Bộ giáo dục và đào tạo
đại học quốc gia hà nội
báo cáo tổng kết đề tài kh&cn cấp nhà nớc

Nghiên cứu các chất có hoạt tính sinh học
từ nấm Linh chi đa niên, nấm đa niên
góp phần phòng chống và điều trị
một số bệnh ung th, tim mạch và tiết niệu Chủ trì đề tài: GS. TSKH. Trịnh Tam Kiệt


4 CN. Hoàng Văn Vinh Cán bộ NC nt
5 CN. Vũ Thị Kim Ngân Cán bộ NC nt
6 Ths. Trần Thị Lan Cán bộ NC nt
7 TS. Ngô Anh Cán bộ NC ĐH. Huế
8 PGS. TS. Lê Xuân Thám Cán bộ NC
TT Sinh học
phóng xạ
9 Ths. Tạ Bích Thuận Cán bộ NC ĐH KHTN
10 Ths. Đoàn Văn Vệ Cán bộ NC nt
11 CN. Trịnh Tam Bảo Cán bộ NC nt

4. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
4.1. Mục tiêu
- Xác định tên khoa học của nấm Linh chi đa niên và nấm đa niên có khả
năng dùng làm dợc liệu.
- Xác định một số nhóm chất có hoạt tính sinh học chính của nấm Linh
chi đa niên và nấm đa niên dự kiến sử dụng trong liệu pháp nấm góp phần
tăng cờng khả năng miễn dịch và phòng chống ung th, điều trị bênh tim
mạch, tiết niệu bảo vệ sức khoẻ cộng đồng.

2
4.2. Nội dung
- Tiến hành thu mẫu nấm Linh chi đa niên và nấm đa niên tại một số vùng
sinh thái chính của Việt Nam và biên giới Trung Quốc, Lào, Campuchia. Định
loại các loài nấm thu đợc bằng các đặc điểm hình thái và sinh học phân tử của
một số loài quan trọng.
- Phân lập thuần khiết giống gốc nấm để bảo tồn quỹ gen. Xác định khả
năng thu nhận sinh khối nấm để cung cấp nguyên liệu nấm ổn định.
- Tách chiết, sàng lọc, nghiên cứu một số các hợp chất tự nhiên và một số
chất có hoạt tính sinh học chính ở một số chủng nấm quý hiếm. Xác định cấu

6. Tình hình kinh phí
- Kinh phí đợc cấp: 600 triệu đồng.
- Kinh phí đã sử dụng: 600 triệu đồng.

Trung tâm Công nghệ Sinh học
Giám đốc TS. Dơng Văn Hợp

Chủ nhiệm Đề tài
GS. TSKH. Trịnh Tam Kiệt

Cơ quan chủ trì đề tài
Đại học Quốc gia Hà Nội

mushroom base on morphological and molecular characteristica.
- Research on main bioactive compounds for health protection
(stimulation immune system and antitumor).
4.2. The research contents
- Research and identifycation the perennial Ganoderma, polypores
mushroom base on morphological and molecular characteristica and maintaining
the strains on culture collection.
- Research on main bioactive compounds and method to exstract the main
bioactive compounds from some important specices.
- Study using the abouv exstractions to stimulation immune system and
antitumor traitement. 5
5. Main results
- There are about 52 specices of the perennial Ganoderma, polypores
mushroom had been found (Ganodermataceae – 2 genus, 13 species,
Hymenochaetaceae – 3 genus, 24 species, Coriolaceae – 7 genus, 15 species).
- The morphological and micropic characteristica of some importan
species are discribed and maintaining the strains on culture collection.
- Finding the method to extraction DNA of anual Linzi and identification
Ganoderma using PCR – RFLP analysis of Mn SOD gene.
- The growing and fruiting of the perenial linzhi and polypores strains
Toh, E1, H1, Gs and C were studied on Agar medium and Substrat.
- The main bioaactive compounds of the strains E1,Toh, H1, N1, C1 were
identificative by chromatography methods: MS, HPLC, TLC.
- All extracts and their mixtures do not exhibit cytotoxic effect against the


