ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN
ĐỂ TÀI:
NGHIÊN c ú u KHẢ NĂNG ÚNG DỤNG LECTIN VÀ CÁC
CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC KHÁC TỪNGUổN ĐỘNG
VẬT TRONG CHẨN ĐOÁN MỘT s ố BỆNH UNG THƯ VÀ
NHIỄM TRỪNG Ở NGƯỜI
Mã sỏ: QT- 98- 10
Chù trì (lề tài: nùi Hiương Thuận
Các rán hộ tliam iỊÍo: - Nguyễn Hạnh Phúc.
- Cung Thị Tý
BÁO CÁO TÓM TÁT
1.Tên đề tài:
Nghiên cứu khả năng ứng dụng lectin và các chất có hoạt tính sinh học khác
từ nguồn động vật trong chẩn đoán một số bệnh ung thư và nhiễm trùng ở người.
Mã số: QT- 98- 10
2 .CK1Í trì đề tài: PTS. Bùi Phương Thuận.
3.Mục tiêu và nội dung nghiên cứu:
-Tách và tinh chế lectin, cũng như một số chất có hoạt tính sinh học khác
(proteinaz, chất ức chế proteinaz ) rừ động vật.
-Sử dụng chế phẩm thu được vào nghiên cứu ứng dụng trong miễn dịch học,
nhằm tiến tới cliỊẩn trị một số bệnh hiểm nghèo ở người.
4.Kết quả đạt được:
-Đã thu thập mẫu sam Tưc.hypìeus tridentatus từ vùng biển Sầm sơn (Thanh
hoá).
Từ huyết thanh sam đã tinh chế được lectin nhờ kỹ thuật sắc ký ái lực trên cột ỊgG-
sepharose 4B. Chê phẩm đã được kiểm tra độ tinh sạch và đã xác định khối lượng
phân tử của các bãng polypeptit bàng kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamit có
SDS trong điều kiện có chất khử. Các kết quả nhận được cho thấy chế phẩm lectin
đã được giải phóng khỏi nhiều protein tạp và đạt độ tinh sạch cao, về cấu tạo được
gồm ba phần dưới đơn vị tương ứng khối lượng 27, 68 và 72 kDa.
chế và định lượng IgG, phục vụ cho nghiên cứu và liệu pháp miễn dịch, dùng để
chẩn đoán và tiến tới chữa trị một sô bệnh hiểm nghèo ở người.
- Đã hoàn thành và gửi 1 bài báo để đãng trên tạp chí Di truyền học và ứng
dụng. Bài đã được nhận và sẽ được công bố trong số 4/1999.
-Đã hướng dẫn ba sinh viên làm iuận án tốt nghiệp. Hai trong số đó (Hoàng
Nhật Sơn và Trần Quỳnh Hoa) đã bảo vệ đạt loại giỏi (9 điểm). Sinh viên thứ ba
(Nguyễn Trọng Tuệ) đã có báo cáo đoạt giải ba tại Hội nghị Khoa học Sinh viên
của Khoa năm 1999, đã hoàn thành luận án và sẽ bảo vệ vào năm 2000.
S.Tình hình sử dụng kinh phí của dề tài:
Kinh phí được cấp 8 000 000 đ
Kiiih phí đã chi 8 000 000 đ
Trong đó:
Công tác phí
300 000 đ
Thuê hợp đổng
1 800 000 đ
Chi phí hoạt động chuyên môn
5 400 000 đ
Đánh máy, chụp tài liệu 180 000 đ
Quản lý phí cơ sở
320 000 đ
Tổng cộng
8 000 000 đ
Co' quan quiỉn lý (lề tài
III
OUTLINE REPORT
Ỉ.Name of subject:
Study on the possible application of animal lectins and other biologically
active substances in the diagnoses of some human cancers and infection diseases.
Code registered: QT- 98- 10.
treatment of diseases.
Subject Manager
Bill Phitong Thuan
V
MỤC LỤC
Trang
Mở đầu í
Nguyên liệu và phương pháp '2.
