Bộ y tế
Viện dinh dỡng

Báo cáo đề tài
áp dụng phơng pháp Elisa phát hiện độc tố
LT của các chủng Escherichia coli phân lâp
trong thực phẩm Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Dinh Dỡng

Chủ nhiệm đề tài: BS. Phạm Thị Thanh Yến
5751
05/4/2006
Hà Thị Anh Đào
Hà Nội - 2005 2

I. Đặt vấn đề:
Tiêu chảy là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong ở trẻ em
đặc biệt là ở các nớc vùng nhiệt đới, trong đó Escherichia coli (E.coli) là một
trong những nguyên nhân gây tiêu chảy cấp ở trẻ em . E.coli gây tiêu chảy
đợc chia làm 5 loại, bao gồm (1):
E.coli gây bệnh (Enteropathogenic E. coli, viết tắt là EPEC)
E.coli sinh độc tố ruột (Enterotoxigenic E. coli, viết tắt là ETEC)
E.coli xâm nhập (Enteroinvasive E.coli, viết tắt là EIEC)
E.coli gây chảy máu (Enterohemorrhage E.coli, viết tắt là EHEC)
E.coli bám dính (Enteroaggregative E.coli, viết tắt là EAggEC)
E.coli sinh độc tố ruột (ETEC) là chủng vi khuẩn sinh độc tố ruột trong
ruột non của ngời và súc vật gây ỉa chảy mất nớc giống tả. Có 2 loại độc tố
ruột: độc tố chịu nhiệt ST (Stable Toxin) bị phá hủy ở 100
0
C trong 15 phút và

đóng vai trò quan trọng trong công tác giám sát VSATTP một cách có hiệu
quả. Trong nghiên cứu này chúng tôi áp dụng kỹ thuật ELISA để xác định độc
tố LT của các chủng E.coli phân lập đợc trong thực phẩm năm, 2004 do
phơng pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao.
II. Mục tiêu đề tài
Triển khai kỹ thuật ELISA phát hiện độc tố LT của các chủng E.coli
phân lập trong thực phẩm.
III. Đối tợng, thời gian và kỹ thuật áp dụng
1. Đối tợng:
- Mẫu thực phẩm: tổng số 80 mẫu, trong đó:
+ 60 mẫu lòng lợn cha qua chế biến
+ 10 mẫu lòng lợn đã qua chế biến
+ 10 mẫu tiết canh
- Địa điểm lấy mẫu: chợ Ngọc Hà (quận Ba Đình), chợ Cầu Giấy (quận
Cầu Giấy), chợ Thanh Xuân (quận Thanh Xuân).

4
- Cách lấy mẫu: các mẫu lòng lợn ( lòng già, non) và tiết canh đợc mua
vào buổi sáng từ 10 đến 11 giờ. Mỗi mẫu lấy tối thiểu là 250g, đựng vào túi
polyetylen vô trùng, rồi đa ngay về phòng thí nghiệm để kiểm tra trong
vòng không quá 3 giờ.
2. Thời gian tiến hành đề tài:
- Phân lập các chủng E.coli từ thực phẩm: 7 27 tháng 12 năm 2004
- Triển khai kỹ thuật ELISA : 3 27 tháng 5 năm 2005
3. Kỹ thuật áp dụng:
- Kỹ thuật xác định E.coli trong thực phẩm theo TCVN5159 1990 để
phân lập các chủng E.coli.
- Kỹ thuật ELISA xác định độc tố LT của các chủng E.coli (1).
IV. Nội dung và kết quả triển khai
A. Kết quả phân lập E.coli trong thực phẩm:

( thờng gọi là cộng hợp men ).
- Khi xảy ra sự kết hợp giữa LT và KT1, thì cơ chất giúp đo đợc hoạt động
của enzym, từ đó xác định đợc số lợng KT1 gắn vào LT, qua đó xác định
đợc LT.
2. Vật liệu, hoá chất, môi trờng
- Canh thang BRILA ( Merck )
- Thạch ENDO ( Merck )
- Thạch Citrat Simmons ( Merck )
- Pastone ( Sanofi )
- Môi trờng canh thang trypticase soy (Merck)
- GM1 (Monosialoganglioside - Sigma )
- Huyết thanh thỏ kháng độc tố LT ( Sigma )

6
- Cộng hợp men: Huyết thanh dê gắn với men phophatase kiềm (Goat
Antihuman IgG - Alkaline phosphatase conjugate - Sigma)
- Cơ chất : OPD (O-Phenylenediamine dihydrochloride tablet-Sigma)
- Phosphate Buffered Saline (PBS, pH 7,4)
- BSA (Bovine Serum Albumine - Sigma Fine Chemical)
- Khay nhựa 96 giếng đáy bằng (Nunc - 439454); pi pet và đầu típ
- Máy đọc ELISA (Biorad)
- Eppendorf
- ống Falcol
- Máy lắc Voltex
- Máy ly tâm
3. Chủng thử nghiệm
- Chứng dơng: ETEC EBa-35 (Nhật Bản)
- Chứng âm:
STEC O111-19 (Nhật Bản)
- Các chủng E.coli phân lập từ các mẫu thực phẩm

