1
GIỚI THIỆU LUẬN ÁN
1. Lý do chọn đề tài:
Theo WHO ước tính, mỗi năm Việt Nam cần khoảng 1,7 triệu đơn vị máu phục vụ cấp cứu điều trị (≈ 2%
dân số) [40]; ngoài máu và các chế phẩm máu, chế phẩm huyết tương, còn phải kể đến các chế phẩm huyết
thanh như: gamma globulin, anti-HBs globulin, anti-T lymphocyte globulin, antivenom [141],[147],[152]
trong đó, huyết thanh kháng nọc rắn (antivenom) là loại chế phẩm rất quan trọng, đặc biệt trong điều trị rối
loạn đông cầm máu do nhiễm độc nọc rắn (họ Vipridae).
Là nước nhiệt đới, với ¾ diện tích rừng núi và đất nông nghiệp, bờ biển dài hơn 3000 km, Việt Nam có
môi trường rất thuận lợi cho rắn độc phát triển. Phần lớn cư dân sinh sống, làm việc trong môi trường nông
nghiệp, rừng núi, hải đảo nguy cơ bị rắn độc cắn rất cao (> 30.000 người /năm [21]); ngoài tổn thất nhân
mạng, chi phí điều trị rất tốn kém: nhiều nạn nhân phải thở máy hàng tháng hoặc phải truyền hàng chục lít
máu và huyết tương để cứu tính mạng; kỷ lục, đầu tháng 6/2013, bệnh viện Bạch Mai đã phải truyền ≈ 46 lít
máu và chế phẩm để cứu một người bệnh [174].
Nhằm giảm thiểu tỷ lệ tử vong, giảm số lượng máu và huyết tương phải sử dụng trong điều trị rắn độc
cắn, Bộ y tế đã quan tâm chỉ đạo việc nghiên cứu, ứng dụng sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn (HTKNR)
[6],[8]. Đến nay, đã có một số nghiên cứu rất thành công, góp phần cứu sống hàng ngàn bệnh nhân, giảm
2
mạnh lượng máu và chế phẩm phải sử dụng [6],[21],[23]
Tuy vậy, sau nhiều năm nỗ lực, đến nay chúng ta vẫn đang thiếu trầm trọng nhiều loại HTKNR; hầu như
ta chỉ có duy nhất hai loại HTKNR cho rắn hổ đất và rắn lục tre [8],[165],[166],[171]. Do tính đặc hiệu
kháng nguyên nọc rắn theo vùng địa lý, mỗi quốc gia phải tự chế tạo HTKNR cho chính quốc gia mình
(khuyến cáo của WHO) [141],[20],[6]. Để đáp ứng nhu cầu cấp cứu, điều trị rắn độc cắn, chúng ta rất cần
đẩy mạnh nghiên cứu, sản xuất HTKNR; đặc biệt là các HTKNR cho các loài rắn độc nguy hiểm, thường
gặp; trong các loài đó, hàng đầu phải kể đến rắn cạp nia, chiếm 35,8% các loài rắn độc họ rắn hổ (Elapidae)
tại Việt Nam, là loài rắn độc có độc tính cực mạnh, gây tử vong rất cao (> 80% nếu không được cấp cứu điều
trị kịp thời) [14].
Thực tế điều trị rắn cạp nia cắn ở Việt Nam từ trước đến nay cho thấy: nước ta có hai loài rắn cạp nia
thường gặp, chủ yếu là rắn cạp nia nam (Bungrarus candidus) và rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus).
Đây là hai loài rắn có hình dạng “khúc đen, khúc trắng” rất giống nhau, thoáng nhìn rất khó phân biệt. Hai
loài rắn này khác nhau cả về độc tính nọc và biểu hiện lâm sàng, chẩn đoán rất dễ nhầm lẫn, HTKNR đơn