6
I. Mở đầu
Số lợng các loài nấm đã đợc định danh là 80060 loài (Từ điển nấm,
Kirk et al, 2001). Trong đó, số lợng loài nấm lớn (Marcro fungi) có quả thể
nhìn thấy bằng mắt thờng khoảng 14 nghìn loài và có thể lên tới 22 nghìn loài
(Hawkworth, 2001) trong đó, khoảng 50% các loài có thể ăn đợc bởi các mức
độ khác nhau, hơn 2000 loài an toàn (cả các hợp chất trong tế bào và các hợp
chất trao đổi thứ cấp đều có tính sinh kháng nguyên yếu và không gây phản ứng
phụ ) và khoảng 700 loài đợc cho rằng có các đặc tính dợc liệu. Các số liệu
hiện có cho thấy nấm lớn là nguồn tài nguyên vô tận ẩn chứa các hợp chất có
trọng lợng phân tử lớn nh: Polysaccharide, Pol accharide- Protein, và đặc biệt
giàu các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp có trọng lợng phân tử nhỏ hơn.ít nhất
có 651 loài và 7 dới loài thuộc 182 chi của các Nấm có đảm đa bào
(Heterobasidiomycetes) và Nấm có đảm đơn bào (Holobasidiomycetes) chứa các
Polysaccharide có tác dụng dợc liệu (Reshetnikov et al., 2001). Chúng hầu hết
là các Glucan với nhiều loài liên kết Glycoside khác nhau nh -1->3, -1->6 và
- 1->3) nhng một số thực sự là Hecteroglucan. Một số polysaccharide liên kết
với các gốc protein nh phức hợp PSP (Krestin) chiết xuất từ nấm Vân chi
(Ttrametes versicolor). Các chất này có tác dụng chủ yếu chống ung th, nhng
nằm trong vách tế bào nấm, thờng che lấp bởi thành phần chính của nấm là
kitin. Bên cạnh đó, từ nấm lớn hàng trăm các chất có hoạt tính sinh học có trọng
lợng phân tử nhỏ hơn cũng đa đợc tách chiết, sàng lọc, nghiên cứu cấu trúc
cũng nh hoạt tính sinh học của chúng. Trớc hết phải kể đến các Terpenoit nh
ganoderic axit, lucideric axit, ganoderiol, ganodermodiol từ các loài Ganoderma
cũng nh
các lanostal, sterol, phenol từ hàng loạt các loài nấm lớn khác.

Hoạt tính chống ung th, điều hòa hệ miễn dịch, antioxydan, chống viêm
nhiễm, chống virus, vi khuẩn, nấm; làm giảm lợng choresterol, mỡ, đờng

trong môi trờng nuôi cấy, xác định các nhóm chất chất có hoạt tính sinh học
chính của một số loài nấm quan trọng, khảo nghiệm việc sử dụng quả thể của
các loài này trong liệu pháp nấm đa niên.
II. phơng pháp nghiên cứu
- Thu thập, xử lý, phân lập và bảo quản nấm theo Trịnh Tam Kiệt (1981),
Ryvarden & Gilberson (1986).
- Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử của các loài Ganoderma theo Lê
ỡnh Lơng và cộng sự (2004-2005).
- Nghiên cứu hoá các hp chất tự nhiên theo U. Graefer và cộng sự (1991).
8
III. Kết quả nghiên cứu

3.1. Thu mẫu nấm tại một số vùng sinh thái chính của Việt Nam bao gồm:
Lào Cai Sapa, Lai Châu, Sơn La, Yên Bái, Tam Đảo, Ba Vì, Cúc Phơng,
Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Thừa Thiên Huế, Đà Nẵng,
KonTum, Đắc Lắc, Đắc Nông. Tổng số mẫu thu đợc khoảng 500 mẫu.
+ Các mẫu vật trên đã đợc xử lý, sấy khô và bảo quản tại Bảo tàng Nấm
Trung tâm Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội.

3.2. Nghiên cứu thành phần loài, định loại và mô tả các loài quan trọng của
Việt Nam
+ Nghiên cứu đặc điểm hình thái quả thể, sợi, bào tử dới kính hiển vi
quang học và kính hiển vi điện tử quét của khoảng 15 chủng.
+ Bớc đầu định loại và mô tả các loài thờng gặp. Các số liệu nghiên cứu
cho thấy tập đoàn nấm Cổ linh chi và nấm Đa niên chủ yếu của Việt Nam khá
phong phú:


Chi Phellinus Quell., 1886 (22 species)
1. Phellinus adamantinus (Berk.) Ryv.
2. Ph. bambusinus (Pat.) Pat.
3. Ph. cf. conchatus (Pers.: Fr.) Pat.
4. Ph. contignus (Pers.: Fr) Pat.
5. Ph. extensus (Lev.) Pat.
6. Ph. fastuosus (Lev.) Ryv.
7. Ph. gilvus (Schw.: Fr.) Pat.
8. Ph. hartigii (Allesch. et Schnabl.) Pat.
9. Ph. igniarius (L.: Fr.) Quel.
10. Ph. lamaensis (Murr.) Pat.
11. Ph. linteus (Berk. et Curt.) Teng
12. Ph. nilgheriensis (Mont.) Cunn.

