Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
1
MỞ ĐẦ U
1. L do chn đ ti
Nhiễ m vi khuẩ n lao (Mycobacterium tuberculosis) l mt trong nhng
nhiễ m trù ng phổ biế n nhấ t ở loà i ngườ i . Hiệ n nay tỷ lệ nhiễ m vi khuẩ n lao
đượ c xá c đị nh là chiế m 1/3 dân số thế giớ i . C khong 9 triệ u ngườ i mắ c lao
mớ i và hơn 3 triệ u ngườ i chế t do lao mỗ i năm . Tuy vậ y tỷ lệ phá t hiệ n chỉ đạ t
37% số bệ nh nhân ướ c tính . V vy cn rt nhiu bnh nhân lao không đưc
chữ a trị và đang tiế p tụ c là m lây lan bệ nh cho c ng đng.
Hiệ n nay, bệ nh lao đang trở nên nghiêm trọ ng hơn vớ i đặ c trưng là khá ng
đa thuố c. Trong cá c trườ ng hợ p bệ nh lao khá ng đa thuố c, kh khăn không ch l
điề u trị thấ t bạ i cao , dẫ n đế n lan truyề n nhanh chó ng vi khuẩ n lao khng đa
thuố c mà cò n chưa tì m ra đượ c nhữ ng thuố c thay thế hiệ u quả và hợ p lý , trong
khi cá c thuố c chố ng lao thự c sự có hiệ u quả chỉ tậ p trung có 5 thuố c.
Nhữ ng bệ nh nhân bị nhiễ m cá c chủ ng vi khuẩ n lao khá ng đa thuố c rấ t
kh điu tr. Do đó việ c phá t hiệ n sớ m cá c chủ ng vi khuẩ n lao khá ng đa thuố c
s gp phn đng k trong điu tr bnh lao .
Để ch n đon vi khun lao khng thuc , hiệ n nay cá c cơ sở trong
nướ c vẫ n phả i dự a và o nuôi cấ y vi khuẩ n và là m khá ng sinh đồ . Thờ i gian
chuẩ n đoá n lao khá ng thuố c cầ n í t nhấ t 4 – 6 tuầ n. Vớ i thờ i gian dà i như
vậ y sẽ khó khăn cho công tá c điề u trị , kh đp ng yêu cu gim st v
thanh toá n bệ nh lao .
Khắ c phụ c nhữ ng nhượ c điể m đó , việ c ứ ng dụ ng sinh họ c phân tử đang
to ra nhng đt ph trong chn đon vi khun lao khng thuc . Thờ i gian
chẩ n đoá n có thể rú t ngắ n xuố ng cò n và i ngà y , vớ i độ nhậ y và độ đặ c hiệ u
cao, to điu kin cho việ c kiể m soá t bệ nh lao dễ dà ng hơn .
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
2
Cc nghiên cu v sinh hc phân t trong chn đon vi khun lao
khng thuc đ ch ra rng mi loi khng thuc l do cc gen tương ng chu

lng quên căn bnh nguy him ny. Ngy nay, bnh lao đang xut hin trở
li v cùng với đi dch HIV/AIDS trở thnh mt trong nhng căn nguyên
gây mắc bnh v t vong ch yu, đặc bit ti cc nước đang pht trin.
Năm 1993, T chc Y t th giới (TCYTTG) đ tuyên b tnh trng
khn cp ton cu ca bnh lao v mi him ho ca n trong tương lai l
bnh lao khng thuc [22].
Hin nay, trên th giới c khong 2,2 tỷ người đ nhiễm lao (chim 1/3
dân s th giới). Theo s liu công b ca TCYTTG (2004), ước tnh trong
năm 2003 c thêm khong 9 triu người mắc lao mới v 2 triu người cht
do lao. Khong 95% s bnh nhân lao v 98% s người cht do lao ở cc
nước c thu nhp vừa v thp, 75% s bnh nhân lao c nam v n ở đ tui
lao đng. Trong đ, c khong 80% s bnh nhân lao ton cu thuc 22
nước c gnh nặng bnh lao cao [1,22].
Hin nay, tỷ l điu tr thnh công trên ton cu đt 82%, nhưng tỷ l
pht hin ch đt 37% s bnh nhân ước tnh. Như vy, cn rt nhiu bnh
nhân lao không đưc cha tr đang tip tục lây bnh cho cng đng, v theo
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
4
ước tnh ca TCYTTG, mi năm c thêm 1% dân s th giới b nhiễm lao
(65 triu người) [22].
Hơn 33% s bnh nhân lao ton cu ti khu vc Đông nam Châu Á.
Dưới đây l ước tnh bnh nhân lao mới mắc năm 2002 theo khu vc [22].
Bng 1.1: Ƣc tính bnh nhân lao mi mắc năm 2002 theo khu vực
Khu vực
Số BN (nghn) Tỷ l/100 000
Tử vong do lao
(bao gồm cả nhiễm HIV)
Các thể
AFB
(+)

