ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN


NGUYỄN THỊ THU TRANG PHÂN LOẠI, NUÔI TRỒNG VÀ KHẢO SÁT SƠ BỘ
CÁC CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA
LOÀI VÂN CHI ĐỎ TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC
Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. NGUYỄN ĐỨC HOÀNG Tp. Hồ Chí Minh, Năm 2012

MỞ ĐẦU

Trametes là nấm có khả năng hóa sube, tai nấm khi khô trở nên cứng giòn.

MỞ ĐẦU
Chương 1-TỔNG QUAN
1.1. Vị trí của giới nấm trong hệ thống phân loại học .1
1.2. Phương pháp phân loại nấm .4
1.2.1 Phương pháp phân loại dựa trên hình thái và đặc điểm sinh lý .4
1.2.1.1. Giới thiệu chung về giới nấm .4
1.2.1.2. Ngành Basidiomycota (nấm đảm) .4
1.2.2. Phân loại học giới nấm dựa vào sinh học phân tử .7
1.2.2.1. DNA ribosome .7
1.2.2.2. DNA mã hóa cho enzyme ATPase của ti thể tiểu phần số 6 (atp6) .9
1.2.2.3. DNA mã hóa cho nhân tố kéo dài dịch mã alpha 1 (tef1) 10
1.2.2.4. Gen mã hóa cho protein RPB1 và RPB2 (rpb1, rpb2) 10
1.2.2.5. Gen mã hóa α-tubulin và β-tubulin (α-tub, β-tub) 11
1.2.2.6. Gen mã hóa cho enzyme cytochrome oxidase (cox) 11
1.3. Khái quát về nấm được nuôi trồng 12
1.3.1. Đặc điểm sinh lý nấm trồng 13
1.3.1.1. Nhu cầu dinh dưỡng của hệ sợi nấm 13
1.3.1.2. Ảnh hưởng của các yếu tố vật lý 14
1.3.2. Phương pháp nuôi trồng 15
1.3.2.1. Nguyên liệu trồng nấm 15

ii

1.3.2.2. Kỹ thuật trồng nấm 15
1.4. Nấm dược liệu và dược tính 18
1.5. Các hợp chất có hoạt tính sinh học trong nấm dược liệu 21
1.5.1. Polysaccharides 21
1.5.1.1. β- D- glucan 21
1.5.1.2. Các dị polysaccharide (Heteropolysaccharides) 21
1.5.2. Saponin 22

2.2.5.3. Phương pháp định tính và định lượng saponin 39
2.2.6. Phương pháp xử lý số liệu 42
Chương 3-KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Phân lập mẫu nấm vân chi đỏ 44
3.1.1. Hình thái mẫu nấm vân chi đỏ ngoài tự nhiên 44
3.1.2. Phân lập nấm vân chi đỏ 45
3.2. Phân loại nấm vân chi đỏ và đen 45
3.2.1. Phân loại nấm bằng hình thái 45
3.2.2. Phân loại bằng sinh học phân tử 52
3.2.2.1. Kết quả PCR 52
3.2.2.2. Kết quả giải trình tự 54
3.2.2.3. Xây dựng cây phân loại 54
3.3. Khảo sát một số đặc điểm sinh lý hai loài nấm 56
3.3.1. Khảo sát tốc độ lan tơ 56
3.3.2. Hình thái tơ nấm trên môi trường nuôi cấy lắc 58
3.4. Nuôi trồng hai loài nấm 59
3.4.1. Nuôi trồng nấm vân chi đỏ 59
3.4.1.1. Chuẩn bị giống 59
3.4.1.2. Quy trình nuôi trồng 60
3.4.2. Nuôi trồng nấm vân chi đen 62
3.4.2.1. Chuẩn bị giống 62
3.4.2.2. Quy trình nuôi trồng 63
3.5. Khảo sát các hoạt chất sinh học 64
3.5.1. Phân tích sơ bộ thành phần hóa học 64

iv

3.5.2. Định lượng β-1,3-glucan 67
3.5.3. Định tính và định lượng saponin 70
3.5.3.1. Định tính saponin 70