10
13. Ph. noxinus (Corner) Cunn.
14. Ph. pachyphloeus (Pat.) Pat.
15. Ph. pectinatus (Klotzsch) Quel.
16. Ph. pini (Brot.: Fr.) Ames
17. Ph. pullus (Berl. et Mont.) Ryv.
18. Ph. rimosus (Berk.) Pilat
19. Ph. robustus (Karst.) Bourd. et Galz.
20. Ph. senex (Nees et Mont.) Imaz.
21. Ph. setulosus (Lloyd) Imaz.
22. Ph. torulosus (Pers.) Bourd. et Galz.
Chi Phylloporia Murrill, 1904
1. Phylloporia ribis ( Schumach.:Fr.) Ryvarden
Chi Inonotus P. Karst., 1879
1. Inonotus sp.
Bộ Poriales

lng loi gn tng ng nh nhau, khong trờn di 10 loi.
Cng tng t nh vy, khi xem xột v a dng b ta thy u th rừ rt
thuc v Hymenochaetales, sau ú mi ti Ganodermatales v Poriales.
V a dng chi, ta thy ni bt u th tuyt i trong cỏc nm a niờn ca
Vit Nam thuc v Phellinus, sau ú ti Ganoderma thuc d
i chi Elfvingia
úng vai trũ quan trng. Cỏc chi Fomitopsis v Pereniporia úng vai trũ trung
bỡnh. Mt s chi ch cú mt loi c ghi nhn nh Nigrofomes, Laricifomes,
Tomophagus, Wolfiporia,

Nhằm bảo tồn nguồn gen nấm, các quả thể tơi đã đợc phân lập sơ bộ tại
hiện trờng và phân lập thuần khiết tại phòng thí nghiệm. Các chủng giống gốc
Nấm đợc lu trữ tại Bảo tàng Giống Gốc Nấm, Trung tâm CNSH, Đại học Quốc
Gia Hà Nội (30 chủng).

12
3.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử
Bên cạnh việc sử dụng các phơng pháp nghiên cứu hình thái giải phẫu,
nghiên cứu các đặc điểm hiển vi quang học cũng nh điện tử, việc thăm dò định
loại linh chi đa niên cũng bớc đầu đợc tiến hành. Các kết quả ban đầu thu
nhận đợc cho thấy :
+ ở các loài Linh chi đơn niên : Xỏc lp c quy trỡnh tỏch chit ADN
t nm Linh chi n niờn. Cú th túm tt nh sau: 0,1 g mu nm vi 1 ml
dch chit (Tris 100 mM pH 8, EDTA 50 mM, SDS 1%) 65
o
C trong 30 phỳt;
thờm 200 àl kali axetat 5M, ỏ 20 phỳt; ly tõm thu dch ni; kt ta ADN bng

ScaI chỉ cắt Gau , tạo ra 2 băng đều có kích thớc khoảng 375bp; FspI tạo ra 2
băng có kích thớc 600 và 150 bp; còn PstI tạo ra 2 băng có kích thớc 650 và
100bp. Tiếp theo có thể dùng AvaI, AvaII và PvuI và chúng đều tạo ra các đoạn
ADN ở Gau khác xa so với Gl1, Gl2 và HQ.

b.Nhận dạng G.lucidum và các dới loài của nó:

