BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
ĐẶNG THỊ SÁU NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG GEL ALGINATE
LÀM GIÁ THỂ THAY CHO AGAR-AGAR TRONG
NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT
LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành : Công nghệ sau thu hoạch
Mã số : 60.54.10
Người hướng dẫn khoa học : PGS-TS Ngô Đăng Nghĩa
Đặng Thị Sáu
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 1
DANH MỤC CÁC BẢNG 2
DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ 2
DANH MỤC CÁC HÌNH 4
MỞ ĐẦU 5
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 6
1.1. TỔNG QUAN VỀ RONG NÂU VÀ ALGINATE 6
1.1.1. Tổng quan về rong nâu 6
1.1.1.1. Một số thành phần hóa học cơ bản của rong nâu 7
1.1.1.2. Nguồn lợi rong mơ ở Việt Nam 8
1.1.2. Tổng quan về alginate 9
1.1.2.1. Cấu trúc alginate 9
1.1.2.2. Một số tính chất quan trọng của alginate 12
1.1.2.3. Tách chiết alginate 17
1.2. TỔNG QUAN VỀ NUÔI CẤY MÔ 20
1.2.1. Lịch sử nuôi cấy mô 20
1.2.2. Các điều kiện nuôi cấy mô 21
1.2.2.1. Điều kiện vật lý 21
1.2.2.2. Môi trường nuôi cấy mô thực vật 22
1.2.3. Kỹ thuật vi nhân giống 25
1.3. TỔNG QUAN VỀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC
27
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nước 27
1.3.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước 27
1.4. TỔNG QUAN VỀ CÂY DÂU TÂY 29
giá thể agar 44
2.2.2.5. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ alginate trong môi trường
đến khả năng ra rễ của cây dâu tây in vitro 44
2.2.2.6. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ CaCO
3
trong môi trường
đến khả năng ra rễ của cây dâu tây in vitro 46
2.2.2.7. So sánh khả năng ra rễ của cây dâu tây trên giá thể alginate
và giá thể agar 46
2.2.3. Phương pháp lấy các chỉ tiêu và xử lý số liệu 47
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 49
3.1. Kết quả nghiên cứu về tính chất ban đầu của alginate 49
3.2. Kết quả nghiên cứu về đặc tính lý hóa của hệ gel alginate 49
3.2.2. Kết quả xác định pH của hệ gel alginate 49
3.2.3. Kết quả xác định độ bền hệ gel alginate 51
3.3. Kết quả các nghiên cứu về nuôi cấy mô dâu tây trên hệ gel alginate 53
3.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ alginate đến công đoạn
nhân chồi dâu tây 53
3.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ CaCO
3
trong môi trường
đến tốc độ nhân chồi 56
3.3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ 6-benzylamino purine
(BA) đến tốc độ nhân chồi 60
3.3.4. Kết quả so sánh nhân chồi trên giá thể alginate và giá thể agar 64
3.3.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ alginate trong môi trường
đến khả năng ra rễ của cây dâu tây in vitro 67
3.3.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ CaCO
3
trong môi trường
2
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng
Tên bảng Trang
1.1 Tỷ lệ M/G của một số loại rong nâu trên thế giới 12
1.2 Sự biến thiên độ nhớt (tính bằng mPa.s) theo nồng độ của dung
dịch alginate natri ở 20
0
C
14
2.1 Bảng phân tích phương sai 48
3.1 Một số thành phần của alginate và agar nghiên cứu 49
DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ
Đồ thị Tên đồ thị Trang
3.1 Biến đổi pH của hệ gel alginate theo nồng độ GDL và CaCO
3
50
3.5b Chiều cao chồi tạo thành trên giá thể alginate với nồng độ
BA khác nhau.
61
3.5c Trọng lượng cụm chồi tạo thành trên giá thể alginate với
nồng độ BA khác nhau.