Kết quả và thảo luận ổ
Kết luận 2Ẵ
Tài liệu tham khảo
Phụ lục 30
vi
MỞ ĐẦU
Việc nghiên cứu cấu trúc, chức năng và vai trò của các chất liên kết đường ớ
màng đã được đẩy mạnh trong những Iiãm gổĩi đây nhờ sử dụng lectin [4J. Lectin là
những protein hoặc glycoprotein có hoạt tính sinh học, được phân bô phổ biến
trong sinh giới. Tuy không có nguồn gốc miễn dịch, nhưng lectin lại có khả năng
liên kết đặc hiệu với các loại đường và hợp chất chứa đường luôn có trên bề mặt (ê
bào, do vậy có thể gây ngưng kết nhiều loại tế bào [3], Cho đến nay, chức năng
sinh học của lectin còn chưa được làm sáng tỏ hoàn toàn, và đang được tiếp tục
nghiên cứu. Người ta đã thu được nhiều bằng chứng cho thấy lectin có vai trò hảo
vệ, bảo đảm tính chống chịu các bệnh truyền nhiễm ở nhiều loại thực vật, làm chất
dự trữ hoặc có vai trò vân chuyến các chất dự trữ, làm cầu nối giữa vi khuẩn cố
định nitơ với thực vật [5], hoặc đóng vai trò quan trọng trong hệ thống tiền miễn
dịch, bảo vệ cơ thể ở động vật [8], Lectin có lliể lliam gia điều chỉnh nhiều chức
nâng nhận biết tế bào trong quan hệ tương tác sinh lý giữa các tế bào trong cùng
một cơ thể, cũng như giữa các tê bào vật chú và vật ký sinh ở động vật và thực vật
[3], Những ứng dụng của lectin (long nhiều lĩnh vực nghiên cứu sinh học vn V học
ngày càng phong phú [5]. Đề tài:” Nghiên cứu khá nâng ứng dụng lectin và các
Hoạt độ của lectin được xác định bằng kỹ thuật miễn dịch qua khá năng gây
Iigung kêt hổng cầu Iheo phương pháp của Roche và Monsigny [8]. Dịch lectin
được pha loãng gấp đôi liên liếp bằng đệm tris 0,05 M pH 8,3 có chứa NaCI 0,15
M (TBS) trong các giêng của bản thử hằng chất dẻo đáy nhọn (Microíitei system
của Anh). Tiếp theo cho vào mỗi giếng hổng cầu 2% đã được rửa sạch nhiều lẩn
bằng dung dịch muối sinh lý (NaCI 0,9 %). Kết quả phản ứng ngưng kếí được ghi
nhộn sau 60- 90
pluìt ở nhiệt độ phòng. Hoại độ Iigiíng kết (hiệu giá, viết lát là HAA) là giá trị
nghịch đảo của độ pha loãng ỈỚI1 nhất mà dịch lectin vẫn còn khả năng gây ngưng
2
kết hồng cầu. Hoạt động riêng của chế phẩm lectin là số đơn vị ngưng kết HAA có
trong 1 mg protein.
3.2. Xác định hàm lượng protein
Hàm lượng protein của huyết thanh sam và của chế phẩm lectin được xác
định theo phương pháp Lowry, dùng huyết thanh bò làm chuẩn, hoặc đo ở bước
sóng 280 nm trên máy quang phổ, như đã mô tả trước đây [8].
3.3.Tinh chê lectin sam bằng cột sắc ký ái lực ìgG-Sepharose 4B
Cột sắc ký ái lực dùng IgG tách từ huyết thanh người làm phối tử gắn lên
sepharose 4B đã hoạt hoá được chuẩn bị theo phương pháp chuẩn của hãng
Pharmacia (Thuỵ điển) [8].
Huyết thanh sam được ly tẳm loại tế bào máu và plia loãng bằng đệm tri.s
chuẩn (TBS). Dung dịch này được cho chảy qua cột sắc ký đã cân bằng trước trong
TBS với tốc độ 10 ml/giờ. Quá trình được lặp lại nhiều lần. Rửa lại cột bằng TBS
cho đến khi hết protein không gắn với ígG trên cột. Phản hấp phu lectin bằng đệm
có pH thấp, tốc độ rửa chiết 20 inl/giờ, thu phân đoạn I ml. Xác định hoạt độ và
hàm lượng protein của các phân đoạn. Thu chê phẩm, thẩm tích loại muối và bảo
quản ở 0nc.
3.4. Phương pháp điện di theo Laemmli:
Đã tiến hành điện di trên gel polyacrylamit có SDS (SDS-PAGE) có sử dung
chất khử (còn gọi là điện di biến tính) để xác định độ tinh sạch và khối lượng phân
+ủ bản 2 giờ ở 37°c
+Rửa bản 5 lần bằng dung dịch Tween 20.