8797
(100%)
3887 141 63 1823 29

Mc đ nặng n ca bnh lao đ nh hưởng tới thu nhp quc dân v
ch s pht trin con người ca cc quc gia. Cc nghiên cu v kinh t y t
cho thy, mi bnh nhân lao s mt trung bnh 3-4 thng lao đng, lm gim
20-30% thu nhp bnh quân ca gia đnh. Nhng gia đnh c người cht sớm
v bnh lao c th s mt tới 15 năm thu nhp. Bnh lao đ tc đng mnh
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
5
tới 70% đi tưng lao đng chnh ca x hi, lm lc lưng sn xut b gim
sút, năng sut lao đng gim v mùa mng, ch ba s không tham gia đưc.
Diễn đn cc đi tc chng lao ln th nht diễn ra năm 2001 ti trụ sở ca
ngân hng th giới ở Washington D.C với s c mặt ca đi din cp B
trưởng từ cc quc gia c tnh hnh bnh lao nặng n đ nhn đnh, bnh lao
l nguyên nhân ch yu lm nghèo đi dai dẳng v l trở ngi đi với s
pht trin kinh t x hi [22].
Bnh lao l bnh ca người nghèo, lây lan nhanh trong cng đng c
điu kin sng cht chi, thiu v sinh, thông kh v dinh dưỡng kém. Trên
95% s bnh nhân lao, 98% s cht do lao trên ton cu thuc cc nước c
thu nhp vừa v thp, 75% s người mắc bnh lao ở cc la tui 14-55, là
tui lm ra nhiu ca ci nht trong cuc đời [1, 22].
Bnh lao l kt qu ca nghèo đi v nghèo đi li l nguyên nhân lm
cho bnh lao pht trin.
1.1.2. Tnh hnh bnh lao  Vit Nam
Ở nước ta, bnh lao cn ph bin v ở mc đ trung bnh cao. Vit
Nam đng th 13 trong 22 nước c s bnh nhân lao cao trên ton cu
(TCYTTG, 2004). Trong khu vc Tây Thi Bnh Dương, Vit Nam đng th
ba sau Trung Quc v Philipinnes v s lưng bnh nhân lao lưu hnh cng