62
3
3.6a Kết quả nhân chồi trên giá thể alginate và giá thể agar 65
3.6b So sánh khả năng nhân chồi dâu tây trên giá thể alginate và
agar sau 30 ngày nuôi cấy
66
3.7a Số rễ dâu tây trên giá thể alginate với các nồng độ alginate 68
3.7b Chiều dài rễ trên giá thể alginate với các nồng độ khác nhau 68
3.8a Số lượng rễ trên giá thể alginate với các nồng độ CaCO
3
khác
nhau sau 30 ngày nuôi cấy
70
3.8b Chiều dài rễ trên giá thể alginate với các nồng độ CaCO
3
khác nhau sau 30 ngày nuôi cấy
71
3.9a Kết quả tái sinh rễ trên giá thể alginate và giá thể agar 73
3.9b So sánh khả năng ra rễ của cây dâu tây trên giá thể alginate
và giá thể agar.
75
10
1.3 Mô hình block GGG; MMM và GMGMGM 11
1.4 Sự tạo gel của alginate theo mô hình vĩ trứng 16
1.5 Sơ đồ quy trình chung để sản xuất alginate 19
1.6 Các giai đoạn của quá trình vi nhân giống 26
2.1 Quy trình sản xuất alginate từ rong mơ S. mcclurei. 33-34
2.2 Công thức cấu tạo của GDL và gluconic acid 34
3.1 Hình mô phỏng tạo gel alginate khi có mặt của tác nhân GDL
và CaCO
3
51
3.2
Chồi dâu tây trên giá thể alginate ở các nồng độ khác nhau sau
30 ngày nuôi cấy
55
3.3 Chồi dâu tây trên giá thể alginate với các nồng độ CaCO
3
khác
nhau sau 30 ngày nuôi cấy
58
3.4
Chồi dâu tây trên giá thể alginate với các nồng độ BA khác
nhau sau 30 ngày nuôi cấy.
63
3.5 Chồi trên giá thể alginate và giá thể agar sau 30 ngày nuôi cấy 64
3.6 Rễ cây dâu tây sau 30 ngày nuôi cấy trên giá thể alginate với
các nồng độ khác nhau.
69
dụng gel alginate làm giá thể thay cho agar-agar trong nuôi cấy mô thực vật”
do PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa hướng dẫn.
Mục đích của đề tài:
- Xác định được các thông số để tạo ra hệ gel alginate đồng thể có độ ổn
định cao, có pH phù hợp trong ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô thực vật.
- Thử nghiệm nuôi cấy mô thực vật trên giá thể gel alginate và so sánh hiệu
quả với gel agar chuẩn.
Khả năng áp dụng của đề tài: kết quả nghiên cứu thành công của đề tài góp
phần làm tăng phạm vi ứng dụng của alginate sản xuất từ rong Sargassum ở Việt
Nam trong lĩnh vực nuôi cấy mô thực vật.
6
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ RONG NÂU VÀ ALGINATE
1.1.1. Tổng quan về rong nâu.
Rong nâu tên gọi chung các loài rong thuộc ngành Phaeophyta, ngành này chỉ
có một lớp Phaeophyceae, gồm 265 chi và khoảng 1500 đến 2000 loài. [55]
Rong nâu cần có các vật bám nên nó mọc trên đá hoặc trên trên các chân đập,
cầu cảng, san hô, động vật thân mềm và ngay cả trên các loài rong khác. Rong nâu
cần có đủ ánh sáng để quang hợp nên nó chỉ mọc ở vùng nước trong và ở độ sâu
không lớn lắm sao cho ánh sáng có thể xuyên qua được.
Một số loài rong nâu quan trọng trong công nghiệp alginate.[38]
Phaeophyceae
Laminariales Fucales
Laminariacea Alariacea Lessoniaceae Fucaceae Sargassaceae
Laminaria Ecklonia Macrocystis Ascophyllum Fucus Sargassum
Các acid béo ở trong rong rất đa dạng. Aknin đã tìm ra và định danh 40 loại
acid béo, 10 loại sterol khác nhau từ 8 loài rong nâu ở vùng biển Senegal [30]
Hàm lượng protein trong rong nâu khá hoàn hảo. Hàm lượng protein trong rong
nâu ở vùng biển Nha Trang dao động từ 8,05 ÷ 21,11% so với trọng lượng rong khô.