-Gắn cộng hợp:
+Nhỏ vàơ mỗi giếng của bản nhựa 50 |.il cộng hợp kháng IgG người gắn
enzym (PO) pha loãng 1/2 000 trong dung dịch blocking.
+ủ I giờ ở 370C .
+Rửa 3-5 lần như trên.
-Gắn cơ chất:
+Nhỏ vào mỗi giếng 50 |.il cơ chất OPD.
+Để trong tối 10-15 phút ở nhiệt độ phòng cho phản ứng xảy ra hoàn toàn.
-Ngừng phản ứng:
+N1-IỎ 25 |il dung địch axit H2S04 2M vào mỗi giếng
+Đọc kết quả phản ứng màu trên máy đọc ELỈSA ở bước sóng 492 nm.
4
KỂT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
l.Tinh chê lectin sam
Lectin sam đưực tinh chế từ huyết thanh sam theo quy trình đã được mô tả
trong phần phương pháp nghiên cứu. Hoạt độ ngưng kết hồng cầu và hàm lượng
protein của các phân đoạn thu được đã được xác định. Kết quả tinh chế lectin được
tóm tắt ở bảng 1 và biểu diễn trên hình I.
Bảng 1: Kết quả tinh chê lectin từ huyết thanh sam
Các bước
tinh chê
Protein
Hoạt độ
Hoạt độ riêng
(đ.v.n.k/mg protein)
Độ tinh
sạch (lần)
mg
HìnỀi 2 : Phổ diện đi biên tính (SI)S-PA(ỈE) chế phẩm lectin sam
1 .Huyết thanh sani.
2.Chế phẩm lectin.
3.Protein chuẩn (Sigma): a- lactalbumin: 14,4 kDa; chất úc chê Kunitz
từ đậu tương: 20,1 kl)a; cacbonic anliytlraz: 30 kl)a; ovalbumin: 43 kl)a;
albumin huyết thanh bò: 67 kDa; pliotphorylaz B: 94 kl)a,
Điện di đồ cho thấy: so với huyết thanh sam (cột 1), chế phẩm lectin (cột 2)
đã được giải phóng khỏi lất nhiều protein tạp. Protein lectin chỉ còn chứa ba vạch
lõ nét của ba phẩn dưới đưn vị (d.đ.v) tương ứng với khối lượng phân tứ (Mr)
khoảng 27, 68 và 72 kDa. Kết quá này chứng tỏ độ tinh sạch của chế phắm và phù
hợp với các kết quả chúng tôi đã nghiên cứu trước đây bằng các quy trình tinh sach
khác [8].
7
2.Xác định tính đặc hiệu của lectin sam với kháng thể lớp IgG
Các globulin miễn dịch (viết tắt !à Ig) đóng vai trò kháng thể- bảo vệ cơ thê
chống lại các vật lạ xâm nhập là các kháng nguyên- trong hệ tuần hoàn cùa người
và động vật bậc cao, và được tạo thành Irong đáp ứng miễn dịch dịch thể. Sự kết
hựp đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và khả năng sản xuất được các
kháng thể đặc hiệu đã khiến cho chúng được sử dụng rộng rãi như một chất phản
ứng trong các lĩnh vực áp dụng miễn dịch học vào mục đích chẩn đoán và điều trị
[6, 7, 9]. Các globulin miễn dịch được chia thành 5 lớp là IgG, IgA, IgM, IgD và
IgE. Trong số này, IgG có hàm ỉượng lớn nhất, chiếm khoảng 80% tổng số các Ig
của huyết tương người bình thường, với nồng độ trung bình khoảng 12 mg/ ml. Số
IỚI1 các kháng thể lưu động đều thuộc lớp IgG.