Tổng quan
Nguyễn Thị Thu Trang 1

1.1. Vị trí của giới nấm trong hệ thống phân loại học
Phân loại học đã có từ lâu đời, phát triển theo sự phát triển của lịch sử loài
người, nó ra đời khi con người phân biệt được các loại thực vật gây độc và có thể sử
dụng làm thực phẩm và dược liệu, cũng như sự ghi nhớ và phân loại các loài vật
nuôi. Sự phát triển của phân loại học của nấm đi sau thực vật và động vật. Trong
các hệ thống phân loại cũ từ 2 giới (kingdom) của Carl Linnaeus đến 4 giới của
Herbert F. Copeland năm 1938, nấm được coi là thuộc trong giới thực vật (Plantae),
mặc dù các đặc điểm mô tả về hình thái nấm đã được biết đến trước đó rất nhiều thế
kỉ. Khi hệ thống phân loại 5 giới của Robert Whittaker ra đời năm 1969 thì sự khác
biệt giữa nấm và các sinh vật khác đặc biệt là thực vật sau một thời gian mới được
nhận biết và phân loại một cách có hệ thống. Ông phân loại sinh vật đa bào dựa vào
khả năng dinh dưỡng: giới Animalia là sinh vật dị dưỡng, không có khả năng tự tạo
ra dinh dưỡng cho cơ thể mà phải lấy từ các nguồn khác, giới Plantae là sinh vật tự
dưỡng, thực vật sử dụng ánh sáng mặt trời tạo nguồn dinh dưỡng cho chính chúng
và nguồn thức ăn cho các loài dị dưỡng khác, còn giới Fungi là dị dưỡng, nấm tiết
các enzym ra ngoài môi trường, tiêu thụ các chất hữu cơ thông qua sợi nấm gọi là
hệ sợi, chúng không thể thiếu được trong chu trình biến đổi vật chất. Về căn bản

quan hệ gần với giới Metazoa (Animalia) hơn là giới Plantae. Do vậy, giới Fungi
nằm trong siêu giới Opisthokonts (Opisthokonta) cùng với giới Metazoa (Hình 1.2)
[21].

Hình 1.1. Hệ thống phân loại 6 giới và 3 lãnh giới [72]. Tổng quan

Sau năm 2005, các nghiên cứu về phân loại học càng đi sâu đặc điểm của
lãnh giới Eukarya, đặc biệt các bằng chứng về rDNA trên nguyên sinh động vật đã
thay đổi quan điểm về 6 siêu nhóm. Lãnh giới Eukarya được chia làm hai siêu
nhóm.
 Unikonts-Unikonta (một roi): gồm siêu giới Amoebozoa và Opisthokonts
[22, 30, 31, 32].
 Bikonts-Unikonta (hai roi): gồm siêu giới Excavata, Rhizaria,
Chromalveolata, Archaeplastida. Trong đó, ngành Heterkontophyta (Stramenopiles)
và Alveolata thuộc siêu giới Chromalveolata và siêu giới Rhizaria có quan hệ gần
gũi với nhau, được gọi là siêu giới SAR, giới Plantae nằm trong siêu giới
Archaeplastida [13].
Hình 1.2. Hệ thống phân loại 6 siêu giới của lãnh giới Eukarya [19]. Tổng quan

thứ cấp có hình thành các mấu liên kết (clamp connections).
 Các loại hệ sợi tơ nấm ở ngành Basidiomycota
 Hệ sợi cấp 1 hay hệ sợi sơ cấp (primary mycelium)
Hệ sợi sơ cấp phát triển từ sự nảy mầm của một đảm bào tử, gồm những tế
bào đơn nhân gọi là đồng nhân. Tuy nhiên, sau đó phát triển thành những tế bào đa
Hình 1.4. Chu trình sống của các loài trong ngành Basidiomycota [46]. Tổng quan
nhân có vách ngăn ngang thành những tế bào đơn nhân. Đảm không bao giờ phát
triển trên hệ sợi cấp 1.
 Hệ sợi cấp 2
Hệ sợi cấp 2 gồm những tế bào nhân kép và phát triển bởi sự hợp nhân của 2
tế bào đơn nhân. Trong những loài dị tản, tế bào hợp nhân khi hệ sợi của những loài
khác nhau nhưng ở trường hợp đồng tản (homothallic) thì sự hợp nhân xảy ra giữa
hai hệ tơ nấm cấp 1. Quá trình phối hợp của hệ sợi sơ cấp để trở thành hệ sợi cấp 2
hay nhân kép gọi là nhân kép hóa (dikaryotization) hay nhị bội hóa (diploidization).
Bắt đầu từ hệ sợi cấp 2, tơ nấm được gọi là tơ nấm thứ cấp (secondary mycelium).
Sự tạo mấu liên kết hình thành suốt trong sự phân chia của hệ sợi cấp 2, quá
trình tạo mấu liên kết bắt đầu khi giữa hai nhân của tế bào song nhân xuất hiện một
đoạn dài, một nhân di chuyển hình thành một mấu, đồng thời hai nhân phân chia.
Hai nhân mới di chuyển về phía trước, hình thành vách ngăn giữa các nhân, tạo
thành tế bào song nhân mới (Hình 1.5).
 Hệ sợi cấp 3
Hệ sợi cấp 2 tạo thành cơ quan sinh sản hữu tính là quả thể mang các đảm,
đảm được gọi là hệ sợi cấp 3 ở nấm đảm. Ngoài ra, một số loài trong ngành nấm
đảm tạo các tế bào Cystidia nằm gần với các đảm, hình dạng của Cystidia rất đa