Hàm lượng iod trong một số loài rong nâu dao động từ 0,05÷ 0,16% so với
rong khô tuyệt đối. Các tháng mùa đông hàm lượng iod trong rong cao hơn trong
các tháng mùa hè.[14]
Thành phần hóa học quan trọng nhất của rong nâu là alginate. Alginate tồn tại
chủ yếu trong vách tế bào ở dạng muối không tan. Alginate còn được tìm thấy trong
tế bào chất.
Hàm lượng alginate biến đổi theo loài rong, độ trưởng thành, vùng sinh trưởng
và vị trí trên cây rong, lớn nhất là trên thân, rồi đến lá, phần ngọn và đế
(receptacles). Hàm lượng alginate đạt cực đại lúc cây rong đạt độ phát triển lớn
8
nhất. Các loài rong mơ Việt Nam hàm lượng acid alginic dao động trong khoảng
26,41÷ 47,16%. So với các loài rong nâu trên thế giới, rong mơ Việt Nam có hàm
lượng acid alginic khá cao, đây là một nguồn nguyên liệu để sản xuất alginate có ý
nghĩa thương mại.
Thành phần khoáng trong rong nâu rất đa dạng bao gồm các nguyên tố đa
lượng như K, Na, Ca, Mg, S, P, Cl, I và các nguyên tố vi lượng như Sr, Al, B, Fe,
Zn, Cu, Mn, Mo,…Rong nâu còn có khả năng tích tụ một số nguyên tố như Sr 90,
Cs 137 là những chất liên quan đến các chất thải phóng xạ. Hàm lượng khoáng của
các loài rong nâu Nha Trang dao động từ 15,51÷ 46,30% phụ thuộc vào mùa vụ và
thời kỳ sinh trưởng.[14]
1.1.1.2. Nguồn lợi rong mơ ở Việt Nam
Họ rong mơ (Sargassaceae) tại Việt Nam thuộc bộ rong đuôi ngựa
(Fucales), ngành rong nâu (Phaeophyta). Đây là nhóm rong có kích thước cá thể
lớn, chiều dài có thể lên đến 8m, sinh lượng có nơi đạt đến 12kg rong tươi trên một
mét vuông. Hình dạng của chúng rất giống thực vật bậc cao, sinh sản hữu tính hoặc
sinh dưỡng. Rong mơ bám vào vật bám như đá, san hô, nhờ đĩa bám hay hệ thống
trở đi các nhánh chính của rong phát triển nhanh về chiều dài và đạt kích thước tối
đa vào tháng 4, giai đoạn này tương ứng với thời kỳ rong phát triển nhanh chóng
các nhánh thứ cấp. Sau khi đạt kích thước tối đa, rong sẽ dần tàn lụi vào các tháng
sau đó. Do đó để đạt được sản lượng khai thác lớn cũng như bảo tồn được rong,
rong nên được khai thác vào cuối tháng 4 đầu tháng 5 [24]
1.1.2. Tổng quan về alginate
1.1.2.1. Cấu trúc của alginate
Alginate là tên gọi chung cho các muối của acid alginic. Alginic là một
polyme mạch thẳng được cấu tạo từ 2 gốc monome là β-D-Mannuronic acid (M) và
α-L-Guluronic acid (G) liên kết với nhau bằng liên kết 1-4 glycosid. Trên phân tử
alginic số lượng M và G không theo tỷ lệ 1/1, tỷ lệ này khác nhau tùy thuộc vào
từng loại rong, vị trí địa lý, mùa vụ khai thác và vị trí trên thân rong dùng để tách
chiết alginate. Tỷ lệ M/G là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến khả năng tạo gel của alginic.
10
Theo công thức cổ điển Haworth thì cấu tạo của 2 monome chỉ khác nhau ở
nhóm cacboxyl nằm trên và dưới mặt phẳng của vòng pyranoza.[14],[62]
Hình 1.1: Cấu trúc của β-D- Mannuronic acid (M) và α- L-Guluronic
acid (G) theo cổ điển.
Theo quan niệm hiện đại, hai gốc Uronic đó có cấu tạo dạng ghế nhưng có
cấu hình khác nhau, acid Manuronic có cấu hình
4
C
1
, còn acid Guluronic có cấu
hình
1
C
OH
OHOH
OH
OH
OH
11
Block homopolymanuronic: gồm các gốc aicd manuronic liên kết với nhau
theo dạng MMMMM.