- Chương 4: Bàn luận (37 trang).
- Kết luận & Kiến nghị: 2 trang
Luận án có: 29 bảng, 4 biểu đồ và sơ đồ, 63 ảnh và hình vẽ (48 ảnh phụ lục), 175 tài liệu tham khảo (40
Tiếng Việt, 114 Tiếng Anh, 21 website), 4 phụ lục.
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.Máu và huyết tương:
1.2. Các loại chế phẩm máu và chế phẩm huyết tương:
5
1.3. Phương pháp tách chiết các thành phần huyết tương:
1.3.1. Phương pháp tủa lạnh bằng ethanol.
1.3.2. Phương pháp tủa bằng muối
1.3.3. Phương pháp sắc ký
1.3.4. Phương pháp miễn dịch hấp thụ.
1.3.5. Phương pháp lọc qua màng ma trận với các chất rắn.
1.4. Huyết thanh kháng nọc rắn:
1.4.1. Khái niệm
1.4.2. Lịch sử phát minh
1.4.3. Cơ sở miễn dịch học
- Kháng nguyên nọc rắn.
- Kháng thể chống nọc rắn
1.4.4. Các giai đoạn của quy trình sản xuất HTKNR
1.5. Tai nạn do RCN và tình hình NC sản xuất HTKN-RCN
1.5.1. Tình hình tai nạn do RCN tại Việt Nam
1.5.2. Chi rắn cạp nia (Bungarus) tại Việt Nam
6
1.5.3. Đặc điểm nọc rắn cạp nia và cơ chế bệnh sinh
1.5.4. Tình hình NC, sản xuất HTKN-RCN ở Việt Nam & Thế giới.
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG & PHƯƠNG PHÁP
2.1. Đối tượng & vật liệu nghiên cứu:
- Đối tượng NC: Nghiên cứu trên các động vật thí nghiệm: rắn cạp nia bắc và rắn cạp nia nam, ngựa, thỏ,

9 Albumin ≤ 1 %
10 Globulin > 90%
2.2.3. Nội dung nghiên cứu:
2.2.3.1. Nghiên cứu sản xuất HTKN-RCN đa giá F(ab’)2
- Chế tạo KN nọc rắn cạp nia đa giá giảm độc lực.
8
- Gây mẫn cảm ngựa, theo dõi hình thành KT đặc hiệu.
- Lấy máu, thu huyết tương, truyền trả khối hồng cầu.
- Tinh chế HTKN-RCN đa giá F(ab’)2, xác định mức độ tinh sạch của sản phẩm.
2.2.3.2. Đánh giá chất lượng HTKN-RCN trong phòng thí nghiệm:
- Kiểm định cơ sở, đánh giá tính an toàn và hiệu lực của chế phẩm.
- Kiểm định quốc gia, đánh giá an toàn, hiệu lực, đặc điểm lý hóa.
- Sơ bộ tính giá thành sản xuất, đánh giá hiệu quả kinh tế, xã hội.
2.2.4. Các phương pháp kỹ thuật nghiên cứu:
- Tuyển chọn RCN, lấy nọc, bảo quản nọc theo phương pháp của Trần Kiên, David Warell [21],[23],[24].
- Chế tạo KN và đánh giá chất lượng theo phương pháp của Trịnh Xuân Kiếm, khuyến cáo của WHO, 2008
[151] & Dược điển VN.
- Gây mẫn cảm ngựa, theo dõi hình thành KT đặc hiệu bằng thử nghiệm Ouchterlony và điện di miễn dịch
huyết thanh với nọc RCN.
- Lấy huyết tương theo phương pháp plasmaferesis.
- Tinh chế HTKN-RCN đa giá F(ab')
2
theo phương pháp cắt Fc của γ- globulin bằng pepsin, tủa phân đoạn
với ammonium sulphate, thẩm tích với nước cất, lọc Seize (WHO, 2008 [151]).
9
- Kiểm định cơ sở: đánh giá bằng thử nghiệm an toàn chung, chí nhiệt tố, cấy khuẩn, cấy nấm, xác định
LD50 và hiệu giá (ED50).
- Sau khi đạt chất lượng ở kiểm định cơ sở, đóng lọ vô khuẩn 5ml/lọ và yêu cầu Kiểm định Quốc gia.
- Kiểm định cơ sở gồm: thử nghiệm an toàn chung (Safety test), thử nghiệm chất gây sốt (Pyrogens test), thử
nghiệm vô khuẩn (Sterility test), thử nghiệm công hiệu (Potency test). Thử công hiệu gồm 2 bước: xác định

