ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THANH TÒNG KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN LIÊN QUAN ĐẾN
TÍNH KHÁNG THUỐC VÀ ĐỘC LỰC CỦA CÁC CHỦNG
STREPTOCOCCUS SUIS SEROTYPE 2 PHÂN LẬP
TỪ BỆNH NHÂN VÀ HEO TẠI VIỆT NAM
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 40
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. NGÔ THỊ HOA Thành phố Hồ Chí Minh–Năm 2012 Lời cảm ơn
Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với TS. Ngô Thị Hoa,
người thầy đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành
luận văn này.
Tiếp theo, tôi xin cảm ơn ThS. Trần Thị Bích Chiêu, một người chị luôn luôn
trình sinh bệnh của Streptococcus suis phụ thuộc rất nhiều vào các yếu tố độc lực và
yếu tố vật chủ. Tại Việt Nam, chưa có khảo sát nào so sánh độc lực giữa các chủng
phân lập từ người với các chủng phân lập từ heo.
Chính vì vậy, với mong muốn hiểu rõ hơn về tình hình kháng thuốc và các
yếu tố độc lực, tôi đã thực hiện đề tài:
“Khảo sát đặc điểm di truyền liên quan đến tính kháng thuốc và độc lực
của các chủng Streptococcus suis serotype 2 phân lập từ bệnh nhân và heo tại
Việt Nam”. Trang 2Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thanh Tòng
Mục tiêu nghiên cứu
− Khảo sát tính kháng thuốc và cơ chế kháng của các chủng Streptococcus suis
phân lập từ bệnh nhân và heo.
− Khảo sát các gen độc lực của Streptococcus suis, từ đó biết được kiểu gen
thường gây bệnh cho người và heo đang lưu hành tại Việt Nam.
Mục tiêu phụ:
So sánh tính kháng thuốc và đặc điểm di truyền của các chủng Streptococcus
suis phân lập từ người và heo nhằm khảo sát sự tương đồng giữa các chủng.
Ý nghĩa đề tài
− Cung cấp những thông tin về tình hình kháng thuốc, từ đó góp phần vào quá
trình phòng và điều trị bệnh nhiễm Streptococcus suis ở người và heo.
Giống Streptococcus
Loài Streptococcus suis
Streptococcus suis (S. suis) hay liên cầu khuẩn heo là cầu trùng gram dương,
dạng liên cầu nhưng đôi khi ở dạng đơn hoặc dạng đôi, kỵ khí tùy ý, mọc trên môi
trường thạch máu ở 37
0
C và 5 – 10% CO
2
. Trên môi trường thạch máu, S. suis tạo
khuẩn lạc nhỏ, màu xám với đường kính 0,5 – 1 mm. S. suis sản xuất yếu tố dung
huyết kiểu alpha trên môi trường thạch máu cừu và yếu tố dung huyết kiểu beta trên
môi trường thạch máu ngựa [51].
Đến nay, bộ gen S. suis đã được giải trình tự hoàn toàn có kích thước khoảng
2.007.491 bp với tỷ lệ GC là 41,3%. Trong đó, khoảng 20 – 30% số lượng gen vẫn
chưa biết rõ chức năng. Do đó, các nhà nghiên cứu đề nghị rằng chúng có liên quan
đến các yếu tố độc lực và quá trình phát sinh bệnh [34].
Trang 4Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thanh Tòng
Dựa vào kháng nguyên vỏ nang, S. suis được chia thành 35 serotype khác
nhau, được đánh số từ 1 đến 34 và serotype ½. S. suis serotype ½ là chủng thể hiện
kết quả dương tính với cả hai phản ứng ngưng kết kháng huyết thanh đặc hiệu cho
serotype 1 và serotype 2 [25]. Chỉ một vài trong số 35 serotype chịu trách nhiệm
gây bệnh ở heo bao gồm các serotype 1, 2, 3, 7, 8, 9 và 14 [38], [64]. Trong đó, S.
suis serotype 2 (S. suis 2) là độc lực nhất do nó được phân lập thường xuyên nhất
trên bệnh nhân và heo bệnh [20], [34]. Gần đây, dựa vào kết quả phân tích trình tự
gen chaperonin 60 (cpn60) và 16S rRNA, một số nghiên cứu cho rằng S. suis
serotype 32 và serotype 34 là thuộc loài Streptococcus orisratti [26].
Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thanh Tòng
1.2.2. Tình hình nhiễm S. suis trên heo
Heo ở bất kỳ lứa tuổi nào cũng có thể nhiễm S. suis. Khả năng nhiễm và gây
bệnh của vi khuẩn ở heo con cao hơn heo trưởng thành. Khoảng 81% heo sau cai
sữa (4 đến 10 tuần tuổi) nhiễm S. suis nhưng không phải tất cả đều phát sinh bệnh,
chỉ một số ít trong chúng mang chủng có khả năng gây bệnh [11]. Heo bệnh thường
tập trung trong giai đoạn sau cai sữa vì đây là giai đoạn heo con không còn nhận
kháng thể bảo vệ từ sữa mẹ. Dấu hiệu heo bệnh do nhiễm S. suis là sốt (có thể lên
đến 42
0
C), biếng ăn, suy nhược, đi đứng khập khiễng, khó thở, nổi ban đỏ và
thường chết một cách đột ngột [10]. Tỷ lệ chết trong đàn có thể lên đến 20% nếu
tình trạng vệ sinh chuồng trại kém, thiếu các biện pháp phòng ngừa và điều trị [11].
Tại Việt Nam, theo nghiên cứu của TS. Ngô Thị Hoa và cộng sự về tình hình
mang trùng ở heo, kết quả phân lập được 317 chủng S. suis thuộc nhiều serotype
khác nhau. Trong đó, các chủng thuộc serotype 2 chiếm tỷ lệ cao nhất khoảng
14,2% [27]. Trong tình trạng mang trùng, S. suis có thể gây bệnh khi gặp các điều
kiện thuận lợi như cơ thể vật chủ bị suy yếu do mắc các bệnh truyền nhiễm khác.
Những nghiên cứu gần đây cho thấy rằng sự nhiễm virus gây hội chứng rối loạn
sinh sản và hô hấp (PRRSV) sẽ làm tăng tính mẫn cảm của heo đối với S. suis [14].
1.2.3. Tình hình nhiễm S. suis ở người trên thế giới và tại Việt Nam
Vào năm 1968, trường hợp nhiễm S. suis ở người được mô tả đầu tiên tại
Đan Mạch. Sau đó, bệnh do S. suis được ghi nhận như một bệnh lây truyền từ động
vật sang người tại nhiều nước trên thế giới. Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể thông
qua vết thương trên da hoặc qua niêm mạc của khoang mũi miệng. Bệnh nhân
nhiễm S. suis được tìm thấy thường xuyên hơn ở các vùng nuôi heo tập trung.
Những người làm nghề chăn nuôi, giết mổ và bán thịt heo có nguy cơ nhiễm S. suis
cao gấp 1500 lần so với những người làm các nghề khác [20].
Hầu hết các trường hợp viêm màng não mủ trên thế giới và Việt Nam chủ
yếu do S. suis serotype 2 gây ra. Bên cạnh đó, S. suis thuộc những serotype như 4,
14 và 16 cũng gây bệnh cho người nhưng chiếm một tỷ lệ rất thấp [3], [23], [39].
1.3. Các yếu tố độc lực
S. suis dễ dàng xâm nhiễm và gây bệnh là nhờ vào các yếu tố độc lực như
polysaccharide vỏ nang, suilysin, hệ thống truyền tín hiệu hai thành phần
SalK/SalR Chúng giúp vi khuẩn chống lại hệ miễn dịch của ký chủ. Do đó, việc
nghiên cứu các yếu tố độc lực sẽ làm sáng tỏ cơ chế sinh bệnh của vi khuẩn.