tiểu phần:
 Tiểu phần lớn (large subunit)
Tiểu phần lớn có hệ số lắng là 60S bao gồm đoạn 5S RNA, 28S RNA, 5.8
RNA và khoảng 49 protein.
 Tiểu phần nhỏ (small subunit)
Tiểu phần nhỏ có hệ số lắng là 40S được cấu trúc từ 18S RNA và 33 protein.
DNA mã hóa cho hai tiểu phần của ribosome ở nấm đã được nghiên cứu từ
lâu và trên vùng gen mã hóa này có nhiều vùng bảo tồn có ý nghĩa trong phân loại. Tổng quan
Trong vùng gen liên kết từ vùng 18S, 5.8S và 28S có hai vùng trình tự không mã
hóa: ITS1 và ITS2.
 ITS1 và ITS2
Là hai vùng trình tự không mã hóa, chúng không có chức năng gì trong cấu
trúc của ribosome, do đó chúng sẽ được cắt đi khi tạo thành ribosome trưởng thành
(Hình 1.6). Tuy nhiên, các nghiên cứu đã cho thấy rằng hai vùng ITS bảo tồn cao và
biến thể của hai vùng này cũng khác biệt ở cấp độ loài cũng như dưới loài [25].
Hiện nay, vùng DNA mã hóa cho ITS1, ITS2 và 5.8S ribosome được sử dụng cho
hệ thống phân loại phân tử của giới phụ Dikarya là chủ yếu [28].
 DNA tiểu phần lớn ribosome (LSU) và tiểu phần nhỏ ribosome (SSU)
Vùng này mã hóa cho vùng 28S của ribosome, tiểu phần D1/D2 của LSU và
toàn bộ DNA mã hóa cho SSU. Hầu hết các loài trong giới nấm đều phân loại dựa
vào gen mã hóa cho LSU và SSU [28].

Hình 1.7.
Cấu trúc ATPase của nấm men Saccharomyces cerevisiae [7].
Tổng quan
Nguyễn Thị Thu Trang 10

Atp6 nằm trong phần F
0
trong ATPase, cấu trúc Atp6 ở nấm men cho thấy
rằng Atp6 liên kết với tiểu phần Apt4 tạo lên cánh tay quay của tiểu phần F
0
. Sự kết
hợp giữa các phần của ATPase và Atp6 cần thiết có sự hiện diện của Atp10 (Hình
1.7) [7].
atp6 thường được dùng để phân loại nấm trong lớp Ustilaginomycetes,
Exobasidiomycetes và Agaricomycetes [28].
1.2.2.3. DNA mã hóa cho nhân tố kéo dài dịch mã alpha 1 (tef1)
Tef1 nằm trong phức hợp efF-1, phức hợp có nhiệm vụ gắn acid amin mở
đầu lên ribosome tiểu phần 40S, sau đó các nhân tố kéo dài dịch mã khác gắn với
RNA tới vị trí của Tef1 để bắt đầu quá dịch mã ở Eukaryote. tef1 được bảo tồn cao
trong các loài sinh vật, do vậy nó đã được đề nghị sử dụng trong xây dựng cây phát
sinh loài cũng như xác định loài mới [14].
1.2.2.4. Gen mã hóa cho protein RPB1 và RPB2 (rpb1, rpb2)
RNA polymerase II là enzym xúc tác quá trình sao mã RNA từ DNA ở
Eukaryote, enzym có khoảng 12 tiểu phần do 12 gen mã hóa ở người và nấm (Hình

. Cấu trúc RNA polymerase II của Schizosaccharomyces pombe và
S. cerevisiae [86]. Tổng quan
Nguyễn Thị Thu Trang 12

Enzym cytochome oxidase nằm trong màng trong của ti thể, có chức năng
quan trọng trong chuỗi vận chuyển điện tử tổng hợp ATP. Enzym có từ 3 đến 4 tiểu
phần, trong đó các tiểu phần 1, 2, 3 là được nghiên cứu nhiều trên khía cạnh phân
loại học của nấm [68].
Gen cox được dùng chủ yếu trong phân loài ngành Neocallimastigomycota.