cao thnh tch đt đưc trong mi hot đng chng lao. Từ năm 1997,
TCYTTG và hip hi bài lao và bnh phi quc t cùng phi hp với
CTCLQG Vit Nam t chc 8 kho hc v qun lý Chương trnh chng lao
cho cc hc viên quc t ti Vit Nam. Mô hnh hot đng chng lao ở Vit
Nam đưc xem l mô hnh đ hc viên cc nước hc tp [4].
V l mt trong s t nước sớm nht đt đưc cc mục tiêu phng chng
lao do TCYTTG đ ra, nhng kt qu đt đưc c tnh bn vng, nên thng 10
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
7
năm 2003 vừa qua CTCLQG Vit Nam đ nhn đưc gii thưởng ca hi
chng lao hoàng gia Hà Lan (KNCV) nhân lễ kỷ nim 100 năm ngy thnh
lp t chứ c này.
Nhân ngày th giới chng lao, 24/3/2004, ti diễn đn cc đi tc chng
lao ln th 2 do TCYTTG t chc ti New Dehli, CTCLQG Vit Nam l mt
trong 6 nước trên th giới (bao gm: Vit Nam, Peru, Madives, Cuba, Tunisia
v Morocco) v l nước duy nht trong 22 nước c gnh nặng bnh lao cao
đưc nhn gii thưởng ca TCYTTG v thnh tch đ đt đưc mục tiêu ca
TCYTTG v kt qu c tnh bn vng trên 4 năm [4].
Hin nay nguy cơ nhiễm lao hng năm ở nước ta ước tnh l 1,5% (ở
cc tnh pha nam l 2%, ở cc tnh pha bắc l 1%).
Ước tnh với dân s 70-80 triu, hng năm ở nước ta c mộ t s  lưng
lớ n người b mắ c lao mớ i . S lưng người mắc lao mớ i đưc th hiệ n qua
bng 1.2.
Bng 1.2: Bng ƣc tính s bnh nhân mắc lao mi qua mi năm  Vit Nam
S mới mắc lao (mi th): 130.000
S lao phi BK dương tnh mới: 60.000
Tng s trường hp lao: 260.000
Tng s lao phi BK dương tnh: 120.000

Nước ta thuc loi trung bnh v dch tễ lao so với cc nước vùng Tây

từ năm 1995 vớ i mụ c tiêu là xá c đị nh đượ c tổ ng số bệ nh nhân lao khá ng
thuố c trên thế giớ i bằ ng nhữ ng phương phá p thố ng nhấ t thử độ nhạ y vớ i thuố c
lao ca vi khun . Năm 1998, TCYTTG đã công bố kế t quả khả o sá t tình hình
vi khuẩ n lao khá ng thuố c ở 35 nướ c và khu vự c trên thế giớ i [6].
Theo công bố nà y, tỷ l khng thuc tiê n phá t trung bì nh vớ i riêng từ ng
loi thuc c khc nhau , cụ th l : khng isoniazid 3,2%, rifampicin 0,2%,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
9
ethambutol 0,3%, steptomycin 2,5% %, trong đó khá ng steptomycin ở vù ng
Ivanovo (Nga) l nơi khng đơn thuc cao nht . Tỷ l kh ng thuc tiên pht
trung bì nh là 9,9 % trong đó khá ng 1 thuố c chiế m 6,6 %, khng 2 thuố c chiế m
2,5 %, khng 3 thuố c chiế m 0,6 %, khng bn thuố c chiế m 0,2 %, khng đa
thuố c trung bình là 1,4 %. Tỷ l khng thuc tiên pht cao n hấ t 40,6 % ở cng
ha Dominica, thấ p nhấ t là 2% ở cng ha Séc [6].
Tnh hnh khng thuc mắc phi với từng loi thuc cng khc nhau :
khng isoniazid trung bì nh 6,3 %, rifampicin 0,7 %, ethambutol 0,4 %,
steptomycin 2,6 %. Khng thuố c mắ c phả i vớ i steptomycin ở Cuba có tỷ lệ
cao nhấ t 57 %. Tỷ l khng thuc mắc phi trung bnh trên ton th giới l 36
%, trong đ khng 1 loi thuc 12,2 %, 2 loi thuc 9,7 %, 3 loi thuc 5,4 %,
4 loi thuc 4,4 %. Lao khá ng đa thuố c mắ c phả i có tỷ lệ trung bì nh là 13 %.
Khng đa thuc mắc phi cao nht ở Latvia , c tỷ l 54 % [6].
Vi khuẩ n lao khá ng đa thuố c là mộ t thá ch thứ c lớ n , đe dọ a công cuộ c
phng chng lao trên ton cu , v cc thuố c chố ng lao có hiệ u quả hiệ n nay
đang bị vi khuẩ n lao khá ng lạ i nhấ t là khá ng đa thuố c . Trong khi cá c thuố c
chố ng lao hà ng đầ u chỉ có năm thuố c thì cá c thuố c chố ng lao loạ i hai lạ i
thườ ng có độ c tính cao và giá thà nh đắ t [5].
Việ c nghiên cứ u lao khá ng thuố c ở Việ t Nam đượ c tiế n hà nh khá sớ m .
Năm 1958 Phm Ngc Thc h và cộ ng sự đã công bố t ỷ lệ khá ng thuố c mắ c
phi v ới isoniazid l 53 %, vớ i paraminosalicylic acid l 26 %, vớ i
steptomycin là 59 % [6].