G.lucidum có thể đợc nhận dạng dựa trên kiểu cắt đặc trng bởi các enzym
PvuI, AvaI, AvaII, MnlI, HhaI, AluI, SacI, EcoRI nh thể hiện trong bảng 1.
Gl2 có thể đợc phân biệt với Gl1 và HQ bởi sự khác biệt trong kích
thớc các đoạn cắt đợc tạo ra, đặc biệt sự khác biệt này khá rõ ở HhaI, MnlI,
PvuI và AvaI. Gl2 rất có thể là dị hợp tử đối với locus Mn SOD nên cho hai băng
sản phẩm PCR có kích thớc khoảng 700 và 720 bp, do đó khi cắt bởi các ezyme
giới hạn tạo ra nhiều băng có tổng kích thớc khoảng 1200bp.
HQ có quan hệ gẫn gũi nhất với Gl1 do số lợng và kích thớc các đoạn
cắt giới hạn của chúng rất giống nhau đối với đa số enzym. Nh vậy có thể xếp
HQ vào một dới loài của G.lucidum rất gần với Gl1. Tuy nhiên, HQ cũng có thể
đợc phân biệt với Gl1 bởi kiểu cắt của enzym AvaII. Gl1 chỉ cho 2 băng : 440
và 220 bp, còn HQ cho 4 băng: 440, 320, 220 và 115 bp. Điều này có thể đợc
giải thích do HQ cũng là dị hợp tử đối với locus này, trong đó 1 alen có 1 điểm
cắt (tạo 2 băng 440 và 220 bp giống với Gl1) còn 1 alen có 2 điểm cắt cho AvaII
(tạo 3 băng 320, 220 và 115 bp). AvaII cắt đoạn ADN của Gl2 cũng tơng tự nh
của HQ.

FspI ScaI PstI PCR

_____________ _____________ _____________ _____________
Gau HQ Gl1 Gl2 Gau HQ Gl1 Gl2 Gau HQ Gl1 Gl2 Mr Gau HQ Gl1 Gl2

500
400

300 200
175
150
125
100

75
AluI SacI EcoRI HhaI
______________ _____________ _____________ ______________
Gau HQ Gl1 Gl2 Gau HQ Gl1 Gl2 Gau HQ Gl1 Gl2 Gau HQ Gl1 Gl2 Mr

500

400

300


Kích thớc
băng (bp)
Số
băng
Kích thớc
băng (bp)
Số
băng
Kích thớc
băng (bp)
Số
băng
Kích thớc
băng (bp)
0 PCR* 1 750 1 690 1 690 2
(2)

720+700

1 PstI 2 650+100 1
690
(không cắt)
1
690
(không cắt)
2
(2)

720+700
(không cắt)

(2)

470+320+
240+120(2)
5. AvaI
(3)
2 570+130 1 630 1 630 2
(2)
680+660
6. PvuI
(3)
2 400+390+300 3
310+290+
110
3
(4)310+290+
110

3
(2)

310+300+
110
7 MnlI
(3)
5
250+175+

200+175+
150+130+
120+115+
90+70
9 AluI 2 560+190 2 500+165 2 500+165 4
(2)

520+510+
180+170
10 SacI 2 560+190 2 500+165 2 500+165 4
(2)

520+510+
180+170
11 EcoRI 2 620+130 2 560+130 2 560+130 3
(2)

590+570+
130

Chú thích: *: Sản phẩm PCR với cặp mồi FGau1 và RGau2
(1): tạo thành 2 băng cùng kích thớc 375 bp
(2): có thể giải thích sự tạo nhiều băng do các mẫu là dị hợp tử đối với locus Mn
SOD.
(3):bảng chỉ liệt kê các đoạn ADN nhìn thấy trên bản gel. Những đoạn còn lại
quá nhỏ ( dới 70bp) không thể thấy đợc trên bản gel do nồng độ gel 6% không phù hợp.
(4):do nồng độ ADN cao nên enzym cha cắt hoàn toàn đã bị mất hoạt tính

16
Từ kết quả trên cho thấy, PCR - RFLP đối với đoạn gen Mn SOD có thể

u git nc trờn mt. Hu ht cỏc chng u dng li khi
tin n thnh bỡnh ngoi tr chng H1. Din bin c th ca s mc nh sau :

17
- Ở chủng Toh (Tomophagus), phát triển sợi dạng bông màu xám và rất
mềm. Khi hầu hết hệ sợi đã chuyển sang giai đoạn trưởng thành, chúng ta có thể
quan sát thấy sự tào thành bào tử vách dày, hay còn gọi là hậu bào tử
(chlamydospore) với những kiểu hoa văn điển hình. Đặc biệt, trong điều kiện tối
ưu, chủng này có thể hình thành quả thể chín với nhiều lỗ tương đối lớn. Trên
bào t
ầng, ta có thể tìm thấy nhiều bào tử đảm điển hình của loài với kích thước
trong khoảng 15 – 18 µm. Dưới kính hiển vi điển tử quét (SEM), ta quan sát
được những bào tử đã nảy mầm và cấu trúc hoa văn dạng mạng.