(gam)
SLNTB
Lần 1(114) 84 0,5 5,9 30 0,3 10
Lần 2 (185) 130 0,6 4,6 55 0,5 9,0
Lần 3 (122) 62 0,5 8,0 60 0,7 11,6
Cộng (421) 276 1,6 5,79 145 1,5 10,3
* Chú thích: SLNTB:số lượng nọc trung bình của một con rắn/lần lấy nọc
Bảng 3.2: Đánh giá sơ bộ về mức độ thường gặp của chi RCN ở VN
Loài rắn
Vùng
Bungarus
fasciatus
Bungarus
candidus
Bungarus
multicinctu
s
Bungarus
slowinskii
Bungarus
flaviceps
Miền Bắc (++) (-) (+++) (+) (-)
Miền Nam (+) (+++) (-) (-) (-)
* Chú thích: Không gặp: (-); Gặp nhưng số lượng rất ít: (+)
11
Thường gặp, số lượng ít: (++); thường gặp, số lượng nhiều: (+++)
Bảng 3.3: Thể tích KN và lượng nọc được khử độc.
Loại lọ
Thể tích KN / lọ (ml)
0,1 0,3 0,5 1 2 3 4 5 6

SL nọc
(mg)
Nhiệt độ trước/sau tiêm
KN(
o
C)
Thay đổi
nhiệt độ
cao nhất
12
Khởi
đầu
Sau 1
giờ
Sau
2 giờ
Sau 3
giờ
1 2,1 2,1 23,1 38,5 38,9 39,0 38,5 0,5
o
C
2
2, 3 2,3 25,3 39,1 39,8 39,2 39,1 0,7
o
C
3
2,2 2,2 24,2 39,3 39,5 39,8 39,3 0,5
o
C
Bảng 3.6. Kết quả cấy khuẩn, cấy nấm KN.

Lần
miễn
dịch
Ngựa 1 Ngựa 2
Toàn thân
Tại chỗ
Toàn thân
Tại chỗ
Vận
động
Hô hấp
Tiêu hóa
Vận
động
Hô hấp Tiêu hóa
1 Yếu
BT
Bỏ ăn Loét Yếu
BT
Bỏ ăn Loét
2 Yếu
BT
Bỏ ăn Loét Yếu
BT
Bỏ ăn Loét
3 Yếu
BT
Ăn kém Loét Yếu
BT
Ăn kém Loét

dịch
Lần
1
Lần 2 Lần 3
Lần
4
Lần
5
Lần
6
Lần
7
Lần
8
Lần
9
N
o
1 1/8 1/16 1/32
1/64
1/128 1/256 1/512 1/2048 1/2048
N
o
2 1/8 1/32 1/64
1/128
1/256 1/512 1/1024 1/2048 1/2048

Ảnh 3.4. Vết tủa KN-KT trên thạch agarose 1,5% (ảnh trái)
Ảnh 3.5. Xác định KT đặc hiệu bằng điện di miễn dịch.
3.1.3. Lấy máu, tách huyết tương giàu KT, truyền trả khối HC:

X X X
3.1.4. Kết quả tinh chế HTKN-RCN đa giá F(ab’)2:
3.1.4.1. Cắt Fc, tủa phần protein không có KT với ammonium sulphate 14%, lọc bỏ tủa, thu dịch lọc
16
chứa nhiều mảnh F(ab’)2:
Bảng 3.12: Thể tích dịch lọc có F(ab’)2 thu được.
Chỉ số NC
Lô NC
Huyết tương
Sản xuất (ml)
Dịch lọc có
KT (ml)
Tỷ lệ dịch lọc/
huyết tương sx (%)
Lô 1 3600 2900 80,6%
Lô 2 6400 5140 80,3%
Cộng : 10.000 8040
80,4%
3.1.4.2. Tủa F(ab’)2 với ammonium sulphate 22%, lọc thu tủa, thẩm tích và lọc vô trùng tạo HTKN-RCN
F(ab’)2.
Bảng 3.13 : Lượng tủa có F (ab’)2 thu được.
Chỉ số NC
Lô NC
Dịch lọc có F(ab’)2
(ml)
Tủa có F (ab’)2
(gam)
Lô 1 2900 210
Lô 2 5140 395
∑ 2 lần tinh chế 8040 605

18
Protein (g/l) 87,1 49,8 100 %
Albumin (g/l) 28,7 1,4 2,8 %
Globulin (g/l) 58,4 48,4 100%
97,2
%
IgG (mg/dl) 865 203
2,141 g/l
≈ 4,4%
IgM (mg/dl) 67,8 8,6
IgA (mg/dl) 6,3 2,5
Tỷ lệ A/G 0,49 0,03

Hình 3.6. So sánh hình ảnh điện di protein huyết thanh ngựa (trái) và điện di protein huyết thanh HTKN-
19
RCN F(ab’)2 (phải):
(Hình ảnh hai đỉnh rõ rệt của albumin, globulin đã không còn trên điện di HTKN-RCN, chỉ còn lại hình ảnh thuần nhất
một đỉnh tương ứng với dải phân bố albumin - trong khi định lượng albumin chỉ còn một lượng nhỏ 2,8%. Điều này
cho thấy F(ab’)2 chiếm tỷ lệ cao gần như tuyệt đối).
3.2. ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG CHẾ PHẨM HTKN-RCN ĐA GIÁ F(ab’)2 TRONG PHÒNG THÍ
NGHIỆM:
3.2.1. Kiểm định chất lượng tại cơ sở:
Bảng 3.18: Thử nghiệm an toàn trên chuột lang.
TT
Trọng
lượng
(gam)
HTKN
(ml)
Theo dõi chuột thí nghiệm

Bảng 3.20: Kiểm tra mức độ vô khuẩn của HTKN-RCN.
Lô
HTKN-
RCN
Môi trường Sabouraud
Môi trường
Thioglycolate
Ngày
3
Ngày
7
Ngày
14
Ngày
3
Ngày
5
Ngày
7
Lô I
Âm
tính
Âm
tính
Âm
tính
Âm
tính
Âm
tính

2 15,00 3,00 7 1 8 87,50
3 10,00 2,00 4 4 8 50,00
4 6,66 1,33 1 7 8 12,50
5 4,44 0,88 0 8 8 0,00
6 0 0 0 8 8 0,00
Bảng 3.22: Xác định Hiệu lực (công hiệu) của HTKN rắn cạp nia.
Lô
HTKN
-RCN
(ml)
Đệm
BPS
Nọc RCN
40 LD50
(ml)
Số
LD50/
chuột
Tình trạng
chuột NC
Chết Sống +
1 0.000 2.000 0.000 0 0 8 8
2 0.000 1.000 1.000 4 8 0 8
3 0.060 0.940 1.000 4 6 2 8
4 0.070 0.930 1.000 4 4 4 8
22
5 0.080 0.920 1.000 4 0 8 8
3.2.2. Kết quả kiểm định quốc gia về chất lượng HTKN-RCN:
Bảng 3.23: Kết quả Kiểm định Quốc gia về chất lượng HTKN-RCN
TT Tên thử nghiệm Kết quả