1.3.1. Polysaccharide vỏ nang
Khi S. suis xâm nhập vào mô hoặc dòng máu, chúng sẽ đối mặt với những tế
bào thuộc hệ thống miễn dịch bẩm sinh và miễn dịch thích ứng. Tuy vậy, thực tế lại
không có sự hiện diện những kháng thể đặc hiệu. Điều đó cho thấy rằng S. suis có
thể kháng lại quá trình thực bào và tồn tại dai dẳng với nồng độ cao trong máu, dẫn
đến hậu quả nhiễm trùng máu, sốc độc tố và viêm nhiễm tại các cơ quan. Sự tồn tại
đó của vi khuẩn phụ thuộc rất lớn vào sự tổng hợp polysaccharide vỏ nang. Những
thí nghiệm in vitro và in vivo về những chủng đột biến gen cps (capsular
polysaccharide), kết quả cho thấy rằng sự vắng mặt polysaccharide vỏ nang làm
tăng tính thực bào và vi khuẩn nhanh chóng bị loại khỏi dòng máu [44], [47]. Như
Trang 8Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thanh Tòng
vậy, vỏ nang đóng một vai trò rất quan trọng trong việc giúp vi khuẩn thoát khỏi các
tế bào thuộc hệ thống miễn dịch.
Thành phần polysaccharide vỏ nang được cấu tạo từ 5 loại đường: galactose,
glucose, rhamnose, N-acetyl galactosamine và acid sialic (acid N-acetyl
neuraminic). Vỏ nang serotype 1 khác serotype 2 về đường N-acetyl glucosamine
thay cho rhamnose [12]. Vỏ nang S. suis tương tự Streptococcus nhóm B đều chứa
gốc acid sialic. Acid sialic ở Streptococcus nhóm B liên kết 2-3 với galactose nhưng
Ngoài việc phá hủy những tế bào biểu mô và những tế bào thuộc hệ miễn
dịch, suilysin còn phóng thích hemoglobin do ly giải tế bào hồng cầu. Sự hiện diện
của hemoglobin cùng với thành phần vách tế bào tạo nên phản ứng viêm rất mạnh
mẽ bằng cách kích thích đại thực bào và tế bào bạch cầu sản xuất những cytokine
gây viêm như TNF-α, IL-1β, IL-6 và IL-12. Sự tiết quá nhiều cytokine nếu không
được kiểm soát sẽ dẫn đến hiện tượng sốc nhiễm trùng. Ngoài ra, những cytokine
này còn tham gia vào quá trình gây viêm màng não như IL-1β giúp tăng cường tính
thấm của hàng rào máu não nên vi khuẩn dễ dàng xâm nhập vào hệ thần kinh trung
ương, TNF-α thúc đẩy sự viêm tại không gian gần màng nhện và nồng độ IL-6
trong dịch não tủy cao có nguy cơ dẫn đến tử vong [53].
Tuy nhiên, vào năm 2003, Lun và cộng sự đã tiến hành khảo sát vai trò của
suilysin trên heo bằng cách sử dụng những chủng đột biến gen sly nhưng kết quả
không có sự giảm độc tính [33]. Hơn nữa, hầu hết chủng phân lập từ bệnh nhân và
heo bệnh tại Bắc Mỹ không chứa gen sly [7], [43]. Do đó, suilysin không phải là
yếu tố độc lực duy nhất và mang tính phổ quát của S. suis 2.
1.3.3. Protein phóng thích muramidase (muramidase released protein –
MRP) và yếu tố protein ngoại bào (extracellular protein factor – EF)
Vecht và cộng sự đã nghiên cứu protein của các chủng S. suis 2 phân lập từ
heo mang trùng và heo bệnh, kết quả cho thấy khoảng 77% chủng phân lập từ heo
bệnh chứa protein phóng thích muramidase (MRP) và yếu tố protein ngoại bào (EF)
nhưng khoảng 86% chủng phân lập từ heo mang trùng không chứa cả 2 protein trên.