7
Dung dịch mẹ 20ml
NaCl 9g
Nớc cất 1000ml
pH = 7,2
+ R2-Đệm rửa

NaCl 8,5g
Tween 20

1ml
NaN
3
0,2g
Nớc cất 1000ml
+ R3-Đệm khoá
R1 10ml
BSA 0,1g
+ R4-Đệm pha kháng thể:
R1 10ml
BSA 0,1g
Tween 20 10àl
+ R5-Đệm pha cơ chất
Tris base 1,21g
MgCl
2
30àl
Nớc cất 8ml
Chỉnh pH = 9,8 bằng HCl sau đó thêm nớc cất cho đủ 10ml
+ Dung dịch dừng phản ứng (NaOH 3M)

PC M6 M6
M14 M14
G
NC M7 M7 M15 M15
H
NC M8 M8 M16 M16

Trong đó:
PC: đối chứng dơng (Positive control)
NC: đối chứng âm (Negative control)
* Các bớc tiến hành:
- Bớc 1: Gắn bản GM
1
: 100àl/giếng, rồi để qua đêm ở nhiệt độ phòng.
- Bứơc 2: Rửa bản 3 lần với R2: 200 àl/giếng trong 3 phút.
- Bớc 3: Cho R3: 100àl/giếng, ủ 1 giờ ở 37
o
C.
- Bớc 4: Rửa bản 3 lần với R2: 200 àl/giếng trong 3 phút.
- Bớc 5: Cho dịch nổi chủng chứng dơng, chủng chứng âm và E.coli cần
kiểm tra độc tố, mỗi mẫu 2 giếng : 100àl /giếng ủ 2 giờ ở 37
0
C.
- Bớc 6:Rửa bản 3 lần với R2: 200 àl/giếng trong 3 phút.
- Bớc 7: Cho kháng thể1: 100àl/giếng ủ 1 giờ ở 37
0
C.

9
- Bớc 8: Rửa bản 3 lần với R2: 200 àl/giếng trong 3 phút

0.052 0.045 0.153 0.157
B
0.056 0.052 0.166 0.161
C
0.158 0.171 0.172 0.170
D
0.053 0.056 0.170 0.167
E
1.825
0.052 0.049 0.160 0.165
F
1.877 1.540 1.566 1.61 1.70

G
0.164 0.058 0.135 0.008 0.005
H
0.158 0.155 0.179 0.006 0.007

Nhìn vào bảng kết quả chúng tôi thấy giá trị OD trung bình của mẫu số
6 và số 14 lần lợt là 1.553 và 1.655 là tơng đối cao, gần bằng giá trị trung
bình của mẫu dơng chuẩn (1.851), cao hơn chứng âm gấp 9,6 lần (mẫu số 6)
và 10,3 lần (mẫu số 14), tức là giá trị OD của mẫu số 6 và số 14 cao hơn chứng
âm >2 lần đợc coi là dơng tính (có độc tố LT). Vậy trong tổng số 16 chủng
E.coli phân lập đợc từ các mẫu lòng lợn sống và tiết canh, thì chỉ có 2 chủng
có độc tố là mẫu số 6 và mẫu số 14.
Kết quả Elisa đợc thể hiện thông qua biểu đồ 1

11
Biểu đồ 1: Kết quả Elisa của các chủng E.coli
0

5
Số thứ tự mẫu
Giá trị ODV. Kết luận:
Qua kết quả triển khai đề tài, chúng tôi đã triển khai thành công kỹ
thuật ELISA phát hiện đọc tố LT của các chủng Escheria coli phân lập trong
thực phẩm. 12
Tài liệu tham khảo

1. Hoàng Thu Thuỷ. Phơng pháp kỹ thuật phát hiện độc tố ruột của
Escherichia coli. Kỹ thuật xétnghiệm Vi sinh vật Y học-Nhà xuất bản
văn hoá Hà nội 1991: tr: 91-94.
2. Những nghiệm pháp chuẩn đoán E. coli sinh độc tố ruột. Sổ tay xét
nghiệm về nhiễm khuẩn đờng ruột cấp tính.Tài liệu dịch từ CDD/83.3
của OMS: tr: 40-60.
3. Black,R.E.M.H. Brown, S. Becker, and M.H.Merson. Contamination of
weaning foods and transmission of Enterotoxigenic Eschirichia
diarrhoer in children in rural Bangladesh. 1982;
Trans.R.Soc.Trop.Med.Hyg. 76: 259-64.
4. Black,R.E,M.H. Merrson, B. Rowe, P. R, Taylor, and D .A Sack.
Enterotoxigenic Escherichia coli diarrhoer: acquired imnunity and
transmission in an endemic area. Bull. WHO1981; 59: 263-68.