B GIÁO DC VÀ ÀO TO VIN KHOA HC VÀ CÔNG NGH VIT NAM

VIN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VT


KHIU TH THÚY NGC
NGHIÊN CU S PHÂN B CA
MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS KIU GEN
BEIJING VÀ MI LIÊN QUAN N
TÍNH KHÁNG THUC LAO TI VIT NAM

LUN VN THC S SINH HC Hà Ni – 2010


.
Trc tiên tôi xin bày t lòng bit n chân thành và sâu sc nht ti
TS.BS. Nguyn Vn Hng, Trng khoa Vi sinh, Bnh vin Phi Trung ng,
ngi thy đã hng dn, ch bo tn tình cho tôi ngay t nhng bc đi đu
tiên và to mi điu kin thun li đ tôi hoàn thành khóa lun tt nghip
này.
Tôi xin chân thành cm n Ban lãnh đo Bnh vin, cán b viên chc
Khoa Vi sinh - Bnh vin Phi Trung ng đã giúp đ tôi trong quá trình hc
tp.
Tôi xin trân trng cm n các thy, cô giáo Trng i hc Thái
Nguyên, Vin Sinh thái và Tài nguyên Sinh vt và Vin Công ngh Sinh hc
đã hng dn và truyn th kin thc cho tôi trong thi gian hc tp, nghiên
cu.
Cui cùng tôi xin gi li cm n sâu sc ti nhng ngi thân trong gia
đình tôi, bn bè và đng nghip đã to điu ki
n, đng viên và giúp đ tôi trong
sut thi gian làm lun vn.
Tôi xin chân thành cm n tt c nhng s giúp đ quí báu đó./.
Hà ni, ngày 27 tháng 12 nm 2010
Hc viên Khiu Th Thúy Ngc Lun vn thc s sinh hc Khiu Th Thúy Ngc
DANH MC CÁC CH VIT TT


PCR Polymerase Chain Reaction - Phn ng chui Polymerase
RFLP Restriction Fragement Length Polymorphism – đa hình
chiu dài các đon ct bi enzym gii hn
RIF Rifampicin
SDS Sodium Dodecyl Sulphate
SM Streptomycin
Spoligotyping Spacer oligonucleotide typing – Trình t các đon
nucleotide đm
ST no Shared Type number – s th t kiu gen M.tuberculosis
thng nht trên th gii
TE Tris - EDTA
UPGMA Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean –
Phng pháp nhóm theo cp các giá tr trung bình s hc.
v/p Vòng/phút
VK Vi khu
n
WHO World Health Organization – T chc Y t th gii
Lun vn thc s sinh hc Khiu Th Thúy Ngc
DANH MC CÁC BNG
Bng Tên bng Trang
Bng 1 Bnh nhân lao và t l t vong do lao ti các châu lc 10
Bng 2 Thành phn phn ng PCR nhân gen vùng DR ca VK lao 34
Bng 3 Các kiu gen M.tuberculosis đc phân loi bng k thut
Bng 12 M.tuberculosis kiu gen Beijing và tính kháng thuc bt kì trong
nhóm bnh nhân lao phi AFB (+) mi.
50
Bng 13 M.tuberculosis kiu gen Beijing và tính kháng đa thuc trong
nhóm bnh nhân lao phi AFB (+) mi
51
Bng 14 M.tuberculosis kiu gen Beijing và tính kháng thuc bt kì trong
nhóm bnh nhân lao phi AFB (+) đã điu tr.
51
Bng 15 M.tuberculosis kiu gen Beijing và tính kháng đa thuc trong
nhóm bnh nhân lao phi AFB (+) đã điu tr.
52
Bng 16 T l bnh nhân mc M.tuberculosis kiu gen Beijing ti các
vùng khác nhau trên th gii
55
Bng 17 M.tuberculosis kiu gen Beijing và mi liên quan đn tính kháng
thuc lao ti mt s nc trên th gii.
63

Lun vn thc s sinh hc Khiu Th Thúy Ngc
DANH MC CÁC HÌNH
Hình Tên hình Trang

ni thc hin k thut spoligotyping phân loi M.tuberculosis
38
Hình 19 Kt qu phim spoligotyping ca M.tuberculosis 39
Hình 20 Cây phân loi trình t đm ca M.tuberculosis đc nhóm
bng phng pháp UPGMA
42
Hình 21 T l các nhóm kiu gen
M.tuberculosis 43
Hình 22 Phân b M.tuberculosis kiu gen Beijing ti Vit Nam 45
Hình 23 Phân b M.tuberculosis kiu gen Beijing phân lp t bnh nhân
lao phi AFB (+) mi theo nhóm tui
46
Hình 24 Phân b M.tuberculosis kiu gen Beijing phân lp t bnh nhân
lao phi AFB (+) đã điu tr theo nhóm tui
48
Hình 25 Phân b M.tuberculosis kiu gen Beijing phân lp t c hai
nhóm bnh nhân lao phi AFB (+) theo nhóm tui
49
Hình 26 T l phân b và mi liên quan đn tính kháng thuc lao ca
M.tuberculosis kiu gen Beijing trên th
 gii.