Chúng tôi đã tiến hành xác địnli khả năng liên kết đặc hiệu của lectin sam
hằng cách tiến hành song song hai thí nghiệm vói IgG và ĩgA từ huyết thanh người
bình thường (qua xét nghiệm của bệnh viện đểu là những người không mắc bệnh
ung thư hoặc truyền nhiễm). Hai thí nghiệm này, cũng giống như các Ihí nghiệm
sau đó, đều dùng lectin sam làm kháng nguyên gán bản trong kỹ thuật ELLA. Kỹ
thuật này vể cơ bản giống với kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang, nhưng thay vì gắn
BT6 0,021
1,014
BT 7 0,023 0,910
BT 8
0,051
0,936
Trung bìnli 0,035 0,942
Kết quả ở bảng 2 cho thấy có sự chênh lệch rất lớn trong mức độ nhận biết
hai lớp kháng thể IgA và IgG của lectin sam khi được sử dụng làm kháng nguyên
gắn bản. Độ hấp thụ quang trung bình của IgA (biểu hiện khi gắn chất cộng hợp
kháng IgA) là không đáng kể so với độ hấp ỉlụi quang trung bình của IgG (biểu
hiện khi gắn chất cộng hợp kháng ỉgG). Việc xác định hàm lượng các kháng thể
trong huyết thanh (kết quả được trình bày trên bảng 9) cho thấy có mối tương quan
tỉ lệ thuận giữa chúng với giá trị độ hấp thụ quang. Từ đó có thể rút ra kết luận:
-Lectin sam không nhận biết được IgA và không liên kết được với lớp kháng
thê này (hàng 3, 4 hầu như không bắt màu cùa bán thú ớ hình 4).
-Lectin sam kếl hợp đặc hiệu với IgG, và có thể được sử dụng để định lượng
IgG có trong huyết thanh (hàng I, 2 bắl màu lất đâm trên bản thử ở hình 4 chứng
tỏ lượng IgG được lectin giữ laị do lương lác đậc hiệu là lất lớn).
9
Hinh_3: Ảnh chụp kẽt quả xác định lượng IgA và IgG (từ huyết thanh
bình thường và huyết thanh bệnh) của lectin sam bằng kỹ thuật ELLA
1.2. Độ hấp thụ quang cùa Ig(ỉ được lectin sam nhận biết
3.4. Độ hấp thụ quang của IgÀ được lectin sam nhận biết
Kết quả thí nghiệm được minh hoạ bằng biểu đổ trên hình 4.
1
-
0.9 ■
0.8 •
0.7 ■
bệnh ung thư gan
0 I^492nm
BT 1
0,905 KG 1
0,934
BT2
0,918
KG 2
0,942
BT 3
0,975 KG 3
0,954
BT 4
0,943 KG 4 0,883
BT5
0,933 KG 5 0,861
BT6
1,014
KG 6 0,895
BT 7
0,910
KG 7 0,875
BT 8 0,936 KG 8
0,828
Trung bìnli
0,942 Trung bình
0,901
Kết quả trên đây cho thấy không có sự khác biệt đáng kể về lượng IgG trong
huyết thanh người bị bệnh ung thư gan và người không mắc bệnh này qua khả năng
liên kết được với lectin sam của chímg. Đây mới chỉ ỉà kết quả bước đàu và cần
KV 4 0,431
Trung bình
0,936
Trung bình 0,660
Hình 4 : Biểu đồ so sánh (lộ hấp thụ quang tủa ỉg(ỉ (từ huyết thanh
người bình thường và ngưòi bệnh ung tlur vú) liên kết lectin sam
l.f)ộ hấp thụ quang của IgG từ huyết thanh Iiguiri bình thường.
2 .ĐỘ hấp thụ quang của Ig(ỉ từ huyết tlianli nguòi bị bệnh ung thư vú.
Kết quả trên cho thấy cổ sự giám mạnh (30%) hàm lượng IgG trung bình
trong huyết thanh Iigirời mắc bệnh ung thư vú so với người bình thường. Số bệnh
phẩm thử nghiệm còn quá ít, và có lliể tất cả đã ớ trong giai đoạn suy giảm đáp ứng
miễn dịch.
13
Thí nghiệm được tiến hànli với 4 mẫu huyết thanh người bị bệnh ung thư máu.
so sánh với 4 mẫu huyết thanh người bình thường. Kết quả được trình bày trên
bàng 5.
