các cơ quan này nhằm phát hiện RLB ở xác xuất cao hơn.
1.2. Tình hình nghiên cứu Rickettsia trên động vật thủy sản ở Việt Nam
Nghiên cứu đầu tiên về bệnh do vi khuẩn giống Rickettsia (RLB) gây ra trên
động vật thủy sản ở Việt Nam là trên tôm hùm (Panulirus spp.). Một dịch bệnh lần đầu
tiên xuất hiện trên tôm hùm nuôi ở Việt Nam vào cuối năm 2006, đầu năm 2007 đã
gây thiệt hại gần 200 tỷ đồng cho người nuôi tôm hùm ở hai tỉnh Khánh Hòa và Phú Yên.
Dấu hiệu chính của bệnh là các đốt bụng chuyển sang màu trắng đục, dịch tiết
của cơ thể bao gồm cả máu có màu trắng như sữa hoặc hơi hồng, mô cơ đục và nhão,
gan tụy có màu nhợt nhạt, có thể bị hoại tử. Bệnh lan rộng, đến tháng 8 – 9/2008 bệnh
đã trở thành dịch, lan ra khắp các lồng nuôi thuộc 5 tỉnh miền Trung Việt Nam gồm:
Bình Định, Phú Yên, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận. 17

Đỗ Thị Hòa, Nguyễn Hữu Dũng và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu để truy
tìm tác nhân gây bệnh. Kết quả nghiên cứu cho thấy tác nhân gây bệnh sữa trên tôm
hùm là một loại vi khuẩn hình cong, kích thước 1,5 – 2,5 µm, bắt màu gram (-), lớp vỏ
ngoài màu trắng bạc, không có tiên mao, không có lông (Hình 1.6) [2].