64

Lun vn thc s sinh hc Khiu Th Thúy Ngc
Lun vn thc s sinh hc Khiu Th Thúy Ngc
CHNG II: VT LIU VÀ PHNG PHÁP NGHIÊN CU 29

2.1. VT LIU 29
2.1.1. i tng, thi gian và đa đim nghiên cu 29
2.1.2. Hóa cht và trang thit b 30
2.2. PHNG PHÁP NGHIÊN CU 31
2.2.1. Ni dung nghiên cu 31
2.2.2. Phng pháp Spoligotyping - spacer oligonucleotide typing 33
ni thc hin k thut spoligotyping phân loi M.tuberculosis 38
2.2.4. X lý và phân tích s liu 38
CHNG III: KT QU NGHIÊN CU 39
3.1. PHÂN B CÁC KIU GEN CA M.TUBERCULOSIS 39
3.1.1. Các kiu gen ca M.tuberculosis đc phân loi bng k thut
Spoligotyping 39
3.1.2. Kt qu ch s phân loi ca phng pháp Spoligotyping 44
3.2. PHÂN B M.TUBERCULOSIS KIU GEN BEIJING THEO MIN
A LÝ, NHÓM TUI VÀ GII TÍNH. 44
3.2.1. Phân b M.tuberculosis kiu gen Beijing trên toàn quc 44
3.2.2. T l M.tuberculosis kiu gen Beijing phân lp t bnh nhân lao phi
AFB (+) mi theo nhóm tui và gii tính. 46
3.2.3. T l M.tuberculosis kiu gen Beijing phân lp t bnh nhân lao phi
AFB (+) đã điu tr theo nhóm tui và gii tính. 47
3.2.4. T l M.tuberculosis kiu gen Beijing phân lp t c hai nhóm bnh
nhân lao phi AFB (+) theo nhóm tui và gii tính. 49
3.3. MI LIÊN QUAN GIA M.TUBERCULOSIS KIU GEN BEIJING
VÀ TÍNH KHÁNG THUC LAO 50

tr 64
KT LUN 68
KIN NGH 69
CÁC BÁO CÁO KHOA HC Ã CÔNG B
TÀI LIU THAM KHO
PH LC
Lun vn thc s sinh hc Khiu Th Thúy Ngc 1

T VN 
Bnh lao đã đc bit đn t rt lâu, tn ti cùng vi loài ngi. Mc dù
con ngi đã n lc kim soát và khng ch bnh lao nhng hin nay t l
mc lao vn không ngng gia tng, hàng nm vn có khong 9,4 triu ngi
mc lao mi (trong đó 3,3 triu ngi là ph n), 1,7 triu ngi t vong do
cn bnh này trên toàn cu, tng đng 4700 ng
i cht mi ngày [70].
Bnh lao tác đng nhiu đn sc khe con ngi, đng thi cng là rào cn,
là thách thc đi vi phát trin kinh t và xã hi  mi quc gia trên th gii.
S xut hin và lan truyn ca các chng vi khun lao kháng đa thuc - MDR
TB (tc là kháng đng thi vi c hai thuc isoniazid (INH) và rifarmpicin
(RIF) trong thi gian gn đây đã tr thành mt vn đ đc bit nghiêm trng.
Theo c tính ca T chc Y t Th gii (WHO 2010), 3,3% các trng hp
lao mi là MDR-TB vi t l t vong lên ti 150.000 ngi vào nm 2008.
T l lao kháng đa thuc t 0% đn 28% trong s các bnh nhân lao mi và t
0% đn 61,6% trong s các bnh nhân lao đã điu tr [67].