1.2.3. Kh năng gây bnh
Cc bnh lý nhiễm trùng l nguyên nhân gây t vong hng đu trên th
giới. Không ch c nhng bnh nhiễm trùng mới pht sinh m nhng bnh
nhiễm trùng c gây cht người đ bit từ lâu cng ti xut hin. Hơn na t l
vi khun gây bnh đ khng khng sinh ngy cng tăng cao l nguy cơ lớn
cho sc khỏe cng đng. Nhng bng chng gn đây cho thy cc tc nhân
gây bnh mặc dù rt khc nhau đu s dụng nhng phương thc chung đ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
11
pht đng qu trnh nhiễm trùng v gây bnh. Nhng cơ ch ny to nên đc
lc ca vi khun. Tm hiu cc cơ ch m vi khun s dụng đ xâm nhp v
gây bnh c ý ngha quan trng trong cuc chin chng li cc tc nhân bé
nhỏ ny [7].
Đc lc ca vi khun lao c liên quan đn “Cord factor” (trehalose –
6,6’ – dimycolate) l cht gây c ch hot đng ca t bo bch cu , gây nên
nhữ ng u hạ t mã n tính . Miễ n dị ch trong bệ nh lao ngà y nay đượ c xá c đị nh là
đá p ứ ng miễ n dị ch qua trung gian tế bà o . Đá p ứ ng miễ n dị ch là m chậ m sự
nhân lên củ a vi khuẩ n lao , gây hạ n chế sự lan trà n củ a vi khuẩ n lao , dẫ n tớ i
ph hy t bo vi khun . Đá p ứ ng miễ n d ch trong bnh lao pht sinh mt
phn ng qu mun . Mộ t số trườ ng hợ p vi khuẩ n lao có khả năng ứ c chế hoặ c
tiêu diệ t trở lạ i bạ ch cầ u ngườ i và tồ n tạ i dướ i dạ ng ngủ trong cá c u hạ t nên cơ
thể không tiêu diệ t đượ c . Đặc bit trong cá c trườ ng hợ p lao khá ng thuố c cơ
thể không tiêu diệ t đượ c vi khuẩ n và cá c thuố c cũ ng không tá c độ ng đượ c . Đó
l mt vn đ nan gi i trong điề u trị bệ nh lao [8].
Vi khuẩ n lao có thể và o cơ thể qua nhiề u đườ ng , thườ ng là qua đườ ng
hô hấ p, bên cạ nh đó là cá c đườ ng tiêu hó a , da, kế t mạ c mắ t... Sau khi gây tổ n
thương tiên phá t , vi khuẩ n lao có thể theo đườ ng bạ ch huyế t hoặ c đườ ng má u
tớ i cơ quan khá c gây tổ n thương thứ phá t .
Nhiề u cơ quan : phổ i, thậ n, mng no, xương, hch, da... đu c th b
vi khuẩ n lao xâm nhậ p , nhưng thườ ng bị hơn cả là phổ i và vị trí gặ p nhiề u