khuẩn, không có chất gây sốt khi gây mẫn cảm cho động vật thí nghiệm. Với loại độc tố có độc lực rất mạnh
24
với sinap thần kinh – cơ như nọc RCN, chế tạo KN để gây mẫn cảm nếu không đảm bảo, sẽ gây chết động
vật. Khử độc tính nọc rắn, chỉ giữ lại tính KN độc tố là mục đích của chế tạo KN. Quá trình khử độc với
glutheraldehyde, các vi khuẩn đã bị tiêu diệt một phần lớn; những vi khuẩn, vi nấm bị loại bỏ bằng lọc qua
màng lọc Ø 0,2 µm. Trong quá trình chế tạo KN (lấy nọc, khử độc nọc, tiến hành ly tâm, bỏ cặn, thu dung
dịch KN, lọc vô trùng, chiết vào các lọ nhỏ, đóng nắp lọ, ), yêu cầu vô khuẩn, loại trừ chất gây sốt đã được
tuân thủ nghiêm túc (bảng 3.5, 3.6).
4.1.2. Quy trình gây mẫn cảm ngựa, theo dõi đáp ứng miễn dịch:
- Lịch trình miễn dịch ngựa, liều lượng KN và tá dược:
Cách 1 tháng/lần là khoảng thời gian bảo đảm an toàn cho ngựa sau miễn dịch (liền vết loét, mệt, yếu, )
đồng thời là khoảng thời gian cần thiết cho quá trình đáp ứng miễn dịch xảy ra (theo WHO, cần từ 3-8 tuần).
Liều KN gây mẫn cảm tăng dần, kết hợp với tá dược Freund gây kích thích đáp ứng miễn dịch thứ phát của
hệ miễn dịch ngựa. Tá dược Freund được sử dụng gồm 1 trong 2 loại: CFA hoặc IFA. Đây là một huyền dịch
KN được nhũ hóa (emulsify) trong dầu khoáng, để tăng cường độ đáp ứng miễn dịch (immunopotentiator).
Nhiều tác giả đã sử dụng phương pháp kết hợp KN và CFA để tăng mạnh hiệu giá KT cho thấy hiệu quả rất
rõ rệt. Pratanaphon R. và cộng sự (1997), đã trộn lẫn KN nọc rắn hổ đất Thái Lan và với các tá dược khác
nhau như: CFA đơn thuần (50% CFA + 50% KN), CFA với tỷ lệ 25% (75% KN và 25% CFA), KN + vắc xin
25
nội độc tố uốn ván (tetanus toxoid), KN + vắc xin nội độc tố bạch hầu (diphtheria toxoid ) với tỷ lệ khác
nhau, đã thu được kết quả tốt, hiệu giá KT tăng cao mạnh mẽ trong thời gian ngắn so với nhóm chứng chỉ
dùng KN và tá dược là bentonite gel.
- Theo dõi sức khỏe ngựa sau mỗi lần miễn dịch: Tiêm KN và tá dược CFA lần thứ nhất ở cả 2 ngựa đều
thấy ngựa mệt mỏi, bỏ ăn, yếu bại, nằm tại chỗ hoặc lười vận động; tại chỗ tiêm bình thường. Lần tiêm thứ 2
và 3 nhắc lại sau 1 tháng, thấy ngựa bỏ ăn hoặc ăn kém, tại chỗ tiêm xuất hiện vết loét, đường kính 3-7 cm.
Những lần tiêm với tá dược IFA, không xảy ra loét chỗ tiêm; biểu hiện toàn thân bình thường, ngựa vẫn đi
lại, ăn uống tốt, dáng điệu khỏe mạnh. Hiện tượng loét da xảy ra sau miễn dịch ngựa bằng tá dược CFA lần
thứ 2,3 nhưng không loét ở những lần gây mẫn cảm với tá dược IFA (bảng 3.8) (có thể do CFA có BCG
chết?). Theo WHO, chỉ tiêm một lần CFA và hạn chế tiêm tại một điểm số lượng lớn KN + tá dược, tuy
nhiên nhóm nghiên cứu đã không tuân thủ điều này; ngựa vẫn sống và đáp ứng miễn dịch xảy ra bình