M.tuberculosis kiu gen Beijing trên toàn quc.
Xut phát t nhng hiu bit trên chúng tôi thc hin đ tài nghiên cu
vi mc tiêu:
1. Xác đnh s phân b ca Mycobacterium tuberculosis kiu gen
Beijing ti Vit Nam.
2. Tìm hiu mi liên quan ca ch
ng vi khun này vi tính kháng
thuc lao ti Vit Nam.
Lun vn thc s sinh hc Khiu Th Thúy Ngc 3

CHNG 1: TNG QUAN TÀI LIU
1.1. I CNG V BNH LAO
1.1.1. Lch s bnh lao
Bnh lao là mt bnh truyn nhim, d lây lan trong cng đng. Bnh có
th xâm nhp vào mi c quan ca c th nhng ch yu là  phi. Bnh lao
xut hin t trc công nguyên  n đ, Ai cp và các nc vùng Trung Á.
Thi kì đó ngi ta cha bit rõ nên hay nhm lao vi các bnh khác, nh
t là
các bnh phi.
Nm 1865 Villemin tiêm truyn bnh phm lao cho súc vt thy các các
con vt này cng mc lao. Nh vy Villemin là ngi đu tiên đã chng minh

M.tuberculosis, M. africanum, M.carnetti, M. Bovis và M. microti thành 5 loài
riêng bit. Tuy nhiên khi phân tích v cu trúc kháng nguyên, s đng nht
DNA và có chung mt kiu acid mycolic
cho thy c 5 loài trên đc tin hóa
t mt loài duy nht và gn đây đc đt mt thut ng chung là
M.tuberculosis complex. ây là nhóm gây bnh quan trng nht trong ging
Mycobacterium. Trong đ
ó M.bovis có th lây truyn t bò sang ngi do
dùng sa bò mc lao cha tit khun. M.microti phân lp t chut đng, có Lun vn thc s sinh hc Khiu Th Thúy Ngc 5

đc lc rt thp đi vi chut lang và ngi. M.africanum hay xut hin 
châu Phi và thng có kháng vi Thioacetazone. M.canettii là mt loài mi
đc b sung t nm 1997, gây bnh  ch yu  chut đng. Ngoài ra, còn
có nhóm vi khun khác nh M.kansasii, M.fortuitum và M.avium complex
cng gây bnh lao  ngi b suy gim min dch, đc bit là các trng hp
có HIV (+)
[62].
Vi khun lao có dng hình que, thân mnh d, không có nha bào, kích
thc 2-3 µm, dày 0,3 µm. Khi đc nhum bng phng pháp Zield –
Neelsen vi khun lao bt màu đ thm do không b cn và acid làm mt màu
carbonfucshin.  môi trng nuôi cy có đm đ acid nht đnh vi khun lao
vn phát trin đc, vì vy chúng đc gi là trc khun kháng cn, kháng
toan (acid fast bacilli – AFB) [4].



Hình 3. Cu to thành t bào ca M. tuberculosis [52]
i vi các vi khun phát trin bên trong t bào, ngoài 3 lp nêu trên còn
có lp peptidoglycolipid ph ngoài cùng vi khun. Nó có tác dng tng cng
thêm kh nng t bo v ca vi khun lao, giúp vi khun chng li đc các
enzym hy dit tit ra t các tiu th (lysosome) ca t bào. Lun vn thc s sinh hc Khiu Th Thúy Ngc 7

Cu trúc khá hoàn ho trên đây ca thành t bào vi khun lao giúp vi
khun này chng li đc các yu t tác đng ca môi trng bên ngoài nh
acid và các cht kim  mt nng đ nht đnh.
Trong điu kin t nhiên vi khun lao có th tn ti 3-4 tháng. Trong
phòng thí nghim ngi ta có th lu gi và bo qun chúng trong nhiu nm.
1.1.3. C ch gây bnh lao
Vi khun lao thng xâm nhp theo đng hô hp qua các git nc bt
và gây nên lao phi (90% tng s lao). Chúng cng có th xâm nhp vào
đng tiêu hóa (qua sa bò ti) và gây nên lao d dày, rut [9].
T các c quan b lao ban đu (phi, đng rut ), vi khun lao theo
đng máu và bch huyt đn tt c các c quan và gây lao  các b phn
khác nhau ca c th (lao hch, lao màng não, lao thn, lao xng, lao kê ).

Hình 4. Vi khun lao có th xâm nhp vào mi c quan ca c th [32]
C ch bnh sinh ca bnh lao hin nay cha rõ hoàn toàn. Vi khun này
không có ni và ngoi đc t. Mt trong nhng yu t đc lc quan trng ca
vi khun lao là yu t si (cord factor) và lp sáp  vách t bào vi khun. Các