Bµo tö cña Tomophagus vµ Pereniporia trong nu«i cÊy thuÇn khiÕt.

- Ở chủng E1 (Ganoderma sp.), hệ sợi đổi màu từ trắng sang vàng sau
một thời gian. Các sợi gắn với nhau rất chặt. Trên bề mặt cấu trúc sợi quan sát
thấy nhiều giọt nước. Trên bề mặt có nhiều nếp nhăn và vết nứt.
- Ở chủng P1 (Pereniporia sp.), hệ sợi ban đầu màu trăng, sau đó chuyển
thành màu x¸m đen. Khi quan s¸t d−íi kÝnh hiÓn vi ta thÊy sîi nÊm với bào tử
vách dày điể
n hình không có hoa văn. Trong điều kiện tối ưu, chủng này có thể
hình thành mÇm m«ng qu¶ thÓ (primordium).
- Ở chủng H1 (Phellinus), hệ sợi ban đầu cũng có màu trắng dạng bông,
sau đó chuyển sang vàng. Đặc biệt, sợi nấm có thể leo men theo thành bình tam
giác (Erlenmeyer flask), đạt tới độ cao 3-5(-7) cm và đôi khi còn chạm nút bông.
Khi quan sát dưới kính hiển vi, hầu hết cấu trúc sợi là sợi nấm dạng lông cứng.
Dưới những điều kiện tối ưu, ch
ủng này có thể hình thành quả thể bất thụ dạng

- Chng Toh hình thnh qu th mu vng v nu chm sóc tt s cho qu
th thnh thc với mặt mũ đầu tiên màu vàng sáng sau chuyển thành vàng đạm,
nhẵn bóng tơng tự màu sắc quả thể ngoài tự nhiên. Phía dới hình thành ống
nấm điển hình 2-3 ống trong 1 mm. Trên lớp bào tầng hình thành bào tử nấm
thành thục. Thời gian hình thành quả thể thành thục trong điều kiện thuận lợi 40
- 60 ngày. Trên giá thể mùn ca có bổ sung dinh dỡng, chủng Toh nhanh chóng
mọc kín giá thể mặc dù sợi rất mỏng và hình thành quả thể thành thục sau 4 tuần
kể từ khi nuôi cấy. Khả năng thu nhận sinh khối chủ động của chủng nấm này là
rất khả quan.
- Chng E1 phát trin to thnh qu th th
nh thc, hình thnh ng nm
in hình mu trng v bo t giá điển hình.Thời gian hình thành quả thể thành
thục dài tới 120-140 ngày. Sự hình thành quả thể của Ganoderma

20

Sự hình thành quả thể của Tormorphagus
Cng nh trờn mụi trng thch khoai tõy, s mc v hỡnh thnh qu th
ca cỏc chng nm l nhiu nm trờn giỏ th mựn ca cng b nh hng bởi
nhiu nhõn t mụi trng, ly vớ d nh ỏnh sỏng, ch khớ, nhit , m v
iu kin dinh dng. Trong s ú, ỏnh sỏng v nhit l hai nhõn t ti quan
trng i vi s phõn hoỏ vựng sinh dng v sinh s
n. Quỏ trỡnh to bo t
non, quỏ trỡnh phõn hoỏ m chu nh hng tớch cc ca ỏnh sỏng v nhit
trong khi s mc ca si trong iu kin cú ỏnh sỏng v nhit tng i cao
thỡ li b c ch mt cỏch rừ rt.

S¾c kÝ líp máng cña dÞch chiÕt cån E1
Qua đó chúng ta thấy các dịch chiết nước và cồn của các mẫu nấm đa niên
chứa vô cùng nhiều các hợp chất tự nhiên. Để nghiên cứu tiếp các nhóm chất,
chúng ta phải tách chiết, sàng lọc rất kỹ và ứng dụng các phương pháp nghiên
cứu hiện đại mới có thể đi sâu nghiên cứu được cấu trúc phân tử của chúng.
23CÊu tróc ph©n tö cña Colossolactons (Tomophagus)
CÊu tróc ph©n tö cña Terpenoid (Wolfiporia)

24Cấu trúc phân tử của các hợp chất tách chiết từ H
1

3.6. Nghiên cứu tác dụng của dịch chiết nấm Linh chi đa niên và nấm đa niên
lên tế bào nuôi cấy Invitro của ngời và khỉ