Iiáng 5 : Độ hấp tliụ qiiiing cua Ig(ì từ huyết thanh người bệnh ling thư
máu liên kết lectin sam
Mầu huyết
thanh bình
thường
OD4921U11
Mầu huyết thanh
bệnh ung thư máu
{)^492nni
BTI 0,423
KM1 0,373
BT2
0,458 KM2 0,502
BT3
0,288
BT2
0,370
KM 2
0,206
BT3
0,544
KM 3
0,965
BT 4
0,720 KM4
0,372
BT 5 0,544 KM 5
0,648
BT 6
0,61 1 KM 6
0,467
BT7
0,714 KM 7
0,451
BT 8
0,535
KM 8
0,142
BT 9
0,393
KM 9
0,502
BT 10
0,452
CNT _ _
g 0.3
o 02
0.1
0
Hình 5: Biểu đồ so sánh (íộ hấp thụ quang của IgG (từ huyết thanh
người bình thường và người bệnh ung thư máu) khi sử tlụng lectin sam thô
l.Độ hấp thụ quang cua ĩgG từ huyết thanh bìnli thưiYng.
2.ĐỘ hấp thụ quang của IgG tù huyết thanh bệnh ung thư máu.
Kết quả cho thấy với lectin sam ở dạng thô, đã phát hiện được mức chênh lệch
rõ rệt hơn trong độ hấp thụ quang của IgG lừ huyết thanh người bệnh ung thư máu
so với người thường, với mức giam h ung bình khoảng 10%.
Trên đây mới chỉ là kết quả cùa những thử nghiệm ban đầu về khả năng phát
hiện một số bệnh ung thư của lectin sam, dựa Irên sự thay đổi trong hệ thống niiển
dịch dịch thể, liên quan đến hàm lượng bất thường của lớp kháng thể IgC Các tác
giả nghiên cứu về miễn địch học trong các bệnh của tuyến giáp nhận thấy kháng
thể thuộc hai lớp IgG và IgM tăng cao, còn ở bệnh viêm gan cũng như ung thư gan
thì kháng thể lớp IgA lại tăng gấp 2-3 lần. Hầu như mọi nghiến cứu về miễn dịch
học chống ung thư đều đi đến kết luận rằng các yếu tố miễn dịch tế bào thể hiện
vai trò rõ hơn là các yếu tố miễn dịch dịch thể [7, 9], Do vậy để có thể đi đến
những kết quả có tính khẳng định về biểu hiện cua các loại bệnh ung thư này, cần
phải điều tra với số lượng bệnh nhăn lớn hơn. kết hợp với sự theo dõi lâm sàng
trong từng giai đoạn phát triển của bệnh.
16
Cho đến nay bệnh sởi vẫn là bệnh phổ biến mà thế giới và Việt nam đang
quan tâm, đạc biết đối VƠI sự đáp ứng miễn địch của trẻ em trong bênh này. Muc
đích của các nhà miễn dịch học là xem xét và đánh giá hiệu giá kháng thể IgG
khang SƠI tiong mục tiêu giam sat và tiêm chúng phòng bênh. Hiện nay các phòng
thi nghiệm vân dựa vao smh phâm đê chân đoán bênh, tvong đó sử dung kháng
nguyên virut sỏi để gắn bản với mục đích xác định IgG kháng sởi. Khi đó người ta
BS 2
0,272
BT3
0,170
VN 3
0,128
BS 3
0,155
BT4
0,214
VN4
0,154
Trung bình
0,180
Trung bình
0,147
Trung bìnli
0,228
1 ' ' I u O' JOC G■ A Hm M
^ i ! ‘, 'T .~ 'N 7 ,JLr" ■'
.
I 0 0 0 W
17
ồ so sánh độ hấp thụ quang cua IgG (từ HTBT, HTVN
và HTIỈS) liên kết lectin sam
p thụ quang của Ig(ĩ từ huyết thanh bình thường,
ấp thụ quang của IgCỈ từ huyết thanh viêm não.
lấp thụ quang của IgG tù huyết thanh bệnh sởi.
thấy có sự chêiứi lệch khá rõ trong độ hấp thụ quang trung
loại mẫu huyết thanh: của bệnh viêm não giảm 18%, còn của
thương ở thận vừa do cơ chê lảng đọng phức hợp miễn dịch (kháng nguyên cố định
tại tổ chức) vừa do cơ chế kháng thể trực tiếp làm tổn thương tế bào đích [7, 9],
Chúng tôi đã tiến hành xét nghiêm ELLA trên các mẫu huyết thanh người
mắc bênh lupus ban đỏ- một bệnh tư miễn khá phổ biến ở Việt nam. Kết quả được
trình bày trên bảng 8.
5.Sủ dụng lectin sam đé xác định IgG trong huyết thanh nguòi
mắc bệnh tụ miễn
19
Copyright: Tài liệu đại học ©