Những chủng có kiểu hình MRP
+
EF
+
có tiềm năng độc lực hơn so với những chủng
Trang 10Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thanh Tòng
+
[65]. Tuy nhiên, vaccine dạng này không hữu ích đối
với những chủng độc lực ở Bắc Mỹ vì những chủng này không biểu hiện MRP và
EF [17], [18].
Trang 11Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thanh Tòng Hình 1.2: Sự hiện diện các đoạn lặp lại trong trình tự của các EF* và EF.
(R1 đến R11 là những đoạn lặp lại. E: EcoRV, P: PstI, S: SnaBI)
[48]
1.3.4. Hệ thống truyền tín hiệu hai thành phần SalK/SalR
Lịch sử y học thế giới đã từng chứng kiến hai trận dịch lớn do S. suis 2 gây
ra tại tỉnh Giang Tô (1998) và tỉnh Tứ Xuyên (2005) ở Trung Quốc. Ngoài viêm
màng não và nhiễm trùng huyết, một tỷ lệ lớn các bệnh nhân trong hai trận dịch này
có biểu hiện hội chứng sốc độc tố (toxic shock like syndrome). Đây chính là điểm
khác biệt so với những bệnh nhân nhiễm S. suis ở những nơi khác. Năm 2007, Chen
và cộng sự đã phát hiện được đảo gen độc lực 89K (PAI - pathogenicity island) chỉ
hiện diện trong những chủng phân lập từ hai trận dịch tại Trung Quốc [8]. Những cơ
Trang 12Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thanh Tòng
chế phân tử như quorum sensing, hệ thống truyền tín hiệu hai thành phần và hệ
thống vận chuyển ABC thường liên quan đến đảo gen độc lực này. Do vậy, đảo gen
độc lực có thể đáp ứng lại những tín hiệu đối với môi trường bên ngoài và thực hiện
các chức năng then chốt góp phần vào độc lực của tác nhân gây bệnh. Phân tích
hoang dại. Hơn nữa, SalK/SalR có thể kiểm soát tính độc lực của S. suis 2 bằng
cách điều hòa biểu hiện gen ở mức độ trên toàn bộ bộ gen [32].
Hình 1.4: Sự khác biệt về trình tự promoter salKR giữa chủng S. suis phân lập
tại Việt Nam với chủng S. suis phân lập tại Trung Quốc.
(P1: promoter salKR Trung
Quốc, P2: promoter salKR Việt Nam)
Trang 14Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thanh Tòng
Theo nghiên cứu của TS. Ngô Thị Hoa và cộng sự, vùng upstream của salKR
đối với các chủng phân lập tại Việt Nam bị mất một đoạn khoảng 5 Kb bao gồm
promoter salKR so với các chủng phân lập tại Trung Quốc (kết quả chưa công bố).
Do đó, nhóm nghiên cứu đã xác định một promoter tiềm năng cho salKR đối với
các chủng phân lập tại Việt Nam (Hình 1.4).
1.4. Quá trình sinh bệnh của S. suis
1.4.1. Khu trú tại đường hô hấp trên và xâm nhập vào tế bào biểu mô
của ký chủ
S. suis có thể tồn tại dai dẳng và thoát khỏi hệ thống miễn dịch của heo sau
khi xâm nhập và cư ngụ tại amidan. Ở amidan, S. suis khu trú trong những hốc được
hình thành bởi tế bào biểu mô thuộc mô lympho lõm sâu vào [42].
Miễn dịch qua trung gian IgA đóng một vai trò quan trọng trong việc chống
lại những tác nhân gây bệnh xâm nhập qua biểu mô màng nhầy. Tuy nhiên, S. suis
có khả năng sản xuất IgA1 protease nên chúng có thể thoát khỏi hệ thống bảo vệ
này. Những chủng đột biến mất khả năng sản xuất IgA1 protease giảm độc lực một
cách đáng kể và không gây chết heo. Ngoài ra, vi khuẩn còn lợi dụng sự phóng
thích những phân đoạn Fab từ sự phân cắt IgA để tăng cường tính kỵ nước trên bề
mặt nhằm giúp cho việc bám vào tế bào chủ tốt hơn [61], [66].