Block luân hợp: (Alternating) gồm các gốc acid guluronic và aicd manuronic
liên kết luân phiên với nhau theo dạng MGMGMGMG
G block
OH
OH
OH
OH
OH
OH
O
OO
O
O
O
0,87 nm
O
Như vậy, alginate được xem là một copolyme block. Độ dài trung bình của
mạch phân tử, độ dài của mỗi chuỗi block, tỷ lệ và trình tự kết hợp của chúng khác
nhau theo nguồn gốc của alginate. Điều này làm cho alginate có tính chất biến đổi
trong một dãi rộng.[45]
Để đặc trưng cho thành phần hóa học của alginate, trước đây người ta chỉ
dựa vào tỷ lệ mol của 2 gốc monome cấu tạo nên alginate, tức tỷ lệ M/G nhưng tỷ lệ
này chưa đủ để mô tả chi tiết sự phức tạp trong cấu tạo alginate.
Bảng 1.1 : Tỷ lệ M/G của một số loại rong nâu trên thế giới. [14]
Loài rong Tỷ lệ M/G
Macrocystis Pyrizera (Mỹ)
Lamanria Digitata (Nhật)
Eisenia Bryclis (Nhật)
Azeophyllum Nodium (Bắc Âu)
S. Polycystum
Aldrich
1,55
1,45
1,6
1,6
1,04
1,5
Để đặc trưng sâu xa hơn cho cấu trúc tinh tế của alginate người ta đưa ra các
khái niệm về tần suất các khúc đôi (diad) , khúc ba (triad)…Như vậy, alginate sẽ có
4 khúc đôi đó là MM, GG, MG, GM và 8 khúc ba đó là : MMM, MMG, GMM,
GMG, GGG, GGM, MGG, MGM. Bằng kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân,
người ta đã xác định được tần suất của các diad, triad của phân tử alginate. [21],[35]
1.1.2.2. Một số tính chất quan trọng của alginate
a. Khối lượng phân tử và độ nhớt của dung dịch alginate.
Hầu hết các loại alginate thương mại có khối lượng phân tử trung bình trên
=
w
i
M
i
/
w
i
=
N
i
M
i
2
/
N
i
M
i
Tỷ số M
w
/ M
n
được gọi là chỉ số đa phân tán PI. Đối với alginate , chỉ số PI
nằm trong khoảng từ 1,4 đến 6 tùy theo loài rong và phương pháp tách chiết. Sự
phân bố khối lượng phân tử cũng như cấu trúc phân tử có liên quan đến tính chất và
14
Bảng 1.2: Sự biến thiên độ nhớt (tính bằng mPa.s) theo nồng độ của
dung dịch alginate natri ở 20
0
C [21], [38]
Nồng độ alginate Loại alginate
1% 1,5% 2% 3% 4%
Độ nhớt rất thấp 10 20 45 130 350
Độ nhớt thấp 20 60 180 650 2200
Độ nhớt trung bình 350 1800 6000 Không đo được
Độ nhớt cao 800 4000 9000 Không đo được
Độ nhớt dung dịch alginate phụ thuộc vào nhiệt độ. Khi nhiệt độ tăng độ
nhớt giảm khoảng 2,5% cho một độ C. Khi làm nguội, độ nhớt quay về giá trị thấp
hơn ban đầu một ít. Tuy nhiên, nếu duy trì nhiệt độ 50
0
C trong nhiều giờ thì sẽ làm
alginate cắt mạch và giảm độ nhớt. Trái lại, khi hạ nhiệt độ đến khi đông đặc và rã
đông thì không làm giảm độ nhớt của alginate.