đoá n kiể u gen. Cc phương php chn đon kiu gen đu da trên cơ sở xc
đị nh độ t biế n ở cá c gen có liên quan khá ng thuố c tương ứ ng .
Để xá c đị nh độ t biế n trên gen katG hiệ n có nhiề u phương phá p , song
gii trnh gen vẫn l phương ph p cơ bả n, chnh xc, r rng nht . Tuy nhiên
đây là phương phá p không phả i nơi nà o cũ ng là m đượ c vì đò i hỏ i má y mó c
thiế t bị đắ t tiề n và nhân lự c có trì nh độ để vậ n hà nh khai thá c [28].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
13
Gii trnh t (DNA squencing ) l phương phá p xá c đị nh vị trí sắ p xế p
cc nucleotide trong phân tử DNA . Nguyên lý củ a phương phá p nà y là : Tổ ng
hợ p cá c mạ ch đơn DNA mớ i có độ dà i ngắ n hơn mạ ch khu ôn, nhờ kỹ thuậ t
đá nh dấ u và ngắ t đoạ n trong quá trì nh tổ ng h p mch DNA , thu đượ c cá c
mch đơn hơn ké m nhau mộ t base từ đó có đượ c sơ đồ trậ t tự mạ ch DNA
khuôn mẫ u. So sá nh trậ t tự củ a mẫ u thí nghiệ m vớ i trậ t tự DNA ch un ta bit
đượ c vị tr cc sai lch (độ t biế n) [33].
ng dụ ng cá c kỹ thuậ t sinh họ c phân tử đã xá c đị nh cá c chủ ng vi
khuẩ n lao khá ng isoniazid là do có độ t biế n ở gen katG. Codon xy ra độ t
biế n là codon 315 [34].
Sự độ t biế n xả y ra là do thay thế nucleotid e ở codon 315 (AGC  ACC
hoặ c AGC  ACA) [34].
Để giả i trì nh tự gen katG, hiệ n nay ngườ i ta có thể thự c hiệ n trự c tiế p
từ sả n phẩ m PCR . Khi sả n phẩ m PCR là đơn nhấ t và có độ di thch hp cho
việ c phân tí ch kế t quả thì có thể thự c hiệ n giả i trì nh tự trự c tiế p. Cng c th
gii trnh t thông qua tá ch dò ng , gắ n đoạ n gen katG cầ n nghiên cứ u và o
vector. Đoạ n gen cù ng vớ i vector tá i tổ hợ p đượ c nhân lên trong tế bà o E.coli.
Khi giả i trình tự gen , c đon gen katG v 1 phn vector đề u đượ c xá c đị nh
trnh t. Gii trnh t thông qua tch dng đượ c ứ ng dụ ng khi sả n phẩ m PCR
không đượ c tố t , đặ c biệ t l trong cc trườ ng hợ p gây độ t biế n nhân tạ o kiể m
chứ ng khá ng thuố c và trong nghiên cứ u biể u h iệ n gen [6].


1. H/c dù ng trong PCR
Tris base
Lysozyme
Proteinase K
Agarose
Thang chuẩ n DNA
EDTA
Taq-DNA-polymerase
2. H/c sinh phẩ m dù ng trong tá ch dò ng
Pepton
Yeast Extract
Nacl
Agar
Ampicilin
X-gal
IPTG
Accuprep plasmid Mini Extraction Kit
EcoRI
pBT
3. H/c phụ c vụ giả i trì nh tƣ̣ gene
Big Dye Terminator V3.1
HiDi Formamid
Ethanol tuyệ đố i

Applied BioSciences (Mỹ)
Fermentas (Mỹ)
Sigma (Mỹ)
Sigma (Mỹ)
Fermentas (Mỹ)
Fermentas (Mỹ)

0
C
L vi sng
T an ton sinh hc cp II Nuaire
Bể ổ n nhiệ t
My lắ c Gyromax 737R
My quang ph t ngoi kh bin Nano Drop
My phân tch trnh t DNA ABI 3100-
Avant
Sanyo (Nhậ t Bả n)
Applied BioSciences (Mỹ)
Bio-rad (Php)
Heraeus (Mỹ)
Thommas Scientific (Mỹ)
Dolphin (Mỹ)
Nuaire (Mỹ)
Sanyo (Nhậ t Bn)
Nuaire (Mỹ)
Memmert (Đc)
Amerex Instrument (Đc)
Analitika (Đc)
Applied BioSciences (Mỹ)