1.1.6. Tình hình bnh lao trên Th gii
Th gii đã tìm ra nhiu loi thuc kháng sinh điu tr bnh lao, nhng
hin nay bnh lao vn là m
t đi dch  các nc đang phát trin. c bit vi
s bùng n ca đi dch HIV/AIDS và s xut hin ca bnh lao kháng đa
thuc đã gây nhiu khó khn trong vic ngn chn và thanh toán bnh lao. Vì Lun vn thc s sinh hc Khiu Th Thúy Ngc 9

vy, nm 1993, T chc Y t th gii (WHO) đã công b tình trng khn cp
v bnh lao trên toàn cu.
Theo báo cáo ca WHO v tình hình bnh lao đc công b vào nm
2010 [66], th gii có khong 9,4 triu ngi mc lao mi (trong đó có 7,5
triu ngi  khu vc châu Á và cn Sahara châu Phi). Khong 1,7 triu
ngi cht vì bnh lao trong nm 2009 tng đng vi 4.700 ca t vong mt
ngày, 95% s bnh nhân lao và 98 % s ngoi cht do lao  các nc có thu
nhp va và thp, 75% s bnh nhân lao c nam và n  đ tui lao đng,
80% s bnh nhân lao toàn cu thuc 22 nc có gánh nng bnh lao cao.

Hình 5. Tình hình bnh lao trên th gii (WHO 2010)[69]
T l mc bnh lao trên 100.000 dân ti Malaysia là 103, 178 ti Vit
Nam, 245 ti Indonesia và 293 ti Philippines. S lng ngi mc lao gim
xung  5 trong 6 khu vc do WHO phân chia nhng vn tng  khu vc
châu Phi, ni mà đi dch HIV/AIDS đang bùng phát mnh [69] .
S lng
(nghìn)
T l /
100.000
Châu Phi 2800 (30%) 340 430 450
Châu M 270 (2.9%) 29 20 2,1
Trung đông 660 (7.1%) 110 99 18
Châu Âu 420 (4.5%) 47 62 7
ông Nam Á 3300 (35%) 180 480 27
Tây Thái Bình Dng 1900 (21%) 110 240 13
Toàn cu 9400 140 1300 19 Lun vn thc s sinh hc Khiu Th Thúy Ngc 11 Theo báo cáo ca TCYTTG khu vc Tây Thái Bình Dng, nm 2007
tính trên toàn khu vc, t l lao kháng đa thuc trong nhóm bnh nhân lao
mi là 4% (409/10.231) và kháng đa thuc trong nhóm bnh nhân lao đã điu
tr là 29% (468/1596). Trong nhóm bnh nhân lao mi, t l kháng đa thuc
dao đng t 0% ti Campuchia đn 11,1% ti qun đo Bc Mariana. Nhóm
bnh nhân lao phi đã điu tr, t l MDR-TB t 3,1% ti Campuchia đn
27,5% ti Mông c. Nm nc có gánh nng lao cao nht khu vc này là
Campuchia, Trung Quc, Mông c, Philippin và Vit Nam [61].
Nm 2009, t chc Y t Th gii báo cáo t l điu tr bnh lao thành
công là 84%, gn đt đn mc tiêu đ ra trc đó là 85%, nhng t l phát
hin ch đt 60% s bnh nhân c tính [71]. Nhng ngi mc bnh lao

65% là lao phi AFB (+), tp trung ch yu  khu vc đông dân c và các
thành ph ln [10].

Hình 6. Tình hình bnh lao ti Vit Nam [71]
T nm 1996 – 1997, Vit Nam tham gia vào d án nghiên cu tình hình
kháng thuc lao trên toàn cu ca TCYTTG, kt qu cho thy t l kháng
thuc chung ca bnh nhân lao mi khá cao (32,5%), trong đó kháng vi
streptomycin (SM) chim 24,1%; izoniazid (INH) là 20%; rifampicin (RIF)
là 3,6%; ethambutol (EMB) là 1,1%; kháng đa thuc (2,3%). Kt qu điu tra Lun vn thc s sinh hc Khiu Th Thúy Ngc 13

kháng thuc toàn quc ln ba vào nm 2005 cho thy t l kháng thuc chung
là 30,9%, kháng đa thuc là 2,7 %. Trong nhóm bnh nhân lao mi, t l
kháng thuc chung là 34%, kháng đa thuc là 4,6 %. Trong nhóm bnh nhân
lao đã điu tr, t l kháng thuc chung là 58,9%, kháng đa thuc là 19,
3% [38].
1.2. TÍNH KHÁNG THUC CA VI KHUN LAO
1.2.1.
nh ngha và phân loi
Kháng thuc là hin tng gim đ nhy ca vi khun lao vi thuc điu
tr lao in vitro khi cho chng vi khun kim tra tip xúc  nng đ hp lý ca
thuc lao th nghim so sánh vi chng hoang di đi chng [33].
 Phân loi theo tính cht kháng thuc ca VK lao
- Kháng mt loi thuc (mono-drug resistance): VK lao kháng vi mt
loi thuc chng lao hàng m