Độ nhớt của alginate khá ổn định trong khoảng pH =5-11. Khi pH thấp hơn 5
thì các ion -COO
-
bắt đầu bị proton hóa thành –COOH, do đó lực đẩy tĩnh điện giữa
các chuỗi bị giảm, chúng trở nên gần nhau hơn và tạo liên kết hidro, làm độ nhớt
tăng. Khi pH giảm sâu hơn khoảng từ 3 đến 4 sẽ tạo thành gel. Nếu alginate có
chứa một ít ion Ca
2+
thì sự tạo gel xẩy ra sớm hơn, khoảng pH 5. Nếu pH giảm
nhanh đến 2 thì kết tủa acid alginnic hình thành. Khi pH trên 11, alginate sẽ bị
0
C và chúng không tan chảy khi đun nóng. Gel của alginate có rất nhiều ứng
dụng trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau, đặc biệt là gel canxi alginate. Đã có
nhiều công trình nghiên cứu về sự tạo gel của alginate canxi nhưng mô hình được
chấp nhận rộng rãi nhất hiện nay là mô hình vĩ trứng (egg-box model) được minh
họa trên hình 1.4.
Do cấu trúc đặc biệt của đoạn mạch GGG nó tạo thành dạng nếp gấp như
một cái vĩ trứng. Khoảng không gian tạo thành giữa các vĩ khi xếp lên nhau tương
tự như chổ đặt quả trứng, điểm đặc sắc ở đây là kích thước của khoảng trống này
khá phù hợp với kích thước của ion Ca
2+
. Các ion có kích thước lớn hơn ion Ca
2+
sẽ
cho liên kết mạnh hơn còn các ion có kích thước nhỏ hơn sẽ không tạo gel theo mô
hình này. Ái lực của ion đối với alginate theo thứ tự như sau:
Pb
2+
> Cu
2+
>Cd
2+
>Ba
2+
>Sr
2+
> Ca
2+
>Co
2+.
và công nghiệp sản xuất alginate ở UK, chiếm 70% sản lượng alginate trên thế giới.
Công ty lớn tiếp theo là Protan A/S của NaUy, rồi đến các công ty của Pháp, Nhật
Bản và Trung Quốc.
Việc nghiên cứu tách chiết alginate ở nước ta được thực hiện lần đầu tiên vào
năm 1961 dùng để hồ sợi. Năm 1966, bộ môn Chế biến trường đại học Thủy sản đã
tách chiết alginate từ rong mơ vùng biển Hải Phòng và đã ứng dụng vào việc in hoa
trên vải. Quy trình sản xuất alginate natri đã được đúc kết trong Hội nghị alginate
natri tại Uỷ ban Khoa Học Kỹ thuật Nhà Nước tháng 11 năm 1981[2]
Trong báo cáo này, quy trình sản xuất với các thông số kỹ thuật cũng như
định mức tiêu hao nguyên vật liệu đã được đúc kết. Sau đó, vào năm 1982, Trần
Văn Ân trong luận án phó tiến sĩ đã đẩy việc nghiên cứu sâu hơn trong việc cải tiến
quy trình tách chiết alginate. Gần đây tác giả Ngô Đăng Nghĩa nghiên cứu tối ưu
hóa công đoạn tách chiết alginate từ rong nâu S. Kjellmanianum và S. mcclurei ở
vùng biển Hòn Chồng-Nha Trang với phương pháp acid hóa và xử lý bằng formol.
Đối với rong mơ S. mcclurei có nguồn gốc Hòn Chồng - Nha Trang thì tác giả sử
dụng chế độ nấu chiết như sau: nồng độ Na
2
CO
3
1,54-1,68 %; tỷ lệ dung dịch 20 lần
rong khô, nhiệt độ nấu chiết 55-60
0
C, thời gian nấu chiết 1,15-2,2giờ. Tác giả Trần
Thị Luyến và cộng sự cũng đã nghiên cứu tách chiết alginate cho hai loài rong
18
S. Kjellmanianum và S. mcclurei ở vùng biển Hòn Chồng- Nha Trang theo quy
trình canxi hóa. Xử lý bằng CaCl
2
0,1%, nhiệt độ 45
0
19
Rong nâu
Xử lý sơ bộ
Rửa
Nấu chiết trong kiềm
Dịch chiết alginate natri
Pha loãng
Lọc thô
Lọc tinh
Trung hòa
Sấy khô
Nghiền
Bột alginate Na
B. Quy trình acid hóa
Aicd hóa
Gel acid alginaic
Lọc kết tủa
Tách nước
Trung hòa, tẩy trắng, loại nước
(Ethanol, NaOH, NaOCl)
Sấy khô
Nghiền
Bột alginate Na
Copyright: Tài liệu đại học ©