Trang 16Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thanh Tòng
Hình 1.5: Sự tương tác giữa Streptococcus suis với tế bào biểu mô và những
protein chất nền ngoại bào [15].
1.4.2. Tồn tại trong máu và lan tràn đến các cơ quan
Một khi xâm nhập sâu vào trong mô hoặc dòng máu, vi khuẩn sẽ tăng điều
hòa biểu hiện polysaccharide vỏ nang và tất cả những protein liên quan đến quá
trình kháng lại đáp ứng miễn dịch (Hình 1.6).
Polysaccharide vỏ nang giúp vi khuẩn kháng lại thực bào. Một cơ chế khác
trong việc thoát khỏi đáp ứng miễn dịch là gắn vào đại thực bào thông qua acid
sialic. Sự tiết suilysin làm giảm thực bào bằng cách ly giải bạch cầu đơn nhân và
bạch cầu trung tính. S. suis cũng có thể ngăn cản sự chiêu mộ của bạch cầu trung
tính bằng cách phân hủy IL-8 nhờ vào serine protease SspA [55]. DNase neo trên
vách tế bào S. suis có hoạt tính phân cắt DNA mạch đôi hoặc mạch đơn [16]. Điều
này góp phần làm tăng thêm tính độc lực cho vi khuẩn trong việc phá vỡ “bẫy”
DNA của bạch cầu trung tính (neutrophil extracellular traps) [60]. Tuy nhiên, nếu bị
thực bào do hiện diện với một số lượng rất thấp thì S. suis vẫn còn sở hữu những
yếu tố khác góp phần kháng lại cơ chế giết nội bào như superoxide dismutase và hệ
thống arginine deiminase [22].
Trang 17Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thanh Tòng
Hình 1.6: Streptococcus suis thoát khỏi đáp ứng miễn dịch bẩm sinh của tế bào
Các cơ chế tác động của kháng sinh (Hình 1.7):
- Ức chế sự tổng hợp vách tế bào như penicillin, glycopeptide và
cephalosporin. Các loại kháng sinh trong những nhóm này tác động lên quá trình
tổng hợp vách tế bào nên vi khuẩn dễ dàng bị phá vỡ do sự thay đổi áp suất thẩm
thấu và bị các đại thực bào tiêu diệt.
- Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein:
Aminoglycoside gắn vào thụ thể trên tiểu đơn vị 30S ribosome làm cho quá
trình dịch mã không chính xác.
Tetracyclin gắn vào tiểu đơn vị 30S ribosome ức chế sự gắn aminoacyl-
tRNA vào vị trí tiếp nhận.
Phenicol gắn vào tiểu đơn vị 50S ribosome ức chế enzyme
peptidyltransferase do đó ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào chuỗi
polypeptide.
Macrolide và lincosamide gắn vào tiểu đơn vị 50S ribosome ngăn cản quá
trình dịch mã.
- Ức chế sự tổng hợp acid nucleic:
Quinolone ức chế DNA gyrase hoặc topoisomerase IV làm cho hai mạch của
DNA không thể duỗi xoắn dẫn đến việc ngăn cản quá trình nhân đôi DNA.
Trimethoprim ức chế enzyme dihydrofolate reductase của vi khuẩn nên ức
chế tổng hợp acid tetrahydrofolic, tiền chất của thymidine monophosphate.
1.5.3. Vi khuẩn kháng kháng sinh
- Kháng tự nhiên:
Vi khuẩn đã có sẵn tính kháng trước khi tiếp xúc với kháng sinh.
Cấu trúc thành tế bào của vi khuẩn không thấm với kháng sinh.