2.2.3. Cc mi dng trong nghiên cu
Cc mi đặ c hiệ u cho phá t hiệ n trự c khuẩ n lao và lao khá ng thuố c đượ c
sử dụ ng cho phả n ứ ng PCR n hân cá c đoạ n gen đí ch có trình tự tương ứ ng là :
- Cặ p mồ i dùng cho nhân trì nh tự gen katG:
KatG F: 5'-GAG CCC GAT GAG GTC TAT TG-3'
KatG R: 5'-ACA AGC TGA TCC ACC GAG AC-3'
- Cặ p mồ i dùng cho gii trnh t gen katG:

2.3.2.1. K thut nhân bả n đoạ n gen katG sử dụ ng mồ i đặ c hiệ u
Sơ đồ qui trì nh nhân bn đon gen KatG C th:
1. Sau khi đo nồ ng độ DNA khuô n, tnh v to cc nng đ DNA ca
cc mẫu như nha u để khi đưa và o hỗ n hợ p sả n phẩ m cùng mộ t thể tí ch DNA
khuôn, v đt khong 100 ng/thể tí ch 25µl phn ng.
2. Tnh cc gi tr ca cc thnh phn khc .
Đo nồ ng độ DNA củ a mẫ u
nghiên cƣ́ u
Tính ton gi tr cc thnh
phầ n phn ng PCR
To hn hp phn ng
Nhân gen theo chu trình
nhiệ t đã đƣợ c tố i ƣu hó a
Điệ n di kiể m tra vạ ch đặ c
hiệ u
Sƣ̉ dụ ng sả n phẩ m PCR là m
DNA chè n và o plasmid
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
19
Bng 2.4: Tính ton cc thnh phn cho phn ng PCR
Thnh phn phản ng PCR Thể tí ch (µl) Nồ ng độ
Nướ c 10,25
MgCl
2
(25 mM) 2,5 2 mM
PCR bufer (10X) 2,5 1 X
dNTP mix (5mM) 2,5 0,2 mM

56
0
C
45 giây
72
0
C
1 pht
72
0
C
4 pht
4
0
C
60 pht
35 chu kỳ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
20
2.3.2.2. K thut tách dng (cloning), tạo sn phm phc v gii trnh t gen
katG
Sơ đồ qui trì nh tá ch dò ng

Sau khi nhân bả n thà nh công đoạ n gen katG, chng tôi tin hnh lm
sch (thôi gel) bằ ng bộ kit QIAquick Gel Extraction . Trong quá trì nh thao tá c
trên đè n tím rấ t có thể bị đứ t gẫ y cá c nucleotide s gây nh hưởng k hông tố t
tớ i sả n phẩ m kế t nố i , v vy trước k hi thự c hiệ n phả n ứ ng kế t nố i chng tôi
tiế n hà nh thự c hiệ n phả n ứ ng nố i đầ u A . Thnh phn phn ng đưc trnh
by ở bng 2.5.
Tinh sạ ch và gắ n đoạ n gen và o vector tá ch

- Ly tâm 13000 vng/pht/4
0
C. Đ dch lỏng, thu cặ n bá m trên cộ t lc.
- Thêm 500 µl Washing buffer và o Eppendorf. Ly tâm 13000
vng/pht/4
0
C. Đ dch, thu cặ n bá m trên cộ t lc.
- Lặ p lạ i bướ c trên.
- Lm khô bng cch ly tâm thêm 1 lầ n nữ a.
- Thêm 15 µl nướ c deion và o. Đi trong vng 1 pht.
- Thu dị ch, loi bỏ ct lc.
Sau đó thự c hiệ n cá c bướ c sau:
1. To sn phm kt ni
Kế t nố i đoạ n gen katG cầ n nghiên cứ u vớ i vector pBT theo qui trì nh
ca nh sn xut.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
22
Qui trì nh:
- 2X Papid Ligation Buffer 1 µl
- T4 DNA Ligase 1 µl
- pBT Vector 1
- PCR product 5 µl
- Nướ c cấ t khử ion vừ a đủ 10 µl.
Sau đó sn phm đưc tiế n hà nh trên má y PCR ở 22
0
C trong vò ng 60 pht.
2. Biế n nạ p và nuôi cấ y tế bà o có vector tá i tổ hợ p
Biế n nạ p sả n phẩ m kế t nố i trên và o tế bà o khả biế n E.coli DH5α theo
phương phá p số c nhiệ t [15]. Nuôi cấ y tế bà o và kiể m tra sự có mặ t củ a vector
ti t hp trong t bo theo qui trnh sau :