1.3. Khái quát về nấm được nuôi trồng
Hầu hết nấm ăn trên thế giới đều thuộc giới phụ Dikarya, đặc biệt là các loài
nấm trồng nằm trong ngành Basidiomycota. Hiện nay có khoảng 1,5 triệu loài nấm
nói chung, nhưng số lượng loài được trồng làm thực phẩm và dược liệu chỉ chiếm
một phần nhỏ. Loài người đã biết tới nấm từ rất lâu, sự hiện diện của nấm đã có từ
những nền văn hóa từ Châu Âu, Châu Mỹ và Châu Á. Trong một số tín ngưỡng cổ,
nấm được coi như là những món quà của Thần Chết bởi chúng mang những độc
chất do đó mang tới sự chết chóc. Nấm ma thuật (Plilocybe) được thu hoạch từ tự
nhiên và ngày nay được trồng ở một vài nước trên thế giới, nấm gây hiện tượng ảo
giác vì độc tính của nó, việc trồng nấm này được coi là phạm pháp bởi vì chiết xuất
từ nấm này là tiền chất để tổng hợp ma túy. Mặc dù các thổ dân Châu Mỹ sử dụng
nấm ma thuật trong rất nhiều hoạt động nghi lễ và săn bắn từ lâu. Ngoài biểu tượng
của Thần Chết, nấm còn được coi là món quà của Chúa Trời. Người Trung Quốc và
Nhật Bản thu hoạch nấm linh chi và đông cô từ trước công nguyên, người Châu Âu

 Nguồn Nitơ (đạm)
Là thành phần dinh dưỡng quan trọng của nấm, tham gia vào tổng hợp acid
nucleic-vật liệu di truyền, protein, các enzym và vách chitin của tế bào nấm. Nguồn
nitơ cung cấp cho nấm có thể ở dạng vô cơ muối nitrat (
3
NO

), muối amon (
4
NH

),
hoặc dạng hữu cơ như cám gạo, cám bắp, bột đậu nành, peptone…
 Nguồn khoáng
Các khoáng chất như phospho (P), kali (K), sulfur (S), magie (Mg) tham gia
vào cấu trúc vật liệu di truyền, protein và là đồng cấu trúc cho nhiều loại enzym
khác, tạo khuynh độ điện hóa và sự thẩm thấu nước vào tế bào. Các nguyên tố vi
lượng như sắt (Fe), kẽm (Zn), mangan (Mn)… chỉ cần một lượng nhỏ nhưng lại cần
thiết trong việc hoạt hóa các enzym, tổng hợp vitamin, quá trình hấp thu và trao đổi
chất, kể cả việc hình thành quả thể một cách bình thường.
 Vitamin
Là những phân tử hữu cơ được dùng với số lượng rất ít chúng không phải là
nguồn cung cấp năng lượng cho tế bào mà giữ chức năng đặc biệt trong hoạt động Tổng quan
Nguyễn Thị Thu Trang 14

 pH
Hầu hết các loài nấm phát triển tại pH trung tính, pH môi trường cũng chi
phối rất nhiều đến sự tăng trưởng của nấm, đặc biệt trong quá trình hình thành quả
thể. pH chua hoặc phèn (pH thấp) làm tơ nấm mọc chậm thưa và thường xoắn đầu,
quả thể bị biến dạng. pH kiềm (pH cao) tơ mọc chậm hoặc ngừng tăng trưởng, quả
thể bị chai và không tiếp tục phát triển.
 Chế độ thông khí Tổng quan
Nguyễn Thị Thu Trang 15

Hàm lượng O
2
và CO
2
, là những chất có chủ yếu trong không khí. Oxy cần
cho sự hô hấp của tế bào nấm. CO
2
không ảnh hưởng nhiều trong giai đoạn tơ nấm
phát triển nhưng trong suốt giai đoạn phát triển quả thể, nhiều loài nấm rất nhạy
cảm với nồng độ CO
2
cao trong môi trường, quả thể có cuống dài và mũ nhỏ hoặc
bị ức chế sự phát triển [73].
 Ánh sáng
Ánh sáng gần như chỉ có giá trị trong giai đoạn ra quả thể. Ở nhiều loài nấm,