Trang 19Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thanh Tòng
- Kháng mắc phải:
Protein synthesis
(30S inhibitors)
Tetracycline
Streptomycin
Spectinomycin
Phospholipid membrane
Polymyxins
Trang 20Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thanh Tòng
1.5.4. Các cơ chế kháng đối với tetracyclin ở Streptococcus
Cơ chế kháng tetracyclin ở Streptococcus phụ thuộc vào hai cơ chế chính: cơ
chế bảo vệ ribosome và cơ chế bơm tetracyclin ra khỏi tế bào. Những protein bảo vệ
ribosome thường được mã hóa bởi các gen tet(M) và tet(O), chúng có nhiệm vụ đẩy
tetracyclin ra khỏi ribosome để quá trình dịch mã được diễn ra liên tục. Cơ chế bơm
tetracyclin ra khỏi tế bào thông qua hệ thống bơm xuyên màng thường được mã hóa
bởi các gen tet(K) và tet(L).
Trong số các gen qui định tính kháng tetracyclin, gen tet(M) được phân bố
một cách rộng rãi nhất ở vi khuẩn Gram dương và Gram âm (42 giống vi khuẩn). Sự
phân bố này liên quan đến những yếu tố có khả năng tiếp hợp và sát nhập như ICE
(integrative and conjugative element) và transposon (họ Tn916 – Tn1545).
Transposon là những đoạn phân tử DNA có thể chèn vào tại một hoặc vài vị trí
trong bộ gen. Cấu trúc transposon bao gồm hai đầu chứa các trình tự lặp lại, bên
trong chứa các gen kháng thuốc và các gen cần thiết cho việc chuyển vị như gen xis
mã hóa excisionase có nhiệm vụ cắt DNA, gen int mã hóa integrase có nhiệm vụ sát
nhập và nối DNA. Những nghiên cứu trước đây cho thấy rằng gen tet(M) có mối
liên hệ mật thiết đối với transposon Tn916 [41] (Hình 1.8).
Biện pháp phòng ngừa nhiễm S. suis ở người chủ yếu là kiểm soát dịch bệnh
ở heo. Trong đó, việc kiểm dịch trong chăn nuôi và giết mổ heo đóng một vai trò rất
quan trọng nhằm ngăn chặn sự lây lan từ heo sang người [34].
Trang 22Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thanh Tòng
Việc sử dụng thuốc chủng ngừa nhiễm S. suis cho heo cũng đang được triển
khai một cách rộng rãi. Các vaccine được sử dụng bao gồm chủng ngừa và phun khí
dung gây miễn dịch niêm mạc để phòng ngừa nhiễm trùng hô hấp ở heo. Tuy nhiên,
hiệu quả vaccine vẫn chưa cao [34].
Hiện nay, chúng ta vẫn chưa có vaccine phòng bệnh cho người. Do đó, nhằm
ngăn chặn nhiễm bệnh cho người, bên cạnh việc phát hiện, tiêu diệt nguồn bệnh,
việc tuyên truyền giáo dục sức khoẻ cho người dân cũng cần được tăng cường, nhất
là trong thời điểm xảy ra dịch bệnh. Theo khuyến cáo của WHO chỉ nên sử dụng
thịt heo sau khi đã nấu chín trên 70
o
C.
AMI, CRO, FEP, AMX,
PEN, AMP, VAN, CLI
và SPT
MP-PCR:
tet(M), tet(O),
tet(L) và tet(K)
PCR: Tn916
và tetM-rev-2
[tet(M) (+)]
MP-PCR:
erm(B), erm(A)
và mef(A/E)
MP-PCR: cps2J,
sly, epf và mrp
Giải trình tự:
những gen epf
biến thể
PCR: phát hiện
biến thể mrp
PCR: salKR
PCR: promoter
SalK/SalR
(Trung Quốc)
PCR: promoter
SalK/SalR
(Việt Nam)
Copyright: Tài liệu đại học ©