KatG F v KatG R (chu trì nh nhiệ t như vớ i PCR nhân đoạ n gen katG).
- Tiế n hà nh điệ n di kiể m tra sả n phẩ m PCR , nế u mẫ u nà o có vạ ch
tương ứ ng vớ i đoạ n gen KatG th s dụng mẫu đ đ tch plasmid .
3. Tch chit plasmid (Sử dụ ng cá c hó a chấ t có tạ i phò ng Công nghệ tế
bo thc vt - Việ n CNSH).
Sử dụ ng kit QIAprep spin Miniprep (ca hng QIAGEN ) v quy trnh
ca nh sn xut đ tch chit plasmid . Đây là phương phá p tá ch chiế t
plasmid lượ ng nhỏ từ 1-1,5 ml khuẩ n lạ c E. coli.
- Ht 2 ml dị ch khuẩ n cho và o Eppendorf 2 ml.
- Ly tâm 8000 vng/2 pht ở 4
0
C thu khuẩ n.
- Thêm 100 µl sol I, vortex nhẹ cho tan cặ n.
- Thêm 200 µl sol II, đả o nhẹ Eppendorf.
- Thêm 150 µl sol III, đả o nhẹ Eppendorf cho dị ch chuyể n sang mà u
trắ ng. (Đả o ngay khi thêm hó a chấ t và o Eppendorf, trnh kt ta cục b).
- Ly tâm 13000 vng/10 pht/4
0
C. Ht 300 µl dịch, bỏ cặn.
- Thêm 1 lượ ng tương đương P CI 24:1 (24 phenol-chloroform -
isoamylalchohol). Lắ c mạ nh, ly tâm 13000 vng/10 pht/4
0
C. Thu pha trên.
- Thêm 1 lượ ng tương tương isopropanol . Lắ c đề u.
- Ly tâm 13000 vng/10 pht/4
0
C. Thu cặ n.
- Rử a cồ n. Ly tâm 13000 vng/5 pht/4
0
C.

- Kiể m tra kế t quả thu đượ c bằ ng phầ n mề m má y tính ABI 3130.
- Khai thá c dữ liệ u từ ngân hà ng gen , thiế t lậ p chủ n g chuẩ n wild type
đ so snh.
- Xử lý , phân tí ch cá c trnh t đon gen katG c kch thước khong 684
bp ca cc chng vi khun lao bng chương trnh phân tch chui BioEdit . So
snh đi chiu với cc d liu ở ngân hng gen đ c kt qu cc v tr đt
biế n củ a từ ng chủ ng nghiên cứ u.
Xử lý số liệ u theo phương phá p thố ng kê , sử dụ ng chương trì nh phân
tch sinh hc Star View v5.0 đ xc đnh cc mi liên quan khng thuc .
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
25
CHƢƠNG 3
KẾ T QUẢ NGHIÊN CƢ́ U V THO LUN

3.1. Kế t quả nhân bản gen katG các chủ ng vi khuẩ n lao nghiên cƣ́ u
Sử dụ ng cặ p mồ i katG F v katG R nhân bả n đoạ n gen katG bằ ng kỹ
thuậ t PCR. Sau khi có đượ c sả n phẩ m PCR , chng tôi tiế n hà nh kiể m tra đoạ n
gen đượ c nhân lên bằ ng phương phá p điệ n di trên agarose 1%. Kế t quả đượ c
thể hiệ n như trong ả nh 3.1 v 3.2.

Trích đoạn Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.col

---