Trước khi trồng nấm cần có giống tốt, các bước làm giống.
 Phân lập nấm và giữ giống
Nấm được phân lập trên môi trường PDA hay PGA, nước chiết malt từ lúa
hoặc lúa mạch, môi trường được chứa trong ống nghiệm hoặc đĩa Petri. Hệ sợi từ
quả thể nấm được chuyển vào trong ống nghiệm hoặc Petri chứa môi trường, nuôi ở
nhiệt độ thích hợp. Khi tơ nấm lan đầy cấy chuyền sinh khối sang môi trường mới.
Đây được coi là giống cấp 1 [73].
 Chuẩn bị giống cấp 2 và meo giá môi
Tùy theo điều kiện từng địa phương và loài nấm mà người ta chọn cơ chất
giống cấp 2. Do đó nguyên liệu của giống cấp 2 rất đa dạng từ lúa mạch, lúa mì hay
rơm rạ. Mục tiêu của việc chuẩn bị giống ở giai đoạn này là nhân cấp giống để
chuẩn bị bước vào giai đoạn nuôi trồng, mặt khác giúp nấm quen với môi trường
giàu các chất khó tan. Một số vùng còn giai đoạn meo giá môi sau giai đoạn giống
cấp 2, meo giá môi nhằm nhân cấp để tạo một số lượng giống lớn hơn và giúp nấm
mọc tốt khi nuôi trồng [3].
Sau khi giống chuẩn bị xong, bước cuối cùng là nuôi trồng nấm.
Những kỹ thuật trồng nấm nhân tạo hiện nay.
 Trồng nấm trong nhà
Nhà trồng cho phép người trồng điều khiển các thông số về điều kiện môi
trường như nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm… phù hợp cho từng loại nấm. Những nấm
nhạy cảm với các điều kiện về độ ẩm và nhiệt độ cần được nuôi trong nhà, như kim
châm (Flammulina velutipes), đuôi gà (Grifola frondosa), bào ngư vua (Pleurotus
eryngii). Trong khi đó, đa số nấm bào ngư (Pleurotus) có thể phát triển tốt trong
nhà trồng ít cần sự điều chỉnh.
 Trồng nấm trên khay
Nấm mỡ được trồng phổ biến bằng kỹ thuật này. Hai loài nấm mỡ thường
được nuôi trồng là A. bisporus và Agaricus bitorquis. Nguyên liệu sau khi ủ được
cho vào khay, cấy giống khi tơ nấm lan đầy, phủ lên bề mặt một lớp đất mùn hay đá
vôi. Lớp bề mặt này giúp cơ chất không bị khô và kích thích tơ nấm tạo quả thể.


còn được chôn dưới đất, phủ lên một lớp lá mục hoặc vải ni-lông. Đây là phương
pháp để trồng nấm trân châu (Pholiota nameko) và nấm linh chi (G. lucidum).
Khác với kỹ thuật trên là các khúc cây được thay bằng các cơ chất như mạt
cưa, dăm bào, rơm rạ, cùi bắp, bã mía… Sau khi tơ nấm lan kín cơ chất các túi phôi
được đem ra ngoài trời và cho xuống đất sao cho 1/3 túi phôi nhô lên khỏi mặt đất.
Quả thể sẽ mọc ra từ trên miệng túi phôi. Kỹ thuật này chỉ áp dụng ở các vùng có
khí hậu thích hợp như độ ẩm cao, nhiệt độ ổn định. Ở Trung Quốc, phương pháp
này để trồng nấm đông cô. Tổng quan
Nguyễn Thị Thu Trang 18

 Trồng nấm ngoài trời
Thích hợp cho những loài nấm ra quả thể khi ở ngoài trời. Cơ chất được sử
dụng là rơm rạ, mạt cưa và dăm bào. Cơ chất được xếp thành từng lớp tạo thành
luống hay mô dưới bóng râm. Cuối cùng cho meo giống vào giữa các lớp. Mô nấm
được tưới nước hàng ngày và được phủ bằng áo mô làm từ rơm rạ bện thành tấm.
Việc thiết kế mô nấm và áo mô tùy theo từng vùng. Áo mô chỉ được mở ra khi cần
thu đón nấm. Những loài thường trồng theo phương pháp này là nấm rơm.

1.4. Nấm dược liệu và dược tính
Nấm dược liệu chỉ những loài nấm có khả năng ngăn chặn, phòng chống
bệnh tật và được sử dụng làm thuốc từ hàng ngàn năm nay tại Châu Á. Theo kinh
nghiệm tích lũy có rất nhiều loài nấm được thu hái từ tự nhiên và trồng khắp thế
giới. Ngày nay, các nhà khoa học đã có nhiều công trình nghiên cứu chứng minh
nấm dược liệu có những khả năng trên. Một số loại nấm đang được trồng nhiều trên